Her præsenterer vi en histologisk metode til optagelse, mærkning, optisk clearing, og billeddannelse den intakte hjerne vævsgrænseflade omkring kronisk implanterede microdevices i hjernevæv hos gnavere. Resultater fra de teknikker, der omfatter denne fremgangsmåde er nyttig til forståelse af virkningen af forskellige gennemtrængende hjerne-implantater på det omgivende væv.
Forskning i design og anvendelse af hjerne-implanterede microdevices, såsom mikroelektrode arrays, har til formål at producere klinisk relevante enheder, som interface kronisk med omgivende hjernevæv. Væv, der omgiver disse implantater menes at reagere på tilstedeværelsen af enhederne over tid, som omfatter dannelsen af et isolerende "glial ar" omkring enhederne. Imidlertid er histologisk analyse af disse væv ændringer typisk udført efter eksplantation indretningen, i en proces, der kan forstyrre morfologien af vævet af interesse.
Her viser vi en protokol, hvor kortikale-implanterede enheder samles intakt i omkringliggende hjernevæv hos gnavere. Vi beskriver hvordan, når perfunderet med fiksativ er hjerner fjernet og skåret på en sådan måde, at eksplanteres enheder. Vi skitserer fluorescerende antistof mærkning og optiske clearing metoder er anvendelige til fremstilling af en informativ, men tyk vævsektion. Endelig vi demonstrerer montering og billeddannelse af disse vævssnit med henblik på at undersøge den biologiske grænseflade omkring hjerne-implanterede enheder.
Feltet af neuroprosthetic forskning har til formål at hjælpe personer, der lider af forskellige handicap og lidelser ved at omgå syge eller beskadigede strukturer i kroppen gennem CNS interfacing enheder 1,2. Brain-implanterede microdevices, såsom mikroelektrode arrays (MEA), kan bruges til at optage eller stimulere hjernens strukturer, og dermed åbne mulighed for etablering af langsigtede grænseflader mellem elektronik og CNS-væv 3-5. Penetrerende multilaterale miljøaftaler bør udstyr, der drives ind i hjernevævet, holde særligt løfterige som tovejs grænseflader på grund af den tætte nærhed, inden for hvilken de præsenterer elektroder til en relativt lille sæt af nærliggende neuroner 6.
Imidlertid komplekse væv reaktioner skyldes langvarig implantation af gennemtrængende MEA'er, hvilket ofte resulterer i variable og gradvis nedbrydning elektrofysiologiske signal-til-støj-forhold over dage til måneder, og en stigning i elektrisk impedansmelse mellem elektrodeholdere sites og jord 7,8. De formodede oprindelsen af disse ændringer omfatter aktivering af mikroglia, reaktiv astrocytose langs microdevices, og et tab eller migrering af neuroner fra vævet omkring at implanterede enheder 9-11. En stor udfordring at forstå disse væv ændringer omkring kroniske, indtrængning MEA'er er vanskeligheden ved at erobre histologiske data af intakte vævsgrænsefladen omgiver kronisk implanterede enheder 12. Histologisk analyse af væv med enheden / vævsgrænsefladen stadig til stede ville forbedre den aktuelle enhed-fjernelse histologiske protokoller. Med en uforstyrret enhed tilbage i vævet, kan den biologiske virkning af relativt små interaktioner, såsom anvendelsen af biokompatible belægninger 13,14 eller den elektriske clearing af elektrodeoverfladen 15,16, afbildes og analyseres med hensyn til implantatet.
Hførend vi demonstrere en metode til at indsamle, behandle og image den intakte microdevice interface for detaljeret mikroskopi-baseret analyse af det omgivende hjernevæv. Ved denne fremgangsmåde er enheden og omgivende hjernevæv opsamlet i en tyk (> 250 um) vævssnit under anvendelse af en vibratome. At forbedre histologisk label indtrængen i disse tykke skiver, er fluorescerende histokemiske og immunhistokemisk etiketter anvendes i store koncentrationer i opløsninger indeholdende blokerende serum og detergent til flere dage. En optisk clearing opløsning anvendes til at forbedre mikroskopi billeddannelse dybder, og vævet er monteret i 2-sidede kamre til efterfølgende laserscanning konfokal mikroskopi 17. At indfange hele histologiske grænseflade, er en computerstyret translationel fase anvendes under billedbehandling til at indsamle z-stack panoramaer langs længden af implantaterne. Foruden billeddannelse anvendte væv etiketter, indsamling laser reflektans tilbage fra implantaterog transmission lys gennem vævet både hjælpe lokalisere indretningen grænseflade i forhold til omgivende væv. Væv fremstillet ved anvendelse af dette "Device-Capture Histologi" (DCHist) protokol giver imaging adgang til morfologisk bevarede væv / enhed interaktioner, og dermed forbedrer på tidligere device-fjernelse histologiske protokoller 18.
