Summary
Kv ערוץ התפקוד קשור הפרעות בקצב לב. על מנת לחקור את המנגנונים המולקולריים שיובילו להפרעות קצב כאלה אנו מנצלים פרוטוקול שיטתי לבידודה של cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים מעכברי KV ערוץ נלווה למקטע בנוקאאוט. cardiomyocytes המבודד יכול מייד לאחר מכן לשמש למחקרים אלקטרו סלולריים, (IF) מבחנים ביוכימיים או immunofluorescence.
Abstract
גני KCNE לקודד למשפחה קטנה של יחידות משנה נלווית ערוץ KV היוצרים קומפלקסי heteromeric עם יחידות משנת KV ערוץ אלפא לשנות את המאפיינים התפקודיים שלהם. מוטציות בגני KCNE כבר נמצא בחולים עם הפרעות בקצב לב, כגון תסמונת QT הארוכה ו / או פרפור פרוזדורים. עם זאת, הפתופיזיולוגיה המולקולרית המדויקת המובילה למחלות אלה נותרת חמקמקה. במחקרים קודמים את תכונות אלקטרו של המחלה גורמת למוטציות בגנים אלו בעיקר נחקרו במערכות ביטוי Heterologous ואנחנו לא יכולים להיות בטוחים אם ניתן לתרגם ישירות את ההשפעות שדווחו לcardiomyocytes ילידים. במעבדה שלנו ולכן אנו משתמשים בגישה שונה. אנחנו ישירות לחקור את ההשפעות של מחיקת גן KCNE בcardiomyocytes המבודד מעכברים בנוקאאוט על ידי סלולרי electrophysiology - טכניקה ייחודית שאנו מתארים בגיליון זה של כתב העת של ניסויים באופן חזותי. את הלב מGeneticaעכברים מהונדסים KCNE lly נכרתו במהירות ומותקן על גבי מכשיר Langendorff ידי cannulation אב עורקים. Ca 2 + חינם בשריר הלב, כבול בEGTA, וניתוק של myocytes הלב ואז הושג על ידי זלוף המדרדר של עורקים הכליליים עם התמחה נמוך Ca + 2 collagenase חיץ המכיל. אטרייה, קיר חופשי חדרית ימין והחדר השמאלי ואז יכולה להיות מופרדת על ידי טכניקות מייקרו. אז סיד חוזר ומוסיף לאט לcardiomyocytes המבודד בצעד מרובה הכולל הליך כביסה. cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים של מראה בריא ללא התכווצויות ספונטניות האז העביר מייד לניתוחים אלקטרופזיולוגים ידי טכניקת תיקון מהדק או ניתוחים ביוכימיים אחרים בתוך 6 השעות הראשונות שלאחר בידוד.
Protocol
1. הרדמת בעלי חיים וקצירת איברים
- לטשטש את העכבר באמצעות זריקת intraperitoneal (IP) של קטמין (200 מ"ג / קילו BW) וXylazine (20 מ"ג / קילו BW).
- לanticoagulate להזריק IP הפארין 250 יחב"ל כדי למנוע היווצרות קרישי דם וקרישים.
- חכה עד ההרדמה עמוקה הוא הגיע, אשר מאופיינת על ידי areflexia. כדי לבדוק areflexia רפלקס, בדיקת קרנית על ידי נגיעה בקרנית או רפלקס טיסת ניסוי על ידי צביטת זנב בעדינות.
- העבר את העכבר על שולחן ניתוחים ולתקן אותה במצב שכיבה.
- חתוך העור וקיר הבטן מתחת xiphoid ולבצע פתיחת בית חזה צדפה: הארך את הקיצוץ לשני הצדדים לאורך קשת costal ולאחר מכן לחתוך את הצלעות בקו בית השחי המדיאלי, להסיט את בית החזה כלפי מעלה.
- פתח קרום לב, אתר כולים נהדרים. לחץ בעדינות על זנב לב טוב יותר כדי להציג את אב העורקים. מהדק את אב העורקים באמצעות מלקחיים.
- הנח את הלב בקעירות זוג של cissors וינתח את כל כלי חיבור עם חתך אחד אחד. הקפד לשמור על חלק גדול מספיק של אב עורקים עולים לcannulation Langendorff.
- להעביר מייד ללב שחוט צלחת פטרי מלא בקרח קר ופתרון מראש חומצן 1 (לפתרונות, ראה טבלת 1).
2. הכנת זלוף לב וLangendorff
- Cannulate אב העורקים עם צינורית פלדת 1.8F. הקפד להימנע מתסחיף אוויר.
- לקבע אב עורקים בצינורית עם תפר כירורגית והתקפי לב, מפוצץ ב1 מ"ל של פתרון 1.
- חבר צינורית עם מנגנון Langendorff.
- ודא זמן מפתיחת בית החזה לcannulation Langendorff אינה עולה על 120 שניות כדי למנוע פציעה ממושכת איסכמיה / reperfusion לשריר הלב.
- לב ינקב עם 10 מ"ל של Ca 2 + ללא פתרון 2 (4 מ"ל / דקה).
- לב ינקב עם פתרון collagenase 3 דקות ל8 (4 מ"ל / דקה).
- לב העברה לתוך צלחת שחוממה מראש 100-מ"מ פטרי המכיל Ca 2 הנמוך פתרון + 4.
- מוציא בזהירות את אב עורקים ורקמות אחרות שאינן לבביות עם מספריים והשליכו אותו.
- אטרייה נפרדת וחדרי לב ולהמשיך בכל תא בנפרד. שמור על תאים שקועים בפתרון 4. השתמש בכמויות קטנות (פחות מ 5 מ"ל).
4. דיסוציאציה נוספת של cardiomyocytes
- cardiomyocytes פרוזדורים:
- כדי לייחד cardiomyocytes פרוזדורים להעביר אטרייה לתוך צלחת תרבות נפרדת מראש מחוממת 100-מ"מ ולנתק את הרקמה באמצעות משייכתו בעדינות אותו לגזרים עם מלקחיים עדינים. ודא ניתוק כמעט מוחלט של הרקמה.
- השתמש פיפטה 1 מ"ל עם קצה מוגדל אש מלוטשת פיפטה פלסטיק להשעות את התאים ב1 מ"ל של פתרון 5 למשך 5 דקות.
- הפרד את התאים מפסולת באמצעות מסנן תא (200 מיקרומטר גודל רשת). <li> הוסף פתרון 5 מ"ל 5 עד השעית התא וצנטריפוגה עבור 2 דקות בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר.
- השלבים הבאים פעלו תחת מכסה מנוע תרבית תאים. בטל supernatant מחדש הושעה-גלול ב 5 מ"ל של פתרון 6.
- לאחר שקיעה על ידי כוח הכביד למשך 10 דקות בצינור מ"ל 15, סרכזת לדקות 1 בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר. הסר את supernatant. Re-להשעות התאים בהתאם לכמותם ב1-5 מ"ל של פתרון 6.
- לנתח את אזור החדר השמאלי של עניין עם מלקחיים עדינים ב5 מ"ל של פתרון 4.
- להשעות את תאים על ידי pipetting בעדינות עד שרוב התאים המופרדים. להעביר את פתרון התא לאחר הסינון (200 גודל רשת מיקרומטר) לתוך צינור מ"ל 50, להוסיף נפח של 25 מ"ל.
- צנטריפוגה עבור 2 דקות בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר.
- השלבים הבאים פעלו תחת מכסה מנוע תרבית תאים. הסרת supernatant, מחדש להשעות הגלולה ב 25 מ"ל שלפתרון 6 ולאפשר שקיעה של התאים למשך 10 דקות.
- ספירת התאים ולהסיר את supernatant, להוסיף 25 - 50 מיליליטר פתרון 6 בתאים.
5. הכנת cardiomyocytes לאלקטרופיזיולוגיה הניידת, או אם מחקרים ביוכימיים
- ללימודי electrophysiology, לשמור על myocytes בפתרון 6 בצינור מ"ל 50 ומעכב את השקיעה.
- למחקרים ביוכימיים, הדמית סיד למשל, myocytes צלחת על צלחת תרבות laminin מצופית תא (20 מיקרוגרם / המ"ל laminin ב PBS ריכוז סופי).
- להכתמת immunofluorescence להכין צלחת צלחת תרבית תאים עם תלושי כיסוי זכוכית ומצופית בפתרון laminin (ריכוז סופי 50 מיקרוגרם / המ"ל laminin ב PBS).
- הסר את הפתרון לפני myocytes ציפוי. פלייט התאים ולשלוט בצפיפות התאים באמצעות מיקרוסקופ.
- תן myocytes לדבוק לכסות להחליק לשעת 1 ב 37 ° C ב2% CO 2, להסיר את הפתרוןולהתחיל מייד בפרוטוקול הליך הכתמה סטנדרטית.
- דגירה עם מקבע, למשל 4% PFA ב PBS (pH 7.5) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ופעל עם שלושה שלבי כביסת PBS עבור 5 דקות כל אחד.
- לpermeabilize התאים ולעכב נוגדן מחייב נוקב דגירת myocytes עם סרום 10%, טריטון 0.3%, 0.2% BSA ב PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- דגירה עם הנוגדן הראשוני לשעה 1 ב 37 ° C ולשטוף כפי שתואר קודם לכן.
- דגירה עם הנוגדן המשני לשעה 1 בטמפרטורת חדר. לcounterstain גרעינים וα-actinin השימוש DAPI וphalloidin מצומדת fluorochrome (אלקסה פלואוריד 488, Invitrogen).
- לאחר שטיפה, להעביר את כיסוי הזכוכית מחליק בזהירות על שקופיות מיקרוסקופ silane טופלו ותאים להטביע בהרכבה בינונית פלואורסצנטי.
6. הנייד אלקטרופיזיולוגיה
- לבצע הקלטות כל תא תיקון-מהדק בfreמבודד cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים shly בטמפרטורת חדר.
- העברת cardiomyocytes מופיע בריא לתא זלוף מלא בנפח מוגדר של פתרון אמבטיה תאית. 117 mM NaCl, 4 המ"מ KCl, 1 mM KH 2 4 ת.ד., 4 המ"מ 3 NaHCO, 1.7 המ"מ MgCl 2, 3 המ"מ CoCl 2, 10 HEPES מ"מ, גלוקוז 10 מ"מימ, וTetrodotoxin 0.02 מ"מ (TTX), (pH 7.4) . השתמש NaOH להתאמת ערך ה-pH.
- השתמש בציוד מהדק תיקון ראוי (IX71 מיקרוסקופ כלומר הפוך, מגבר 700B Multiclamp, מערכת Digidata 1440A רכישה ומחשב עם pClamp10.3 תוכנה (התקנים מולקולריים)).
- השתמש pipettes תיקון עם התנגדויות של 3-5 MΩ כאשר התמלא פתרון תאי המכיל 130 מ"מ KCl, 2 המ"מ MgCl 2, HEPES 11 מ"מ, 11 המ"מ EGTA, 5 המ"מ Na 2 ATP, 0.4 המ"מ Na 2 GTP, 5 מ"מ Na 2 CP ו -4.9 mM CaCl 2 (pH 7.2). השתמש KOH להתאמת ערך ה-pH.
- לעורר החוצה K + זרמי duצעדי טבעת 4.5-sec מתח לבחון פוטנציאלים בין -60 ו50 mV במרווחי 10-MV מפוטנציאל החזקת -70 mV לאחר 20-msec prepulse לmV -40.
- ודא זרמי דליפה תמיד <100 הרשות פלסטינית.
- לנתיחה של K + זרמים השונות להשתמש במעכבים ספציפיים כמו 4-aminopyridine (4-AP: Biomedicals ICN, אירווין, קליפורניה, ארה"ב), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) או Tetraethylammonium (תה; סיגמא). פתרוני מניות צריכים להיות מוכנים בפתרון אמבטיה תאי, ולהחיל ישירות על הסביבה הקרובה ביותר האפשרית של התא דרך microtip לאחר הקלטות "בסיסיות". האיזון צריך להיות מותר ל2-3 דקות לפני הקלטות "סמים".
- לניתוח לנרמל אמפליטודות נוכחית בתאים בודדים לגודל תא (קרום קיבול כל תאים). לנתח נתונים מחוברים באמצעות pClamp10.3 תוכנה (התקנים מולקולריים) או תוכנה דומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידוד של cardiomyocytes Murine הבוגר מעכברים מהונדסים גנטי כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים של עניין במבחנה הפך לכלי רב עצמה עוד יותר להבין פתופיזיולוגיה לב. שיטה זו משמשת כיום על ידי מספר קטן, אך גדל רק במעבדות מדע בסיסיות ברחבי העולם. עם זאת, בידוד של cardiomyocytes Murine חדרית בוגרים יכול להיות מסובך וצריך להיעשות ביסודיות ושוב ושוב על ידי ידות מנוסות. איור 1 מציג cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים מבודדי מופת טריה. לcardiomyocytes חדרית אנו ממליצים להשתמש myocytes בצורת מוט, מפוספס חדרית של מראה בריא רק ללא צירים ספונטניים. לעומת myocytes חדרית, myocytes פרוזדורים הם קצרים ודקים יותר. התלמים האופייניים ומוט צורת cardiomyocytes חדרית חסרים בcardiomyocytes Murine פרוזדורים בוגרים. התשואה לcardiomyocytes חדרית מבודדתמלב שלם הוא עכבר 5x10 5 - 1x10 6. לcardiomyocytes פרוזדורים הוא באופן משמעותי פחות. בדרך כלל אנו מצפים לבודד כ 5 - 25000 תאי פרוזדורי לב מעכבר אחד. בודד פעם, cardiomyocytes יכול להיות נתונה לשונה בטכניקות מבחנה כולל הקלטות אלקטרופזיולוגים (איור 1). אנו ממליצים להשתמש cardiomyocytes המבודד בתוך 6 השעות הראשונות לאחר בידוד. איור 1 מציג הקלטות מופת KV ערוץ חיצוניות (בצד ימין) של שריר לב פרוזדורים וחדרים שהומצא על ידי שלילת קוטביות צעדים שונים על ידי טכניקת מהדק תיקון כל התאים. הצורה האופיינית לעכבריים חדרית המבוגרת וערוץ KV פרוזדורי repolarizing זרמים ניתן לראות לאורך מסלול זמן מוגדר (כאן 4 שניות, איור 1). שים לב שמשרעת הנוכחית היא נמוכה באופן משמעותי בcardiomyocytes פרוזדורים המבוגרים העכברי לעומת cardiomycytes חדרית.
| פתרון | תוכן (במ"מ, אם לא צוין אחר) |
| 1 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, 1 KH 2 4 ת.ד., 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 גלוקוז |
| 2 | 117 NaCl, KCl 4, 10, 1 HEPES KH 2 4 PO, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 + גלוקוז 229.5 מיקרומטר EGTA |
| 3 | 117 NaCl, KCl 4, 10, 1 HEPES KH 2 4 PO, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 גלוקוז, CaCl 2 0.1 + 0.8 גר '/ סוג L collagenase 2 (300 U / L) * |
| 4 | 117 NaCl, KCl 4, 10, 1 HEPES KH 2 4 PO, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 גלוקוז, CaCl 2 0.2 + 0.8 גר '/ סוג L collagenase 2 (300 U / L) * + BSA (1 גר' / L) |
| 5 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, 1 KH 2 4, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 גלוקוז, CaCl 2 0.5 + BSA (1 גר '/ ל') |
| 6 | 117 NaCl, KCl 4, 10, 1 HEPES KH 2 4 PO, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 גלוקוז, CaCl 2 1.0 + BSA (1 גר '/ ל') |
טבלת 1. פתרוני בידוד. מתאזנים למשך 10 דקות עם Carbogen (95% O 2, 5% CO 2), על 37 מעלות צלזיוס pH = 7.4 (NaOH). * פעילות יכולה להיות תלויה במספר יצווה, הבדיקה קודמת ולכן פעילות collagenase מומלצת.
איור 1 שמאלי עליון:. מוכתם cardiomyocyte חדרית מופת עם DAPI (גרעינים, כחול) וקמח Alexa 488 Phalloidin (α-actinin, ירוק) ימניות עליונות:. עקבות מופתיות של מהדק תיקון תא שלםהקלטה שמאלית תחתונה:.. מוכתם cardiomyocyte פרוזדורי מופת עם DAPI (גרעינים, כחול) וPhalloidin מצומדת fluorochrome (α-actinin, ירוק) תחתונה ימנית: עקבות מופת של הקלטת מהדק תיקון תא כולו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם ההתפתחות הגוברת של זני עכבר מהונדס גנטי כדי ללמוד תפקוד לב ולב הפתולוגיה הקשור למחיקת גן יש גם עניין גובר בשיטות מיוחדות כדי ללמוד השפעות של מחיקת הגן הספציפית במבחנה. במעבדתנו אנו לומדים את התפקידים של משפחה של תת יחידות עזר ערוץ KV על repolarization לב. גני KCNE מהווים משפחה של 5 גנים (KCNE1-5) שממלאים תפקידים חשובים בחדרית האנושית וrepolarization פרוזדורי 11, 15. KCNEs הם יחידות בודדות הטרנסממברני תחום KV ערוץ עזר שאינו עוברים כל זרמי אשלגן בעצמם, אבל הם יכולים יצירת קומפלקסים עם תת יחידות אלפא ערוץ KV ולווסת את התכונות הפונקציונליות שלהם כגון gating, מוליכות, פרמקולוגיה וסחר בתוך התא באופן משמעותי. מוטציות ופולימורפיזמים נפוצים בKCNE2 לדוגמה קשורות בירושה ונרכשה צורות oו לונג תסמונת QT (LQTS) 1, 16.
עבודתו החלוצית בבידוד ואפיון של תת יחידות שונות אלקטרו KV ערוץ אלפא ותרומתן לחולדה אלא גם חדרית העכברית וrepolarization פרוזדורים נעשתה על ידי הקבוצה של ד"ר Nerbonne באוניברסיטת וושינגטון, סנט לואיס ב1990 3, 5, 7. עם זאת, באופן משמעותי פחות ידוע על תרומתו של תת יחידות KV ערוץ נלווה לrepolarization פרוזדורים וחדרים בתוך מכרסם שריר הלב. KCNEs בעיקר נחקר במערכות ביטוי Heterologous כגון תאי CHO וביציות Xenopus laevis. באמצעות יחידות משנת KCNE שיטות אלו הוכחו להיות מופקרים ביותר ביצירת מתחמי ערוץ KV heteromeric זיהוי מגוון יחידות שונות KV ערוץ אלפא כשותפים פוטנציאליים לKCNEs 10. עם זאת, אנחנו לא יכולים להיות בטוחים אם אלה ספציפיים heteromeric KV הערוץ משליםXES להתרחש גם בcardiomyocytes דובר או אם השותפויות הנצפות heteromeric KCNE KV ערוץ אלפא למקטע הן Heterologous חפצי ביטוי 1. לפיכך, אנו מאמצים את פרוטוקולי הקלטת ערוץ KV מNerbonne מעבדת טכניקת הבידוד ושינינו אותם כמצוין בסעיף הפרוטוקול של מאמר זה לנתח את הערוצים השונים בKV repolarization העכברי, אשר נשלטים על ידי גני KCNE. שימוש בגישה זו מצאנו לאחרונה כי למקטע עזר ערוץ KV KCNE2 שולט שני זרמים נפרדים בKV העכברי חדרית שריר הלב (אני Kslow, 1 ואני ל, ו). על ידי יישום של מעכבים ספציפיים לערוצי אשלגן שונים הצלחנו להראות כי מחיקה של הגן העכברי KCNE2 גורם לירידה משמעותית בשני Kv1.5 וKv4.2 זרמים 14. הרגולציה של Kv1.5 ידי KCNE2 לא הייתה ידועה קודם, wheרגולצית reas של Kv4.2 ידי KCNE2 כבר הוכיח במבחנה על ידי ביטוי במחקרי Heterologous 20.
פרפור פרוזדורים (AF) הוא ההפרעה בקצב הלב המתמשכת השכיחה ביותר בפרקטיקה קלינית וקשור בתחלואה משמעותית ותמותה 4. מוטציות בכל KCNEs השונה לאחרונה קשורות עם פרפור פרוזדורים בבני אדם. לאחרונה, שתי מוטציות אינן נרדפות נמצאו בKCNE1 בחולים עם פרפור פרוזדורים, שלא היו נוכחים בקבוצת הביקורת (אולסן et al., 2012). מכאני, ביטוי במחקרים זיהו השפעת Heterologous רווח-of-פונקציה בKCNQ1 זרמים כמנגנון הבסיסי הסביר. יתר על כן, לאחרונה התברר כי KCNE1 - / - עכברים סובלים מאפיזודות ספונטניות של 17 AF ההתקפי. במחקר שבדק 28 משפחות סיניות שאינן קשורות עם AF הבודד, יאנג et al. זיהה מוטציה בKCNE2,שהביא להחלפת ארגינין לציסטאין (R27C). ניתוח פונקציונלי של ערוץ מוטנטי בביטוי במחקרי Heterologous חשף השפעת רווח-of-פונקציה בKCNQ1 ערוצים (אני Ks) 18. עם זאת, יכול גם KCNE2 יצירת קומפלקסים עם מגוון של KV ערוץ אחר α-יחידות משנה כולל Kv1.5, שגם היה מעורב בפרפור פרוזדורים. אנחנו הראינו לאחרונה שKCNE2 יכול לווסת Kv1.5 זרמים בחדר הלב העכברי שהוביל להארכת APD חדרית ב15 עכברים. לכן, שיבוש Kv1.5 זרמי פרוזדורים על ידי תפקוד KCNE2 יכול גם לייצג את המנגנון הבסיסי arrhythmogenic לפרפור הפרוזדורים בKCNE2 - / - מודל עכבר ו / או בחולי מחסה מוטציה בKCNE2 הסובלים מפרפור הפרוזדורים. מוטציות בKCNE3 גם זיהו לאחרונה בחולה עם עדשה משפחתית 8. הקלטות חשפו אלקטרו increפעילות ased של Kv4.3/KCNE3 וKv11.1/KCNE3 נוצרה זרמים ידי המוטציה, ובכך מקנה רגישות של נישאי מוטציה לrepolarization לב מהר יותר פוטנציאל פעולה ולכן פגיעות לאדוות מחדש נכנסה בפרוזדורים. מוטצית KCNE3 V17M missense אולם לא הייתה השפעת KCNE3/KCNQ1 זרמים למרות שKCNE3 צורות מתחמים פונקציונליים עם KCNQ1 בשריר הלב. יתר על כן, KCNE3 לאחרונה הוכח להיות מוסדר באוכלוסייה אנושית עם valvular AF התומך בהשערה שKCNE3 משחקת תפקיד לא רק בעדשה משפחתית אלא גם valvular 6 פרפור פרוזדורים. לאחרונה, פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד (G / T) זוהה בKCNE4 כתוצאה מחומצה גלוטמית (Glu, E) / חומצה אספרטית (Asp, D) החלפה במיקום של 145 KCNE4 פפטיד 19. לאחר ניתוח פונקציונלי של פולימורפיזם זה גילה כי KCNE4 פולימורפיזםמפעיל את ההשפעה של "רווח של פונקציה" על KCNQ1 ערוצים 9. שוב, מחקרים אלו בוצעו במערכות הביטוי Heterologous וראיות ניסיוניות מcardiomyocytes ילידים עדיין חסרה. לאחרונה, במקרה שאינו משפחתי מבודד של AF עם מוטצית missense (L65F) זוהה במדגם דני של 158 חולים עם פרפור פרוזדורים 12. יתר על כן, פולימורפיזם בKCNE5 (C97T) זוהה באותה אוכלוסיית מחקר, שהיה קשורה לסיכון גבוה יותר לפיתוח AF 13. אינטראקציה של שניהם מוטצית β-יחידות משנה (KCNE2 וKCNE5) עם ערוץ KCNQ1 הופקה השפעת רווח-of-פונקציה עם זרמי IKS מוגברים. KCNQ1 α-המקטע של ערוץ IKS יכול לקשר עם כל אחד מאבזר β-5 יחידות משנה (KCNE1-5). לכן KCNQ1 נראה מועמד סביר השותף α-מקטע כאשר מחפשים מצע המולקולריn פתוגנזה של KCNE הקשורים פרפור פרוזדורים. עם זאת, בהתחשב בהפקרות הבולטת של יחידות משנת KCNE מטרות מולקולריות אחרות אפשריות ואנחנו מתכוונים לכך באופן ספציפי לחקירת KCNE / KV אינטראקציות אפשריות האלה אלפא למקטע. מחקרים במעבדה שלנו ולכן גם מכוונים כעת על מנת להבהיר את המנגנונים מאחורי KCNE הקשורים AF ניצול הטכניקה שאנו מתארים במאמר זה - הבידוד של cardiomyocytes פרוזדורי Murine ולאחר מכן בהקלטות אלקטרו מבחנה עם יישום של מעכבים ספציפיים ליחידות משנת אלפא ערוץ KV שונות ו ניתוחים ביוכימיים של cardiomyocytes ילידים מעכברי נוקאאוט KCNEx.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), פריץ תיסן-Stiftung וCharité / MDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrodotoxin | Alomone | ||
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals | ||
| Heteropodatoxin 2 | Alomone | ||
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington |
References
- Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs? Circ. Res. 88, 981-983 (2001).
- Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia. Cell. 97, 175-187 (1999).
- Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels? Circ. Res. 77, 361-369 (1995).
- Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study. Circulation. 98, 946-952 (1998).
- Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes. J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).
- Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation. Circulation. 112, 471-481 (2005).
- Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes. J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).
- Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation. Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).
- Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism. Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).
- McCrossan, Z. A., Abbott, G. W.
- Pongs, O., Schwarz, J. R. Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels. Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).
- Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).
- Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation. Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).
- Roepke, T. K., Abbott, G. W. Pharmacogenetics and cardiac ion channels. Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).
- Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f). FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).
- Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).
- Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M.
- Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation. Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).
- Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. [The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese]. Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).
- Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ. Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).
