Summary
Nous présentons ici une méthode histologique pour la capture, l'étiquetage, la compensation optique et l'imagerie de l'interface cerveau intact tissu autour de microdispositifs chroniquement implantés dans le tissu cérébral des rongeurs. Les résultats des techniques comprenant cette méthode sont utiles pour comprendre l'impact des différentes pénétrantes cérébrales implants sur leur tissu environnant.
Abstract
Les recherches sur la conception et l'utilisation de microsystèmes cerveau implantés, tels que réseaux de microélectrodes, vise à produire des dispositifs cliniquement pertinentes qui s'interfacent avec les tissus environnants chronique du cerveau. Tissu entourant ces implants est pensé à réagir à la présence des dispositifs au cours du temps, ce qui comprend la formation d'un isolant "cicatrice gliale" autour des dispositifs. Cependant, l'analyse histologique de ces changements dans les tissus est généralement effectuée après explantation du dispositif, dans un processus qui peut perturber la morphologie du tissu d'intérêt.
Ici nous démontrons un protocole dans lequel corticales implantés les appareils sont recueillis intact dans les tissus environnants cerveau des rongeurs. Nous décrivons comment, une fois perfusé avec un fixateur, les cerveaux sont retirés et tranchés de manière à éviter les appareils explantation. Nous soulignons l'étiquetage des anticorps fluorescents et les méthodes de compensation optiques utiles pour la production d'une information, les tissus épais encoresection. Enfin, nous démontrons que le montage et l'imagerie de ces coupes de tissus afin d'enquêter sur l'interface biologique autour du cerveau implantés appareils.
Introduction
Le domaine de neuroprothèses recherche vise à aider les personnes souffrant de divers handicaps et de troubles en court-circuitant les structures malades ou endommagés dans le corps par le biais du système nerveux central interfaçage 1,2 appareils. Microdispositifs Brain-implantés, tels que réseaux de microélectrodes (MEA), peut être utilisé pour enregistrer ou stimuler des structures cérébrales, et permettre ainsi la mise en place d'interfaces à long terme entre l'électronique et le tissu du SNC 3-5. AME pénétrantes, des dispositifs qui sont enfoncés dans le tissu cérébral, particulièrement prometteuses comme des interfaces bidirectionnelles en raison de la proximité étroite au sein de laquelle ils présentent électrodes à un ensemble relativement restreint de neurones voisins 6.
Toutefois, le tissu complexe des réponses résultent de l'implantation à long terme de ces accords pénétrants, ce qui entraîne souvent variables et peu à peu dégradant électrophysiologiques signal sur bruit plus de jours à plusieurs mois, et une augmentation impédance électriqueéquilibre entre sites d'électrodes et la masse 7,8. Les origines supposées de ces changements comprennent l'activation de la microglie, astrocytose réactive le long des microsystèmes, et une perte ou la migration des neurones du tissu environnant aux dispositifs implantés 9-11. Un défi majeur pour la compréhension de ces changements dans les tissus autour de chroniques AME pénétration, est la difficulté à saisir les données histologiques de l'interface tissu intact autour de dispositifs implantés chroniquement 12. L'analyse histologique du tissu avec l'interface de périphérique / tissu toujours présent serait améliorer les actuels dispositif d'enlèvement des protocoles histologiques. Avec un dispositif intact restant dans le tissu, l'impact biologique des interactions relativement subtiles, telles que l'utilisation de revêtements biocompatibles 13,14 ou compensation électrique de la surface d'électrode 15,16, pourraient être numérisés et analysés par rapport à l'implant.
Havant nous démontrons une méthode de collecte, de traitement, et l'image de l'interface microdispositif intact pour la microscopie détaillée basée sur l'analyse du tissu cérébral environnant. Dans ce procédé, le dispositif et le tissu cérébral environnant sont recueillies dans une coupe de tissu (> 250 pm) d'épaisseur en utilisant un vibratome. Pour améliorer la pénétration des marques histologique dans ces tranches épaisses, étiquettes fluorescentes histochimiques et immunohistochimiques sont appliquées à des concentrations élevées dans des solutions contenant du sérum bloquant et détergent pendant plusieurs jours. Une solution de compensation optique est utilisée pour améliorer la profondeur d'imagerie de microscopie, et le tissu est monté en face des chambres 2-laser pour la suite microscopie confocale à balayage 17. À capturer l'interface complète histologique, une étape commandée par ordinateur de translation est utilisé lors de l'imagerie de recueillir z-pile panoramas le long de la longueur des implants. En plus de l'imagerie appliquée étiquettes tissus, la collecte de réflectance laser retour des implantset la transmission de lumière à travers le tissu à la fois permettre la localisation de l'interface de dispositif par rapport aux tissus environnants. Tissus préparés en utilisant ce "Device-Capture Histologie" (DCHist) protocole d'imagerie permet d'accéder aux morphologiquement préservé tissus / dispositif interactions, et améliore ainsi sur précédentes dispositif d'enlèvement des protocoles histologiques 18.
Protocol
Solutions
Phosphate Buffered Saline (PBS) - en g / l, 9 g de NaCl, 0,144 g de KH 2 PO 4, 0,795 g de Na 2 HPO 4, à pH 7,4
Le formaldéhyde 4% - en ml / l; 202 ml de sodium phosphate dibasique solution (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml de sodium phosphate monobasique solution (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml de solution de formaldéhyde à 8%, 250 ml Milli- Q DDi eau, à un pH de 7,4
HEPES solution saline tamponnée de Hank avec l'azoture de sodium (HBHS) - en g / l, 7,5 g de NaCl, 0,3 g de KCl, 0,06 g de KH 2 PO 4, 0,13 g de Na 2 HPO 4, 2 g de glucose, 2,4 HEPES g, 0,05 g de MgCl2 6 parties H 2 O, 0,05 g de MgSO 4 7 parties H 2 O, 0,165 g de CaCl 2, 0,09 g de NaN 3 à pH 7,4
Solution de lavage (WS) - 1% vol / vol, nede sérum de chèvre mal, 0,3% de Triton X-100, en HBHS avec l'azoture de sodium (NaN 3). Réfrigérer le WS à 4 ° C avant son utilisation dans les étapes ultérieures.
U2 Sca l e Solution - 4 M d'urée, 30% de glycerol et 0,1% de Triton X-100 17
PROCÉDURE
Toutes les expériences ont été effectuées sous la supervision de la protection des animaux et le Comité de Purdue utilisation et le Programme relatif aux animaux de laboratoire à l'Université Purdue.
1. Chirurgie
- Diverses méthodes chirurgicales aseptiques sont compatibles avec la méthode présentée histologique. L'utilisation d'un cadre stéréotaxique et d'insertion automatiques sont recommandées pour améliorer la reproductibilité angle d'implantation et le contrôle des réseaux de microélectrodes (MEA) par rapport aux plans stéréotaxiques.
Remarque: Dans cette démonstration de notre méthode chirurgicale est la suivante: maintenez le sujet rongeur stéréotaxique earbars while sous anesthésie isoflurane (entre 1-3%) porté par l'oxygène de qualité médicale. Test de l'absence d'un orteil-pincement reflètent chez le rat ou le manque d'un réflexe de pincement de la queue de la souris pour confirmer que l'animal est complètement anesthésié. Appliquer une pommade oculaire et nettoyer le site chirurgical avec trois lavages alternés de Bétadine et de l'éthanol. Se laver les mains, gants chirurgicaux, aube résille, masque et une blouse. Injecter un bolus de lidocaïne pour engourdir la zone chirurgicale, créer une incision à l'aide de ciseaux ou d'un scalpel, le périoste clair avec un grattoir à os et applicateurs de coton, et de créer une craniotomie avec une pièce à main dentaire perceuse et foret. Conduire un MEA simple tige dans le cortex à l'aide d'un micromanipulateur. Avoir une aide assistante en chirurgie dans le maintien de conditions aseptiques chirurgie et documenter les progrès de la chirurgie.
- Après l'implantation de la MEA dans le cerveau, recueillir des images par le biais d'un microscope chirurgical pour informer le retrait éventuel du crâne de partout dans le bpluie. Parties implantées des dispositifs seront préservés in situ.
Remarque: La collecte éventuelle d'un tissu avec des dispositifs situ dépend étroitement correspondant au plan de pose d'un dispositif avec le plan de sectionnement du tissu. Des notes détaillées sur le plan d'insertion dispositif par rapport au cerveau sont donc très importantes.
- Après l'implantation du dispositif, appliquer l'élastomère de silicone Kwik-Sil (WPI), autour d'une exposition tiges MEA ou de câblage, et laisser sécher. Un morceau de plastique stérilisés, comme une pointe de pipette coupe, peut être utilisé pour aider à contenir l'élastomère de silicone dans un petit puits autour de la craniotomie pendant le séchage.
- Appliquer une couche de deux parties acrylique dentaire ("Liquid Jet" et "poudre Jet" de Lang dentaire) sur le Kwik-Sil et toute crâne exposé.
Remarque: Dans une étape ultérieure, la coiffe est fondu à travers afin de permettre l'implantation à séparerà partir de la boîte crânienne. Durcissant aux UV, acrylique doit être évitée au cours de la Kwik-Sil et craniotomie, car cela acrylique très fort, c'est difficile à faire disparaître. Matériaux opaques visuellement autour de l'implant doit également être évité; clair Kwik-Sil fournit une vue de l'implant au cours des étapes ultérieures de ce protocole.
- Effectuez les procédures de soins post-opératoires selon le protocole local de la réglementation de protection des animaux, et revenir à des sujets ambulatoires unique logés en cage boîtes.
2. Perfusion tissulaire et Collection
Note: Voir Gage et al. pour une procédure pas à pas la procédure détaillée de perfusion dans le modèle animal de rat 19.
- Utilisez l'anesthésie et le protocole de perfusion approuvé par les soins des animaux de l'établissement et le comité de l'emploi. Après profondément anesthésier le rongeur (confirmé par un manque de parallélisme pincée réflexe chez le rat ou la queue-pincement réflexe chez la souris) et en exposant le cœur, faire peu profonds coups de ciseaux danspour le ventricule gauche et l'oreillette droite. Insérez une aiguille émoussée dans le ventricule gauche et d'offrir température ambiante PBS. Offrir un total d'environ 10 ml de PBS à ~ 5 ml / min chez la souris et ~ 200 ml de PBS à ~ 100 ml / min chez les rats. Cherchez d'épuration du sang par le foie au cours.
- Injecter étiquettes de produits chimiques histologiquement pertinentes transcardiaque, s'il le désire, par la remise seringue en prenant soin d'éviter d'introduire des bulles.
Remarque: Les étiquettes vasculaires (par exemple Dil) et du contre nucléiques colorants acides (par exemple Hoechst 33342) sont des exemples de livrables étiquettes de produits chimiques pendant la perfusion. Lorsqu'il est administré correctement, ces marqueurs histologiques devraient étiqueter l'animal entier 20.
- Livrer tamponné température ambiante, le formaldéhyde 4% transcardiaque pour fixer l'animal. Éviter une perforation du septum à travers le cœur, ce qui peut être mis en évidence par le poumon-nez de drainage pendant la perfusion. Recherchez les tremblements de fixation dans les grands musclespour indiquer perfusion complète. Livrer un total de 10 ml de fixateur ~ à ~ 5 ml / min chez la souris et fixateur ~ ~ 200 ml à 100 ml / min chez les rats.
- Après la perfusion, décapiter l'animal, exposer une partie du tronc cérébral ou du cervelet en utilisant rongeurs ou des ciseaux, et la tête dans une solution de formaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C.
- Laver la tête dans trois changements de PBS avec de une à quatre heures d'intervalle entre les lavages.
- Ranger les têtes fixes dans HBHS contenant de l'azoture de sodium à 4 ° C pendant plusieurs jours à plusieurs mois.
3. Retrait cerveau avec Dispositifs situ
Remarque: Effectuez cette section sous une hotte tout en portant un équipement de protection individuelle. Éviter le dessèchement des tissus en retournant la tête fixe à HBHS solution périodiquement.
- Disséquer soigneusement loin la peau et d'autres tissus autour de la calotte acrylique à l'aide de petites pinces et de ciseaux.
- Pendant que vous portez à la chaleur insensitive gants, utilisez un fer à souder pour enlever acrylique dentaire et exposer une zone de sous-jacents clair Kwik-Sil (Figure 2a).
Remarque: Le but de cette étape est de permettre aux micro-ciseaux un angle approprié d'accès aux postes où les dispositifs implantés entrent dans le cerveau, de sorte que le cerveau implantés les composants peuvent être séparés des éléments fixés sur le crâne.
- Sous un microscope chirurgical, coupé en élastomère de silicone avec micro-ciseaux courbes, enlever des petits morceaux de Kwik-Sil avec des pincettes jusqu'à la position où les dispositifs de pénétrer dans le cerveau.
- Continuer le long de la surface de coupe de la craniotomie avec des micro-ciseaux courbes à séparer les composants de l'appareil attaché au polysilicium et du crâne de composants implantés dans le cerveau. Encore une fois utiliser un grossissement de microscope et un grand soin lors de la coupe à travers les composants de l'appareil exposés, en prenant soin de ne pas pousser ou traîner l'implants dans le tissu fixe.
- Retirer l'os autour de la coiffe avec soin avec des rongeurs. Utilisez une spatule pour séparer le cerveau avec des dispositifs implantés à partir du crâne. Stocker le cerveau en solution HBHS jusqu'au moment de trancher.
- Placez le cerveau dans un plat en verre de Pétri remplie avec HBHS, et utiliser une lame de rasoir pour enlever les tissus étrangers tels que la moelle épinière, le cervelet, le bulbe olfactif ou, selon qu'elles se rapportent à l'emplacement de l'implantation du dispositif. Utiliser un bloc de cerveau (Ted Pella) et des lames de rasoir à l'article du cerveau et de créer une surface plane correspondant étroitement l'angle des dispositifs implantés, ce qui est réalisé en plaçant le cerveau dans un bloc de cerveau de taille adéquate, l'orientation du cerveau telle que toute partie visible de l'implant soit parallèle avec le guide de lame de rasoir, et à placer une lame de rasoir dans une lame de guidage d'au moins 2 mm à partir de l'implant. Appuyer sur la lame de rasoir à travers le tissu. Montez cette surface à une plate-forme vibratome. Alternament, une lame de rasoir montée sur un micromanipulateur peut être utilisé d'une manière similaire au bloc commandé en cerveau de créer un plan correspondant de près au sens de l'implant.
- Lieu de glace sous la plate-forme vibratome, et, après avoir laissé la surface du tissu brièvement sécher sur une serviette en papier, respecter le cerveau à l'aide d'un vibratome Super Glue. Colle le plan du tissu plat créé à l'étape précédente est à l'étage. Avec des dimensions asymétriques de tissus, d'orienter l'échantillon de telle sorte que la plus grande dimension est collée parallèle à la direction de déplacement de la lame pour éviter vibratome la lame potentiellement frapper sur le tissu. Après que la colle (~ 1-2 min), ajouter réfrigérés (~ 4 ° C) PBS pour le plat vibratome autour du tissu.
- Recueillir des tranches de tissu épais entre 200-400 um, y compris les tissus de commande, en utilisant le taux de vibration maximale (~ 100 Hz) et un taux de lame lente progression (<0,2 mm par seconde), avec un angle de la lame de 10 ° à partir de horizontal. Recueillir soigneusement les tranches avec une spatule ou pinceau rond et en magasin HBHS dans une plaque à 24 puits à 4 ° C.
- Une fois le dispositif en place est visible à l'oeil nu ou au microscope chirurgical, collecter des sections plus minces pour approcher le dispositif de découpe en tranches de 100 um ou moins.
Remarque: typiques de silicium micro-implants sont visibles à l'œil nu dans le formol fixe tissus du cortex cérébral des rongeurs entre 300 et 500 um de la surface du dispositif.
- Avec le dispositif en place maintenant à proximité de la surface du tissu, une coupe de tissu collecter> 250 um contenant le dispositif à l'intérieur. Estimation de l'épaisseur nécessaire peut être facilitée en se référant à des tranches précédemment collectées.
Remarque: agrandie dispositifs, appareils et dispositifs multident angulaires peuvent nécessiter des tranches de tissu plus épaisses (> 500 um) pour saisir le dispositif d'une seule pièce de tissu; remembre qui à la fois la pénétration des étiquettes appliquées et de la profondeur de l'imagerie microscopique sera limité à la collecte de données éventuelle de ces tranches très épaisses. Si possible, évitez de frapper l'appareil avec la lame vibratome, car cela peut causer un frottement du dispositif à travers la déformation des tissus et morphologique.
4. Traitement des tissus et de compensation
- Laver 3x tranches de 5 min par lavage dans HBHS
- Incuber dans du borohydrure de sodium (5 mg de NaBH 4/1 ml de HBHS) pour 30 min au total (15 min de chaque côté de la tranche). Retourner les tranches à l'aide d'un acier inoxydable ou en Téflon cuillère enduit micro et petit pinceau (Ted Pella). Des mouvements lents et réfléchis améliorer le succès de chaque flip tranche. Évitez de toucher les endroits autour de l'implant avec la brosse. Lorsque cela est possible, en ajoutant une solution beaucoup plus que nécessaire (> 2 ml) permet de manipuler et retourner les tranches de tissu plus facilement.
Note: Cette étape permet de réduire endogène autofluorescence; sauter cette étape si les marqueurs fluorescents ont été appliquées pendant la perfusion ou XFP marqueurs transgéniques sont présents.
- Laver 3x tranches de 5 min par lavage dans la solution de lavage à température ambiante.
Remarque: Agitation pendant les étapes de lavage et d'incubation est facultative. Les auteurs supposent que subtile secousses de l'implant rigide par rapport au tissu cérébral environnant peut se produire avec agitation. Toutefois, un mélangeur orbital se déplaçant à une vitesse douce (<60 min) peut éviter ce tout en augmentant la circulation de solutions.
- Bloquer pendant 2 heures dans la solution de lavage à température ambiante (tranches à feuilles au bout d'une heure).
- Incuber des anticorps primaires (dilué dans la solution de lavage) pendant environ 48 h (24 h de chaque côté de la tranche) à 4 ° C.
- Effectuer 6 3 lavages rapides min avec la solution de lavage.
- Effectuez 6, 1 h (3 lavages lavagees de chaque côté de la tranche de tissu) dans la solution de lavage (à conserver à 4 ° C si du jour au lendemain à laver).
- Incuber dans Anticorps secondaires (dilué avec la solution de lavage) pendant environ 48 heures (24 h de chaque côté) dans 4 ° C.
- Effectuer 6 3 lavages rapides min avec la solution de lavage.
- Effectuez 6, 1 lave-h (3 lavages de chaque côté) dans la solution de lavage; conserver à 4 ° C si le lavage du jour au lendemain.
- Retirer la solution de lavage et ajouter la base de glycérol "U2 - Sca l e" solution de compensation. Permettre de dégager environ 1 semaine pour tranches épaisses (250-500 um) ou 2-3 semaines pour des coupes de tissus très épais (> 500 um) à 4 ° C.
- Couvrir la plaque avec une feuille et conserver à 4 ° C.
- Montez dans les diapositives pouvant accueillir des coupes de tissus épais (figure 2b, 2c) en utilisant une solution de compensation comme milieu de montage et d'étanchéité avec du vernis à ongles transparent. Conserver à 4 ° C loin de la lumière.
5. Panorama complet d'imagerie de TiInterface quest et des périphériques
- L'utilisation à long objectifs de microscope de travail à distance (> 2 mm), commencer l'imagerie avec un microscope confocal à balayage laser ou un 2-photon microscope. Nous allons démontrer avec un Zeiss LSM 710, Carl Zeiss "Zen" logiciel (2010), et une platine XY commandé par ordinateur traduire à l'image d'un panorama 3D autour de l'implant.
Remarque: correct pour l'indice de réfraction de la solution de compensation soit dans le logiciel, par l'intermédiaire d'un collier de correction de l'objectif, ou dans le traitement des données après la collecte. Dans cette démonstration, nous entrons dans une valeur d'indice de réfraction de la solution "U2" compensation de 1,4 dans le logiciel Leica microscope Zen, ce réglage permet d'ajuster subtilement z étape intervalles pour tenir compte des non-concordance d'indice de réfraction.
- Dans le tissu proximité de l'appareil, à peu près évaluer les appropriées axe z les paramètres de collecte de fenêtres et de données dans la dimension z pour chaque canal fluorescente en utilisant la puissance du laser faible (~ 00,5 à 5%) et les grandes z étape tailles (> 25 m).
Remarque: inclure un espace supplémentaire au-dessus et au-dessous lors de la fixation de l'axe z lorsque la mise en place pour la collecte de données panoramique, que le tissu ne peut être située entièrement à plat sur la lame porte-objet (~ 20 um dans chaque sens).
- Définir l'objectif au centre xy de votre panorama éventuelle; l'aide du logiciel panorama Zen, déterminer le nombre de postes de collecte requis pour chaque axe (x et y) pour couvrir votre région d'intérêt.
- Réévaluer et finaliser la fenêtre de collecte de l'axe z.
- Régler manuellement la sensibilité du détecteur et de la puissance du laser à la rampe de manière appropriée avec une profondeur accrue, l'objectif est généralement de maintenir à peu près la même intensité de l'image indépendamment de la profondeur d'imagerie dans la tranche de tissu, mais aussi pour éviter le bruit de fond élevé.
- Recueillir chaque image fluorescente séries de données. S'il est nécessaire d'éviter le chevauchement des signaux, exécutez la ligne lasers séquentiellement.
Remarque: Le cas échéant, configurez le logiciel pour sauvegarder automatiquement les données sur le disque dur lors de la collecte.
- Modifiez les paramètres du logiciel pour recueillir les «réflexion» et «de transmission» des données, et d'utiliser plus d'une, longueur d'onde laser plus pénétrant (par exemple 633 nm) pour capturer ces canaux. Déterminer la puissance du laser et la sensibilité du détecteur approprié pour "réflectance" et "transmission" collecte et répéter la même collection série à travers le dispositif implanté.
- Exporter les données pour traitement ultérieur, la quantification et l'analyse.
Representative Results
AME Brain-implantés peuvent être collectées dans des tranches de tissu en séparant d'abord les composants montés sur le crâne de certains composants du cerveau embarqués. Figure 2a montre les résultats de retirer un côté d'une coiffe ciment dentaire et une partie de Kwik-Sil autour d'un câble MEA sur un crâne de rat. Fer à souder a été utilisé pour retirer le ciment dentaire et Kwik-Sil dans une hotte. Le câblage et les structures non-implantés MEA ont ensuite été coupé par des ciseaux par les micro-lentement à travers l'excavation Kwik-Sil vers le bas à la surface du cerveau fixe.
Après le tranchage, l'étiquetage et la compensation des tissus, de simples faits sur diapositives sont utiles pour le montage des tranches de tissu épais (Figure 2b). Une tranche de cerveau monté contenant un microdispositif implanté est illustré à la figure 2c. Imagerie par le biais de chaque côté de la lame peut vous permettre d'évaluer l'interface autour d'un dispositif, comme le montre la figure 3 (figure 3a) et la microglie ainsi que des sites d'électrodes et les traces sont visibles de l'autre côté (figure 3b).
Une fois monté, le tissu peut être visualisé à l'aide d'une platine de translation XY. Aperçus de marqueurs fluorescents à travers des tranches de tissu entières peuvent être générés à la résolution désirée (figure 4). L'examen détaillé de l'interface tissu morphologiquement préservé autour de microdispositifs implantés peuvent être collectées sous fort grossissement pour l'analyse de la réponse tissulaire locale (figure 5).
Figure 1. Vue d'ensemble de la procédure. (Ca) Brain micro-implants chirurgies sont finalisé avec une couche de polymère Kwik-Sil entourant immédiatement l'appareil, suivie d'un revêtement de ciment acrylique. (D, e) après l'euthanasie, la couche acrylique est brûlé, et le crâne montés des composants du dispositif sont séparés de composants implantés en coupant à travers l'élastomère de silicone. (F, g) Le cerveau est alors retiré de la boîte crânienne et est découpée et montée à l'étage vibratome. (Hk) sont des tranches de tissu recueilli, comprenant une tranche de tissu contenant le dispositif. (L) Les tissus peuvent ensuite être traitées et montés dans des chambres personnalisées pour la microscopie détaillée. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. (A) Effacer Kwik-Sil su élastomère de siliconerrounding un câble d'électrode à barrettes (flèche) a été exposé par gravure d'une fenêtre de distance dans le bouchon de ciment dentaire sur une tête de rongeur perfusé à l'aide d'un fer à souder. (B) Pour tenir compte dans l'imagerie d'autre d'une tranche de tissu épais, simple "glissement-chambres" peut être réalisée par découpe d'une lame couvre-objet en plastique et adhérant des deux côtés autour du tissu et de montage solution. (C) Une tranche de tissu de cerveau de rat avec implant intact (flèche rouge) est affiché après le montage. De chaque côté du tissu est rapidement accessible à l'imagerie microscopique avec cette configuration. Pour l'échelle, le panneau (a) est de 25 mm de diamètre à la base, tandis que les panneaux (B, C) sont de 80 mm de diamètre à la base.
Figure 3. Int maximumensity z projections de 40 um d'épaisseur, des piles d'images recueillies à travers le côté arrière (a) et avant (b) d'un réseau de microélectrodes implantées. Microglie (marquées avec anti-Iba1 et Alexa Fluor 633, blanc) et la réflectance de lumière laser (rouge), collectées à partir de la surface du dispositif, ont été consécutivement créés de part et d'autre d'une tranche de 400 um d'épaisseur du tissu. Comme les implants cérébraux sont souvent opaques, montage avec accès optique pour les deux parties fournit une vue claire des structures tissulaires marquées "derrière" l'implant par rapport à l'objectif du microscope. Barre d'échelle 50 pm.
Figure 4. Une tranche DCHist étiquetés imagée en utilisant une étape contrôlée par ordinateur sur un microscope confocal à balayage laser. Les noyaux cellulaires (a) (colorés au Hoechst 33342) et (b) les monocytes / microglie(Étiqueté anti-Iba1) ont été simultanément imagée sur des canaux séparés. Transmission de lumière (c) et de la réflectance ont également été recueillies, montre l'emplacement de l'implant 4-semaines par rapport à Hoechst et Iba1 données. (D) Superposition de tous les canaux de transmission, mais est également indiquée. La zone rectangle blanc est détendu dans les images qui apparaissent à droite. La barre d'échelle 1 mm.
Figure 5. Utilisation d'une platine de microscope commandé par ordinateur et un logiciel approprié, les données d'imagerie panoramique peuvent être collectés autour de l'implant. Réflectance (a) et de transmission (b) permettre la localisation de l'appareil, tandis que les étiquettes fluorescentes anticorps ou chimiques (c, anti-Iba1 étiquetage de la microglie et macrophages) permettent une imagerie détaillée des composants du tissu le long de l'interface tissu intact. Barre d'échelle 200 um.
Discussion
Le "Device-Capture Histologie" (DCHist) méthode décrite ici permet l'évaluation histologique de près les interactions entre morphologiquement préservé tissus du cerveau et les implants tissulaires. Collecte de tissus DCHist nécessite une séparation minutieuse des composants de l'appareil crâne montés à partir de composants implantés dans le cerveau. DCHist nécessite également la collecte d'une tranche histologique épais (> 250 m). Ces coupes de tissus, une fois étiqueté, effacé, monté et imagé, peut fournir des indications nouvelles sur la blessure d'implantation ou ultérieure réponse chronique à des dispositifs à demeure. Utilisation des outils de microscopie de pointe, l'interface entre le tissu et le dispositif peuvent être visualisés et analysés en détails élevés, comme indiqué dans les figures 3-5.
Les techniques présentées dans leur forme actuelle repose sur la capacité à creuser l'écart lentement la coiffe fabriqué à partir de ciment dentaire en deux parties et Kwik-Sil jusqu'au point d'implantation du dispositif.L'utilisation de ciment dentaire qui peut être brûlé ou autrement retirée et un élastomère de silicone clair à travers lequel de petits ciseaux peut être guidé visuellement grandement aider à réussir à séparer le dispositif implanté crâne de ses composants montés. Tenter de couper l'appareil sous le crâne et surtout le cerveau afin de le récupérer in situ n'est pas recommandée, car l'implant crâne monté sera sorti du cerveau d'un montant significatif.
Bien plus minces, les implants plus petits, tels que les AEM tige unique de technologies NeuroNexus, sont plus propices à DCHist, les principes ne se limitent pas à tiges simples ou périphériques réseaux de microélectrodes. Collecte et stratégies d'imagerie sont largement applicables à tiges multiples dispositifs et implants plus grands tels que les canules, les conditions étant qu'ils doivent être séparés de toute monture crâne et recueillies dans une coupe de tissu épais. Bien que les auteurs se concentrent sur l'analyse des tissusentourant les implants corticaux, dispositifs entraînés profondément dans le cerveau pourrait également être collectées et imagée. La profondeur de pose de l'implant ne devrait pas affecter la capture de l'implant dans une tranche à condition que le dispositif ne s'écarte pas de manière extravagante de l'angle connu d'insertion.
Limitations existent à l'application utile de la méthode DCHist. Coupes de tissus du cerveau sont difficiles à l'image à travers des centaines de micromètres, en particulier dans les domaines de la substance blanche, bien que des solutions de compensation optique peut grandement améliorer la profondeur d'imagerie dans différents tissus 21. Pour améliorer encore la profondeur d'imagerie, la microscopie à deux photons d'excitation peut être utilisé en même temps que la compensation optique décrit.
Une autre limitation potentielle de la méthode décrite peut être des méthodes spécifiques et des anticorps fluorescents immunohistochimie employées par les chercheurs. La diffusion passive entraîne généralement la prise en compte de ces marqueurs dans les tissus fixeet sur les sites de liaison d'antigène. Les concentrations finales de travail anticorps doit être déterminée par des chercheurs au cas par cas afin de maximiser la pénétration des marques, tout en évitant des niveaux élevés d'étiquetage arrière-plan. Marquage de l'anticorps ne doit pas être variable entre les tranches qui sont traitées de manière identique, mais les anticorps différents peuvent varier considérablement dans leur capacité à pénétrer et à marquer leur antigène, avec certains anticorps facilement l'étiquetage des antigènes de plusieurs centaines de micromètres de profondeur et d'autres antigènes d'étiquetage seulement quelques dizaines de micromètres de profondeur. Nous décrivons l'amélioration de cette diffusion par l'application d'étiquettes d'anticorps à un niveau supérieur concentrations typiques, pendant plusieurs jours d'application, et dans une solution contenant un détergent dilué et sérum bloquant. Périodiquement, renversant les tranches favorise également la même étiquetage. Étapes d'extraction des antigènes et des processus de fixation de remplacement (par exemple le glutaraldéhyde, micro-ondes, etc) peut être approprié pour des antigènes spécifiques. Anticorps secondaire-fluorochrome conjugués peuvent également varier dans leur performance marquage des coupes épaisses, même si cela n'a pas été observé par les auteurs à l'aide Alexa Fluor étiquettes d'Invitrogen. Alternativement, les sujets animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les types cellulaires d'intérêt peuvent être utilisés pour éviter les problèmes avec la pénétration des marques d'anticorps, comme de nombreuses protéines fluorescentes, comme eGFP, conservent leur fluorescence après traitement au formaldéhyde, et peuvent être immédiatement visualisées dans des coupes de tissus.
DCHist est un puissant ensemble de techniques pour recueillir et analyser l'impact de microsystèmes implantés sur le tissu cérébral. Couplage avec le protocole histologique évaluation in vivo de la qualité de l'électrophysiologie et de l'impédance des électrodes 22 pourraient grandement améliorer notre compréhension des sources biologiques de la variabilité physiologie et de la dégradation. Le domaine de prothèses neurales implantées en particulier peuvent bénéficier de la fiche détaillée ima DCHistGing de l'appareil intact / tissus d'interface pour informer le développement de dispositifs AME biologiquement neutres.
Disclosures
Les auteurs n'ont aucune divulgation applicables à déclarer, financière ou autre.
Acknowledgments
Toutes les expériences ont été effectuées sous la supervision de la protection des animaux et le Comité de Purdue utilisation et le Programme relatif aux animaux de laboratoire à l'Université Purdue.
Ce travail a été financé par la Defense Research Projects Agency avancée (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), sous les auspices du Dr Jack Judy W. (jack.judy @ darpa.mil) dans le cadre du programme de technologie Neural fiable, grâce à l'spatiale et navale Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) du Pacifique Grant n ° N66001-11-1-4013.
Les auteurs tiennent à remercier Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor, et Kevin Eliceiri pour partager leur expertise en microscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| H–chst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
| Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
| Equipment | |||
| Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
| Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
| Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
| Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
| Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
| Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
| Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
| 24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
| Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ’Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
| Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap | |
References
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