Den "Device-Capture Histologi" (DCHist) metoden vist her muliggør tætte histologisk vurdering af morfologisk bevarede interaktioner mellem hjernevæv og vævsimplantater. DCHist væv samling kræver omhyggelig adskillelse af skull-monteret enhed komponenter fra komponenter implanteret i hjernen. DCHist kræver også samling af en tyk histologisk væv skive (> 250 um). Disse vævssnit, når mærket, ryddet, monteret, og afbildes, kan give ny viden ind i implantation skade eller efterfølgende kronisk reaktion på katetre og lignende udstyr. Anvendelse af avancerede mikroskopi værktøjer, kan grænsefladen mellem vævs-og anordning afbildes og analyseres i høj detalje som vist i figur 3-5.
De præsenterede teknikker i deres nuværende form beror på evnen til langsomt at udgrave væk headcap fremstillet af todelte dentalcement og Kwik-Sil ned til det punkt af indretningen implantation.Udnytte dental cement, der kan brændes væk eller på anden måde fjernes og en klar silicium elastomer, hvorigennem en lille saks kan styres visuelt høj grad støtte en vellykket adskillelse af implanterede enhed fra dens kranium-monterede komponenter. Forsøg på at skære indretningen under kraniet og over hjernen for at indsamle det in situ anbefales ikke, som skallen monteret implantat vil blive trukket ud af hjernen en betydelig mængde.
Selv tyndere, mindre implantater som enlige skaft MEA'er fra NeuroNexus Technologies, der er mest modtagelige for DCHist, er de principper ikke begrænset til én enhed skafter eller mikroelektrode arrays. Indsamling og billeddiagnostiske strategier er bredt anvendelige til multi-skaft enheder og større implantater, såsom kanyler, med de krav er, at de skal være adskilt fra ethvert kraniet mount og indsamles inden en tyk vævssnit. Selv om forfatterne er fokuseret på analyse af vævomgivende corticale implantater, kan indretninger drives dybere ind i hjernen også indsamles og afbildes. Dybden af implantatindsættelse bør ikke påvirke indfangning af implantatet i en skive, forudsat at enheden ikke afviger meget fra den kendte vinkel indsættelse.
Findes der begrænsninger til nyttig anvendelse af DCHist metoden. Brain vævssnittene er udfordrende at billedet gennem hundredvis af mikrometer, især i områder med hvid substans, selvom optiske clearing-løsninger i høj grad kan forbedre billeddannelse dybder i forskellige væv 21. For yderligere at forbedre billeddannelse dybde, kan to-foton excitation mikroskopi anvendes sammen med den optiske beskrevne clearing.
En anden potentiel begrænsning af den beskrevne fremgangsmåde kan være de specifikke fluorescerende immunhistokemi metoder og antistoffer anvendes af forskere. Passiv diffusion typisk driver inkorporering af disse markører ved hjælp af fikseret vævog på antigenbindingssteder. Afsluttende antistof arbejder Koncentrationen skal måles med forskere på en sag til sag for at maksimere label penetration samtidig undgå høje niveauer af baggrunden mærkning. Antistof mærkning bør ikke være variabel mellem skiver, der behandles ens, men forskellige antistoffer kan variere betydeligt i deres evne til at trænge ind og tagge deres antigen, med nogle antistoffer nemt mærkning antigener mange hundrede mikrometer dybe og andre mærkning antigener kun ti mikrometer dyb. Vi beskriver forbedre denne diffusion ved at anvende antistof etiketter ved højere end typiske koncentrationer, for flere dage efter påføring, og i en opløsning indeholdende fortyndet opvaskemiddel og blokering serum. Periodisk vende skiver fremmer også selv mærkning. Antigen hentning trin og alternative fiksering processer (f.eks glutaraldehyd, mikrobølgeovn, etc.) kan være passende for specifikke antigener. Sekundært antistof-fluorochrome konjugater kan også variere i deres præstationer mærkning tykke sektioner, selv om dette ikke er blevet overholdt af forfatterne anvender Alexa Fluor etiketter fra Invitrogen. Alternativt kan transgene dyr fag, der udtrykker fluorescerende proteiner i celletyper af interesse anvendes til at undgå problemer med antistof label penetration, da mange fluorescerende proteiner, såsom eGFP, deres fluorescens bevarer efter formaldehydbehandling, og kan være det samme visualiseres i vævssnit.
DCHist er en kraftfuld række teknikker til at indfange og analysere virkningerne af implanterede microdevices på hjernevæv. Kobling dette histologisk protokol med in vivo vurdering af elektrofysiologi kvalitet og elektrodeimpedans data 22 kunne i høj grad forbedre vores forståelse af de biologiske kilder til fysiologi variabilitet og nedbrydning. Feltet af implanterede neurale proteser især kan drage fordel af den detaljerede DCHist imaging af den intakte indretning / vævsgrænseflade at informere yderligere udvikling af biologisk neutrale MEA-enheder.
The authors have nothing to disclose.
Alle forsøg blev udført under tilsyn af Purdue Animal Care og brug Udvalg og Laboratory Animal Program på Purdue University.
Dette arbejde blev støttet af Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), under ledelse af Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) som en del af de pålidelige Neural Technology Program, gennem Space og Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013.
Forfatterne vil gerne takke Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor, og Kevin Eliceiri for at dele deres mikroskopi ekspertise.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |