Här presenterar vi en histologisk metod för att fånga, märkning, optiskt rensa och bildhantering den intakta gränssnittet hjärnvävnad runt kroniskt implanterade Microdevices i hjärnvävnad hos gnagare. Resultat från de tekniker innefattande denna metod är användbar för att förstå effekterna av olika penetrerande brain-implantat på sin omgivande vävnad.
Forskning om design och användning av hjärnan implanterade Microdevices som mikroelektrod arrayer, syftar till att framställa kliniskt relevanta enheter som gränssnitt kroniskt med omgivande hjärnvävnad. Vävnad som omger dessa implantat är tänkt att reagera på närvaron av anordningarna över tiden, vilket inkluderar bildandet av ett isolerande "glial ärr" runt anordningarna. Emellertid histologisk analys av dessa vävnadsförändringar vanligen utförs efter explantation anordningen, i en process som kan störa morfologin hos vävnaden av intresse.
Här visar vi ett protokoll där kortikala-implantat samlas intakta i omgivande vävnad gnagare hjärnan. Vi beskriver hur, när perfunderas med fixativ är hjärnor avlägsnades och skivades på ett sådant sätt att man undviker explantation enheter. Vi beskriva fluorescerande antikroppar märkning och optiska metoder clearing användbara för att producera en informativ, men tjock vävnadavsnitt. Slutligen visar vi montering och avbildning av dessa vävnadssnitt för att undersöka den biologiska gränssnitt runt hjärnan implanterade anordningar.
Området neuroprosthetic forskning syftar till att hjälpa personer som lider av olika funktionshinder och sjukdomar genom att kringgå sjuka eller skadade strukturer i kroppen genom CNS gränssnitt enheter 1,2. Brain-implanterade Microdevices såsom mikroelektrod arrayer (MEA), kan användas för att spela in eller stimulera hjärnans strukturer, och därmed göra det möjligt att upprätta långsiktiga gränssnitt mellan elektronik och CNS-vävnad 3-5. Penetrerande multilaterala miljöavtal, enheter som drivs i hjärnvävnaden, håller särskilt löfte som bidirektionella gränssnitt på grund av närheten där de presenterar elektroderna till en relativt liten uppsättning av närliggande neuroner 6.
Emellertid komplexa vävnad svar resulterar från långvarig implantation av penetrerande MEA, resulterar ofta i variabla och gradvis förnedrande elektrofysiologiska signal-till-brusförhållanden under dagar till månader, och en ökning i elektrisk impedansning mellan elektroderna och jord 7,8. De förmodade ursprunget till dessa förändringar är aktivering av mikroglia, reaktiv astrocytos längs Microdevices, och en förlust eller migration av neuroner från den vävnad som omger till implanterade enheter 9-11. En stor utmaning att förstå dessa vävnadsförändringar runt kroniska, penetration MEA är svårigheten att fånga histologiska data intakt vävnadskontaktytan kring kroniskt implanterade enheter 12. Histologisk analys av vävnaden med enheten / vävnadsgränssnittet kvar skulle förbättra den nuvarande enhet-borttagning histologiska protokoll. Med en ostörd anordning kvar i vävnaden, kan den biologiska effekten av relativt subtila interaktioner, såsom utnyttjande av biokompatibla beläggningar 13,14 eller elektriska clearing av elektrodytan 15,16, avbildas och analyseras med avseende på implantatet.
Here visar vi en metod för att samla in, bearbeta och bild intakt mikroanordning gränssnittet för detaljerad mikroskopi-analys av den omgivande hjärnvävnaden. I denna metod enheten och omgivande hjärnvävnad in inom ett tjockt (> 250 nm) vävnadssnitt med hjälp av en vibratome. För att förbättra histologisk etikett inträngning i dessa tjocka skivor, är fluorescerande histokemiska och immunhistokemiska etiketter appliceras vid höga koncentrationer i lösningar innehållande blockerande serum och tvättmedel för flera dagar. En optisk clearing lösning används för att förbättra djup mikroskopi imaging, och vävnaden är monterad i 2-sidiga kammare för efterföljande laserskanning konfokal mikroskopi 17. För att fånga den fullständiga histologiska gränssnittet, är en datorstyrd translationell stadiet användes under avbildning för att samla z-stack panoramor längs implantat. Förutom avbildning används vävnad etiketter, samla laser reflektans tillbaka från implantatoch transmission ljus genom vävnaden både hjälp lokalisera enhetens gränssnitt i förhållande till omgivande vävnad. Vävnad med användning här "Device-Capture Histologi" (DCHist) protokollet ger avbildning tillgång till morfologiskt bevarade vävnad / enhet interaktioner och därmed förbättrar tidigare enhet-borttagning histologiska protokoll 18.
Den "Device-Capture Histologi" (DCHist) metod visade här möjliggör nära histologisk morfologiskt bevarade interaktioner mellan hjärnvävnad och implantat vävnad. DCHist vävnad samling kräver noggrann separation av skallen monterade enhetens komponenter från komponenter implanterade i hjärnan. DCHist kräver också insamling av en tjock histologisk vävnad skiva (> 250 nm). Dessa vävnadssnitt, när märkt, rensas, monterade, och avbildas, kan ge nya insikter i implantation skada eller senare kronisk reaktion på medicinsk utrustning. Med avancerade mikroskopi verktyg kan gränssnittet mellan vävnad och anordning avbildas och analyseras i hög detalj, såsom visas i figurerna 3-5.
De presenterade teknikerna i sin nuvarande form är beroende av förmågan att sakta gräva bort headcap gjord av två delar tandcement och Kwik-Sil ner till den punkt av enhet implantation.Använda dentalcement som kan brännas bort eller avlägsnas på annat sätt och en klar silikonelastomer genom vilka små sax kan styras visuellt kraftigt underlätta framgångsrikt separera den implanterade enheten från dess skalle-monterade komponenter. Försök att skära enheten under skallen och över hjärnan för att samla den på plats rekommenderas inte, eftersom skallen-monterade implantat kommer att dras ut ur hjärnan en betydande mängd.
Även tunnare, mindre implantat, såsom enstaka skaft MEA från NeuroNexus Technologies, är mest mottagliga för DCHist är principerna inte begränsade till enda enhet skaft eller matriser mikroelektrod. Insamling och strategier avbildning är brett tillämpbar på flera skaft enheter och större implantat som kanyler, med de krav är att de måste skiljas från någon skalle montera och samlas i en tjock vävnadssnitt. Även om författarna är fokuserade på analys av vävnadomgivande kortikala implantat, kan enheter som drivs djupare in i hjärnan också samlas in och avbildas. Djupet av implantatinföring bör inte påverka fångst av implantatet i en skiva som apparaten inte avviker vilt från den kända vinkeln för insättning.
Begränsningar finns till användbar tillämpning av metoden DCHist. Brain vävnadssnitt utmanar till bild genom hundratals mikrometer, särskilt i områden med vit substans, även optiska clearing-lösningar kan förbättra avbildning djup i olika vävnader 21. För att ytterligare förbättra avbildning djup, kan tvåfotonexcitering mikroskopi användas tillsammans med den beskrivna optiska clearing.
En annan potentiell begränsning av den beskrivna metoden kan vara de specifika fluorescerande immunohistokemi metoder och antikroppar används av forskare. Passiv diffusion driver typiskt införlivandet av dessa markörer genom fast vävnadoch på antigenbindande ställen. Slutliga antikroppar arbetar Halterna måste bestämmas av forskare från fall till fall för att maximera etikett penetrering samtidigt undvika höga nivåer av bakgrunden märkning. Antikropp Märkningen bör inte vara variabel mellan skivor som behandlas identiskt, men olika antikroppar kan variera avsevärt i sin förmåga att tränga in och tagga sitt antigen, med vissa antikroppar lätt märkning antigener många hundra mikrometer djup och andra märkning antigener endast tiotals mikrometer djup. Vi beskriver förbättra denna spridning genom att antikroppar etiketter vid högre än typiska koncentrationer, för flera dagar av ansökan och i en lösning som innehåller utspädd rengöringsmedel och blockera serum. Periodvis vända skivorna också befrämjar jämn märkning. Antigenåtervinning steg och alternativa processer fixering (t.ex. glutaraldehyd, mikrovågsugn, etc.) kan vara lämpligt för specifika antigener. Sekundär antikropp-fluorochrome konjugat kan också variera i sina prestationer märkning tjocka sektioner, även om detta inte har observerats av författarna använder Alexa Fluor etiketter från Invitrogen. Alternativt kan transgena djur försökspersoner uttrycker fluorescerande proteiner i celltyper av intresse användas för att undvika problem med antikropp etikett penetration, eftersom många fluorescerande proteiner, såsom EGFP, behålla sin fluorescens efter formaldehyd behandling, och kan vara omedelbart visualiseras i vävnadssnitt.
DCHist är en kraftfull uppsättning tekniker för att fånga och analysera hur implanterade Microdevices på hjärnvävnad. Koppling denna histologisk protokoll med in vivo utvärdering av elektrofysiologi kvalitet och elektrod data Impedans 22 kan avsevärt förbättra vår förståelse av de biologiska källorna fysiologi variabilitet och nedbrytning. Området implanterade neurala proteser i synnerhet kan dra nytta av den detaljerade DCHist imaging av den intakta anordningen / vävnadsgränssnittet att informera vidareutveckling av biologiskt neutrala MEA-enheter.
The authors have nothing to disclose.
Alla experiment utfördes under överinseende av Purdue Animal Care och användning kommittén och Laboratory Animal programmet vid Purdue University.
Detta arbete sponsrades av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Mikrosystemteknik Office (MTO), under ledning av Dr Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) som en del av tillförlitlig Neural Technology Program, genom Space och Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) System Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013.
Författarna vill tacka Michail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor och Kevin Eliceiri för att dela sin mikroskopi expertis.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |