Summary
نحن هنا وصف العملية من جهاز ميكروفلويديك الذي يسمح المستمر وعالية الدقة التصوير المجهري لخلايا الخميرة في مهدها واحد خلال تنسخي كاملة و / أو العمر الزمني.
Abstract
ونحن لشرح استخدام برنامج الإعداد ميكروفلويديك بسيطة، التي يمكن من خلالها تعقب خلايا الخميرة في مهدها واحدة طوال حياتها بأكملها. رقاقة ميكروفلويديك يستغل الفرق بين حجم الخلايا الأم وابنتها باستخدام مجموعة من micropads. عند تحميل، محاصرون الخلايا تحت هذه micropads، لأن المسافة بين micropad وغطاء زجاجي يشبه القطر من خلية الخميرة (3-4 ميكرون). بعد إجراء التحميل، يتم مسح مستنبت بشكل مستمر من خلال رقاقة، مما يخلق ليس فقط بيئة ثابتة ومحددة في كافة مراحل التجربة برمتها، ولكن أيضا الإحمرار خارج الخلايا الوليدة الناشئة، التي لا يتم الاحتفاظ تحت منصات نظرا لحجم أصغر بهم. الإعداد يحتفظ الخلايا الأم بكفاءة حتى أنه في تجربة واحدة تصل إلى 50 الخلايا الفردية يمكن رصدها بطريقة مؤتمتة بالكامل لمدة 5 أيام، إذا لزم الأمر، أو لفترة أطول. وبالإضافة إلى ذلك، الخصائص البصرية ممتازة للرقاقة تسمح عاليةالدقة التصوير من الخلايا أثناء عملية الشيخوخة بأكمله.
Introduction
تبرعم الخميرة هو كائن نموذجا هاما للشيخوخة البحوث 1. حتى دراسة مؤخرا تنسخي الشيخوخة في خلايا الخميرة كانت عملية شاقة تتطلب طريقة تشريح، في كل برعم التي تم إزالتها يدويا من الخلية الأم 2،3. لحل هذه المشكلة، قدمنا مؤخرا إعداد ميكروفلويديك رواية قادرة على تتبع الخلايا الأم الفرد طوال حياتهم بأكملها عمر 4.
في رقاقة لدينا ميكروفلويديك، محاصرون خلايا الخميرة تحت لينة micropads القائمة على المطاط الصناعي (انظر الشكل 1). استمرار تدفق المتوسطة يغسل بعيدا الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا وتوفر الخلايا مع المواد المغذية الطازجة. في تجربة واحدة، وتصل إلى 50 خلية الأم يمكن رصدها بطريقة مؤتمتة بالكامل طوال حياتهم بأكملها تنسخي العمر. ويرجع ذلك إلى الخصائص البصرية ممتازة للرقاقة ميكروفلويديك، فمن الممكن لرصد الجوانب المختلفة في وقت واحد من بيولوجيا الخلايا الخميرة (على سبيل المثال
مقارنة لطريقة تشريح الكلاسيكية، والإعداد ميكروفلويديك يوفر مزايا كبيرة. فإنه يضمن بيئة محددة وثابتة خلال التجربة الشيخوخة كله. لا يتطلب أي معدات متخصصة مكلفة ويمكن تشغيلها على أي المجهر مجهزة التركيز الآلي وقدراتهم الوقت الفاصل بين وكذلك درجة الحرارة للسيطرة على زراعة الخلية. يمكن تعلم إنتاج وتشغيل رقائق ميكروفلويديك في غضون بضعة أيام. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا يمكن تحميلها مباشرة من تنامي ثقافة أضعافا مضاعفة، ميزة على طريقة أخرى نشرت مؤخرا ميكروفلويديك 5، الأمر الذي يتطلب biotinylation من الخلايا الأم. مجتمعة مع عالية الدقة والتصوير، والأسلوب هو موضح هنا يمكن أن تستخدم لقياس التغيرات التدريجية في التشكل الخلوي، بروتين تعبير والتوطين خلال الخميرة الشيخوخة على نحو غير مسبوق. القدرة علىيوفر الرصد على المدى الطويل من الخلايا واحد أيضا إمكانيات فريدة من نوعها للدراسات دورة الخلية الخميرة.
وقد تم تحسين هذه الطريقة مؤخرا على لإزالة biotinylation من البروتوكول 16، والتي نشرت في حين كان هذا المخطوط في الاستعراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنتاج وإعداد قالب رقاقة السيليكون
يتم إنشاء رقائق ميكروفلويديك من قالب رقاقة السيليكون التي تنتجها الطباعة الحجرية الناعمة. هذه الرقائق يمكن إعادة استخدامها مرات عديدة لإنتاج رقائق ميكروفلويديك. فإنه من المستحسن أن يتم تنفيذ إنتاج رقاقة منها من قبل مجموعة متخصصة في على microfluidics 6.
يرصد الرقاقة في عملية ضوئيه من خطوتين باستخدام اثنين من طبقات مختلفة من مقاومة للضوء سلبي، SU-8 7. يتم استخدام الطبقة السفلية لتوليد منطقة محاصرة خلية (SU-8 2002؛ ارتفاع 3-4 ميكرون)، في حين يتم إجراء قنوات مع الطبقة العليا (SU-8 لعام 2010؛ ارتفاع 10 ميكرون). انطباع من عملية الإنتاج رقاقة يمكن العثور عليها في هوانغ وآخرون 8. ويمكن الحصول على رسومات من رقائق ميكروفلويديك من المؤلفين وكذلك المشورة بشأن كيفية الحصول على رقاقة منها.
- حالما يتم الحصول على رقاقة، وقطع قطعة واحدة من الباحث صعبة-الدلاليةس شرائح رقيقة من حوالي 0.5 مم 3 مم مع مشرط ووضعها بعناية على رقاقة قليلا على الجزء العلوي من هيكل قناة بين القنوات مدخل ومجموعة micropad (الشكل 2A). وهذا سوف يؤدي إلى تشكيل قناة إضافية كبيرة في كل رقاقة، والتي لن تستخدم إلا أثناء التحميل الخلية، ولكن المهم أيضا لتشغيل مستقر للجهاز ميكروفلويديك.
- تغطية صحن الزجاج بيتري مع طبقة مزدوجة من رقائق الألومنيوم ووضع رقاقة في طبق بيتري. فإن رقائق الألومنيوم منع من الترشح في PDMS بين رقاقة وطبق بيتري. إذا PDMS يفعل زحف في بين رقاقة وطبق بيتري الزجاج، وسوف الرقاقة تصبح ثابتة بشكل دائم في طبق بيتري. على الرغم من أن لا تزال صالحة للاستعمال رقاقة، فإنه لن يكون من الممكن استبدال طبق بتري الزجاج اذا غيرت وسوف تحتاج إلى PDMS إلى قطع بعد ذلك.
2. إنتاج رقائق ميكروفلويديك
- وضع البلاستيكية الفارغةالكاس على التوازن والتوازن الفارغة. صب 40 ز PDMS قاعدة في كوب من البلاستيك (لزجاج قطرها سم طبق بتري 12). إضافة PDMS كيل علاج مع ماصة القابل للتصرف في فصيل عبد الواحد / ث نسبة 01:10، أي حوالي 4 مل.
- خلط PDMS وكيل علاج شامل لعدة دقائق. ويمكن أن يتم هذا مع ماصة البلاستيكية التي تم استخدامها لماصة وكيل علاج. فمن المهم أن الخليط يختلط جيدا قبل صب على رأس الرقاقة. سوف الفقراء خلط يسبب جزء من PDMS ليس لبلمرة.
- صب PDMS على رأس رقاقة في طبق بيتري الزجاج.
- سوف خلط PDMS مع وكيل علاج يؤدي إلى تشكيل فقاعة في الخليط PDMS. تحتاج هذه الفقاعات إلى إزالتها قبل يبلمر في PDMS. وPDMS يمكن degassed بعد صب على رأس الرقاقة عن طريق وضع طبق بتري في مجفف متصلة مضخة فراغ. مع هذا الإعداد، ويستغرق حوالي 30 دقيقة لإزالة جميع فقاعات من الخليط.
- بلمرة اله PDMS عن طريق وضع طبق بتري مع رقاقة فوق طبق ساخن عند 120 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم في 65 درجة مئوية لمدة ساعة أخرى.
- إزالة رقائق الألومنيوم مع رقاقة وبلمرة PDMS من طبق بيتري الزجاج. تقشر رقائق الألومنيوم وطبقة رقيقة من بلمرة المتبقية PDMS من الجزء الخلفي من الرقاقة. ويمكن بعد ذلك فصل طبقة من PDMS على رأس رقاقة من رقاقة من قبل رفعه لأعلى بعناية.
- وضع طبقة PDMS رأسا على عقب (مع القنوات التي تواجه متابعة) على مقاعد البدلاء وقطع وتصاميم رقاقة واحدة مطبوع على PDMS بعناية مع مشرط. محاولة للاحتفاظ حوالي 3 ملم من PDMS حول حواف القنوات لتحسين مرفق من الشريحة إلى غطاء زجاجي في وقت لاحق.
- الثقوب لكمة في PDMS في نهايات مدخل، مخرج والجانب قناة (الشكل 2A) عن طريق دفع كعب لور قياس 20 على طول الطريق من خلال PDMS بطريقة مباشرة.
تأكد من أن رقاقة PDMSلا يزال الكذب رأسا على عقب على مقاعد البدلاء في حين اللكم الثقوب. هذا يمنع PDMS من الالتصاق إلى داخل القناة، والذي يمكن أن يسبب انسداد في القناة.
- بعد كل ثقب اللكم، وإزالة عمود من PDMS في كعب لور مع ملاقط قبل سحب كعب مرة أخرى. العمود PDMS يمكن أن تبقى مدفونة خلف ومنع ثقب فقط.
- تنظيف السطوح من رقاقة من جزيئات الغبار وPDMS المتبقية عن طريق وضع لاصق شفاف على ذلك، وإزالة الشريط فورا مرة أخرى. وبالمثل تنظيف الغطاء الزجاجي الذي سيتم إرفاق رقاقة.
- وضع رقاقة تنظيفها وغطاء زجاجي تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية من الفوق منظف للأشعة فوق البنفسجية الأوزون. يجب على الجانبين التي تحتاج إلى أن يكون الرهينة معا مواجهة مصباح.
- فضح PDMS وتغطية الزجاج لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 6-8 دقيقة، وبعد ذلك وضعت مباشرة على رقاقة على الغطاء الزجاجي عن طريق وضع الأسطح المكشوفة على رأس كل منهما الآخر.
- اضغط بلطف حول جوانب الرقاقةلتعزيز مرفق من PDMS على الزجاج غطاء وإزالة أي فقاعات الهواء. لا تنقر على الجزء العلوي من هيكل قناة لأن هذا قد يتسبب في micropads للحصول على تعلق على غطاء زجاجي كذلك.
- ضع أدلى حديثا الإعداد ميكروفلويديك على طبق ساخن عند 100 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. اختبار قوة الترابط بين الغطاء الزجاجي وPDMS رقاقة من خلال محاولة لرفع حواف رقاقة PDMS قليلا. عندما كتلة PDMS لا يمكن رفعها من على سطح الزجاج، والترابط هو ناجح ورقاقة جاهزا للاستخدام.
3. إعداد المعالج لتحميل برنامج الأذان
فشل جهاز ميكروفلويديك يمكن أن يسبب تسرب المتوسطة في المجهر. لتجنب هذا، فمن الاستشارية لاستخدام حامل معدني و / أو ختم الجانبين من رقاقة حيث يلتقي PDMS الزجاج مع طلاء الأظافر أو الغراء الايبوكسي. هذا يمنع تسرب المتوسطة في حال عدم المستعبدين رقاقة PDMS جيدا بما يكفي لغطاء زجاجي. أيضا الأنابيبويمكن تأمين الاتصالات حول نقاط الإدراج بطريقة مشابهة لتجنب تسرب من المتوسط. جهاز استشعار المياه الصنع التي تطفئ ضخ حقنة في حالة وجود تسرب يمكن استخدامها كإجراء وقائي سلامة إضافية. ويمكن الحصول على رسومات للحامل معدني مصممة خصيصا للرقاقة ميكروفلويديك من المؤلفين.
- وضع رقاقة ميكروفلويديك في حامل معدني، مع هلام السيليكون بين الزجاج من رقاقة والأجزاء المعدنية للحامل لإنشاء ختم ماء. المسمار المكسرات بلطف، لا لكسر الزجاج.
- ربط أنابيب رقيقة (حوالي 5-15 سم) إلى جانب قناة وقناة منفذ للرقاقة. استخدام ملاقط يجعل من الاسهل لادخال الأنبوب في ثقبا.
- ملء 50 مل لور لوك المحاقن مع مستنبت، وإزالة الهواء من الحقنة وتوصيله بشكل تسلسلي لمرشح حقنة، كعب لور قياس 20، أنبوب سميك قصير (حوالي 2 سم) وأنبوب رفيع. تأكد من أن حوض استحمام رقيقةالإلكترونية هي فترة كافية لتغطي المسافة بين ضخ حقنة والمسرح المجهر.
- ضع الحقنة في ضخ حقنة، سريع إلى الأمام المضخة حتى أنبوب رفيع يتم تعبئة تماما مع المتوسط.
- دفع أنبوب رفيع متصلا حقنة في قناة مدخل للرقاقة، والسماح للتدفق المتوسطة من خلال رقاقة في 10 ميكرولتر / دقيقة (الشكل 2B). جمع المتوسطة مغادرة رقاقة (على سبيل المثال في طبق بتري). سيتم تشغيل المتوسطة خارج عن طريق قناة جانبية بسبب الفرق بين المقاومة جعلت صعبة-الدلالية قناة جانبية كبيرة والقناة منفذ.
- وضع رقاقة في المرحلة المجهر وضبط تركيز المجهر على منصات.
ويفضل استخدام الغمر أهداف النفط خلال تلك الأهداف الغمر بالماء لأن النفط لن تجف على مراحل الساعة من التجربة.
اعتمادا على المجهر قد يكون هناك مشاكل مع الإبقاء على جمعةocus خلال الساعات الأولى من التجربة. ولذلك فمن المستحسن ترك رقاقة ل 1-2 ساعات في المرحلة المجهر لذلك يمكن أن يستقر قبل تحميل الخلايا وبدء التجربة.
4. التحميل من خلايا الخميرة في رقاقة ميكروفلويديك
- قم بتوصيل 5 مل لور طرف الحقنة إلى كعب لور قياس 20 وأنبوب سميك (حوالي 3 سم).
- أخذ عينة من ثقافة الخلية المراد تحميلها في رقاقة.
العد الخلية المفضل للتحميل بين 1-5 × 10 6 خلايا لكل مل. الثقافات مع عدد الخلايا العالي تحتاج إلى أن تضعف قبل التحميل. عندما زراعة الخلايا على YPD والكفاءة التحميل الخلية يمكن تحسين مرات عديدة إذا تم غسلها الخلايا الأولى مع ومعلق في الحد الأدنى من المتوسط يحتوي على نسبة الجلوكوز مماثلة قبل التحميل. خلال عملية للرقاقة، ويمكن مرة أخرى YPD المتوسطة استخدامها بأمان.
- تحميل ما يقرب من 1 مل من تعليق الخلية في اله حقنة وإزالة كل الهواء من الحقنة.
- خفض معدل تدفق ضخ حقنة إلى 0.5 ميكرولتر / دقيقة. فإن انخفاض تدفق واستمرار القسري بواسطة مضخة محقنة أثناء التحميل (في الخطوة 4.5) دفع الخلايا غير المرفقة خارج عن طريق قناة جانبية (الشكل 2C).
- ربط حقنة تحتوي على تعليق خلية في أنبوب للقناة منفذ. تحميل الخلايا عن طريق الضغط على المكبس من المحاقن بلطف. مراقبة الخلايا القادمة في وتسوية تحت micropads عن طريق العين أو عن طريق شاشة الكمبيوتر.
- الحفاظ على الضغط على المكبس حتى خلايا كافية تسوية تحت منصات. الحمل الأمثل هو 1-3 خلايا لكل لوحة. كخلايا تسوية تحت منصات عشوائيا، فمن الشائع جدا أن عدد قليل من منصات لا تحتوي على أي تمتلئ الخلايا ومنصات أخرى تماما مع الخلايا.
- قطع الحقنة المستخدمة لتحميل الخلية وأنبوب سميك لأنها مرتبطة من أنابيب رقيقة من قناة مخرج، تدفق CH الجانبannel لبضع دقائق في معدلات التدفق العالي (10 ميكرولتر / دقيقة) لإزالة فقاعات الهواء و / أو الخلايا التي لم بعد الخروج من رقاقة (الشكل 2B). إذا لم تتم إزالة الخلايا من قناة الجانب، فإنها يمكن أن تبدأ في النمو في القناة الجانبية وتتداخل مع التجربة في وقت لاحق.
- وضع تدفق ضخ حقنة يتراجع إلى 0.5 ميكرولتر / دقيقة وإغلاق قناة الجانب قبالة عن طريق توصيله إلى أنبوب سميك (حوالي 5 سم) تحتوي على المكونات القسطرة في نهايته (الشكل 2D).
- زيادة تدفق إلى معدل التدفق النهائي من 1-5 ميكرولتر / دقيقة. قد تختلف الأسعار اعتمادا على تدفق المتوسطة وسلالة الخميرة.
- بدء الفيلم مع إعدادات المجهر والكاميرا مناسبة لتحقيق الهدف من التجربة. تأكد من أن يتم تعيين سرعة من المرحلة المجهر لمثل هذه السرعة المنخفضة أن النفط يمكن أن يتبع. لتحديد عمر تنسخي، والخلايا صورة كل 10 دقيقة. لحماية الخلايا من كميات ضئيلة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية المنبعثة من الهالوجينمصباح، والذي يستخدم خلال اكتساب مدينة دبي للإنترنت، فإنه من المستحسن أن تضع فلتر الأشعة فوق البنفسجية إضافية في مسار الضوء. عندما باستخدام المجهر مضان، ويفضل أن صورة الخلايا أقل في كثير من الأحيان (مثل كل 20 دقيقة) لتجنب التأثيرات الضوئية. اكتمال التجربة عندما تكون جميع الخلايا تحميلها في بداية التجربة قد لقوا حتفهم، والتي في ظل الظروف العادية يستغرق فترة تصل إلى 5 أيام. فمن المستحسن للتحقق بانتظام والتركيز على الصور أثناء التجربة وإذا لزم الأمر تعديله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول، يتم تحميل الخلايا في رقاقة ميكروفلويديك مباشرة من ثقافة منتصف الأسي. للتأكد ما إذا كان التوزيع العمري للخلايا المحاصرين في رقاقة ميكروفلويديك هي مماثلة لتلك الثقافة قبل التحميل، وكانت ملطخة الخلايا مع راصة القمح مترافق إلى FITC (WGA-FITC) لتصور ندوب برعم. كما يمكن أن يرى في الشكل (3)، لا تنحاز لانحباس الخلايا تحت micropads للرقاقة ميكروفلويديك إلى خلايا سن معينة.
يمكن ببساطة تنسخي عمر يتحدد عن طريق حساب عدد من البراعم التي تنتجها خلية أم وحيدة. يتم تحويل هذه البيانات إلى منحنى العمر الإفتراضي بواسطة المتهم بالتآمر في النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة ضد عدد من البراعم المنتجة. الاختبارات الإحصائية، مثل تلك التي يؤديها Kaeberlein، وآخرون. 9، ويمكن استخدامها لمقارنة البيانات العمر من تجارب مختلفة. ويبين الشكل 4 مثالا من عمر منحنياتالتي تم الحصول عليها لWT BY4741 سلالة الخميرة واثنين من المسوخ (sir2 Δ، fob1 Δ).
الفيلم 1 الوقت الفاصل بين فيلم واحد WT BY4741 خلية الخميرة تنمو على YPD المتوسطة. وقد أخذت صور كل 10 دقيقة. الخلية تنتج ما مجموعه 30 البراعم قبل أن يموت. شريط النطاق، 5 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم .
ومن المزايا المهمة لطريقة ميكروفلويديك هو القدرة على الاستخدام المتواصل التصوير عالية الدقة. لرصد التغييرات في مورفولوجية الميتوكوندريا كخلايا العمر، تم إجراء تجربة الشيخوخة مع BY4742 خلايا الخميرة معربا عن ILV3-GFP، ويستهدف أن الميتوكوندريا. الشكل 4 يعطي لمحة عامة عن مورفولوجيا الميتوكوندريا لنفس مجموعة من الخلايا في أعمار مختلفة تنسخي ( 0 براعم، براعم 10 وقبل وفاته). التغييرات التشكل ينظر في الخلايا منتصف العمر تشبه تلك التي ذكرت فيالأدب قبل 10. على الرغم من أن في هذه التجربة ممثل خاص، كان معدل تدفق المتوسطة يست الأمثل وتم الإبقاء على الخلايا الوليدة مع وتيرة عالية نسبيا على النقيض من فيلم 1، كانت نوعية التجربة لا تزال كافية لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الفردية 49 على ما لديهم كامل العمر.
فيلم 2 فيلم الوقت الفاصل بين واحد BY4742 خلية الخميرة معربا عن ILV3-GFP، والذي يستخدم لتصور الميتوكوندريا. وقد أخذت صور كل 30 دقيقة. كل من brightfield فضلا عن الصور GFP تم تصحيح الخلفية قبل دمج القناتين في صورة واحدة باستخدام يماغيج. شريط النطاق، 5 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم .
تينلدى عودتهم 1. نظرة عامة التخطيطي للإعداد ميكروفلويديك. الفرق بين ارتفاع micropad PDMS وغطاء زجاجي يشبه القطر من خلية الخميرة (حوالي 3-4 ميكرون). التحميل: يتم تحميل خلايا الخميرة تحت micropads PDMS. زراعة: التدفقات المتوسطة الطازجة بشكل مستمر على مدى الخلايا المحاصرين (السهم الأزرق). تشريح: يتم مسح الخلايا الوليدة الناشئة بعيدا عن تدفق المتوسطة (البرتقالي سهم).
الشكل 2. توضيح تخطيطي لتصميم قناة للرقاقة ميكروفلويديك. A. الدوائر السوداء تشير إلى موقع ثقبا في نهاية مدخل، مخرج والجانب القناة. B. التدفقات المتوسطة من خلال قناة مدخل (10 ميكرولتر / دقيقة) والمخارج عبر قناة الجانب الأكبر (برتقالي سهم). ليس هناك تدفق من خلال قناة منفذ، بسبب الفرق بين المقاومة رانه الجانب وقناة منفذ. C. يتم تحميل الخلايا في رقاقة (السهم الأسود) عن طريق قناة منفذ. يتم تقليل تدفق من خلال القناة الجانبية إلى 0.5 ميكرولتر / دقيقة D: بعد التنظيف القناة الجانبية، يتم حظر قناة الجانب والمتوسطة يبدأ في التدفق على الخلايا محاصرين تحت micropads (1-5 ميكرولتر / دقيقة).
الشكل (3). لا منحازة جار الخلية على رقاقة نحو سن خلية معينة. وصفت في منتصف الأسي YSBN6 WT ثقافة (10 7 خلية / مل) مع WGA-FITC (2 ميكرولتر من 5 ملغ / مل محلول المخزون في 10 6 خلايا) لل 1.5 ساعة. ومن ثم وضعت الخلايا على شريحة زجاجية أو تحميلها في رقاقة ميكروفلويديك. وأدلى المداخن Z (Z-15 شرائح في مسافة 0.8 ميكرومتر) على الطول الموجي الإثارة من 470 نانومتر باستخدام المياه التكبير 63X الهدف الغمر. عدد الندوب برعم على كلكان يحسب الخلية يدويا. تم تحديد ندبات برعم من 75 خلايا في الثقافة و79 الخلايا في رقاقة ميكروفلويديك.
الشكل 4. أمثلة على منحنيات العمر الافتراضي التي تم الحصول عليها لBY4741 WT (ن = 76)، sir2 Δ (ن = 63) وfob1 Δ (ن = 58) باستخدام جهاز ميكروفلويديك الموصوفة هنا. كل من عمليات الحذف يكون قويا، ولكن العكس، تأثير على قياسها متوسط عمر تنسخي من خلايا الخميرة. لكل تجربة، كانت تزرع سلالات بين عشية وضحاها في YPD المتوسطة إلى مرحلة ثابتة وسمح بعد ذلك لاستئناف النمو الأسي من قبل التخفيف إلى المتوسطة YPD الطازجة والحضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 3 دقائق قبل بدء التجربة. تم الحصول على البيانات من لي وآخرون. 4.
الشكل 5. مورفولوجيا الميتوكوندريا بوصفها وظيفة من العمر ج: هناك مثال ممثل التغيرات المرتبطة بالسن في التشكل الميتوكوندريا في خلية واحدة (السهم الأبيض). يتم تحجيم كل الصور مماثل. شريط النطاق، 5 ميكرون B:. الأشكال التضاريسية الميتوكوندريا لوحظ في مجموعة من 49 خلايا قبل إنتاج أول برعم من (0)، بعد 10 براعم (10) وقبل وفاته (†). يتم تضمين سبيل المثال صورة من كل فئة التشكل. تم الحصول على البيانات المقدمة خلال تجربة واحدة، وكان يستخدم نفس مجموعة من الخلايا لتصبح النتيجة التشكل في كل نقطة زمنية. وكانت تصور الميتوكوندريا في سلالة BY4742 معربا عن إصدار GFP الموسومة من البروتين الميتوكوندريا ILV3 (تم الحصول عليها من قاعدة البيانات جمع GFP 15). كل من brightfield فضلا عن الصور GFP تم تصحيح الخلفية قبل دمج القناتين في صورة واحدة باستخدام يماغيج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة ميكروفلويديك الموصوفة هنا هو أداة هامة في رواية الشيخوخة البحوث، لأنها تتيح الجيل بسيطة ومؤتمتة من الخميرة تنسخي البيانات العمر في تركيبة مع استمرار ارتفاع القرار التصوير. هذه الصفات هي تحسينات كبيرة على مدى الإمكانات التجريبية للطريقة تشريح الكلاسيكية، ولكن هناك عدد قليل من القيود من الطريقة التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار.
علما أن تحديد عمر تنسخي يمكن أن تتأثر كفاءة الإبقاء على الخلايا الأم: كل خلية أبقى تحت micropad لديه احتمال معينة لتغسلها من رقاقة (مثل الخلية في مهدها من زنزانة مجاورة يمكن أن يدفع به بعيدا عن وmicropad). احتمال متكاملة من خلية لتغسلها يزداد مع زيادة العمر. وبالتالي، فمن المرجح أن الخلايا لم يدم طويلا إكمال دورة حياتها قبل أن يتم غسلها بعيدا من خلايا طويلة الأمد. حقيقة ان لى مماثلة تم إنشاء البيانات fespan مع الإعداد ميكروفلويديك 4 كما هو الحال مع الأسلوب الكلاسيكي تسليخ مجهري 11-13 يشير إلى أن هذه المسألة المحتملة طفيفة فقط، إن لم يكن غير ذي صلة.
ومن المهم أن نلاحظ أنه مع الإعداد ميكروفلويديك أنه ليس من الممكن تحديد الخلايا ابنة عذراء في بداية التجربة، على النقيض من أسلوب تشريح الكلاسيكية. ومع ذلك عند تحميل الخلايا من ثقافة السائل المتنامية باطراد في رقاقة، والغالبية العظمى من الخلايا المحملة يولدون حديثا أو صغار السن نسبيا (أي حوالي 54٪ من الخلايا أبدا المبرعمة قبل وحوالي 27٪ مرة واحدة) 14. وهذا يعني أن يتم التقليل من قبل أعمار 1-2 أجيال على الأكثر. في حالة استثنائية أن الهيكل العمري للسكان الخلية يتم تبديل بشكل ملحوظ، فمن الممكن لإثراء السكان الخلية للبنات عذراء قبل التحميل، مثلا عن طريق الطرد المركزي المتدرج أو تصويل.
ntent "> رقاقة ميكروفلويديك يمكن من حيث المبدأ أن تستخدم لدراسة سلالات الخميرة فرداني في وسائل الإعلام ثقافة مختلفة. ومع ذلك، سلالات الخميرة مختلفة و / أو وسائل الإعلام قد تتطلب بعض التحسين من معدل تدفق للسماح الاحتفاظ كفاءة من الخلايا الأم. كما يتم الاحتفاظ الخلايا استنادا على حجمها، فإنه ليس من الممكن لتحميل سلالات الخميرة التي هي أكبر بكثير أو أصغر من ميكرون في القطر 3-4، مثل خلايا الخميرة مضاعفا. ومع ذلك من خلال إنتاج رقاقة مع مقاومات الضوء مختلفة، ويمكن أن تتولد رقائق ميكروفلويديك مع تباعد مختلفة بين الغطاء الزجاجي وmicropads للسماح التحميل من هذه الخلايا الحجم بشكل مختلف.على الرغم من أن بروتوكول المعروضة هنا يصف كيفية صنع رقاقة مع قناة واحدة، فمن الممكن لإضافة قنوات متعددة في شريحة واحدة وتشغيل التجارب المتوازية في نفس الوقت. اعتمادا على عدد من القنوات المطلوب في شريحة واحدة، قد يكون من الضروري إنشاء رقاقة تكييفها التي متباعدة القنواتمعا على نحو أوثق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
ونود أن نشكر Schippers لورا لكتابة النسخة الأولى من بروتوكول التحميل الخليوي وماركوس دي Goffau وجيلي Zampar لتسجيل الأشكال التضاريسية الميتوكوندريا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E | |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
