Summary
Kv canal disfunção está associada a arritmias cardíacas. Para estudar os mecanismos moleculares que conduzem à ocorrência de arritmias tais que utilizam um protocolo sistemático para o isolamento dos cardiomiócitos atriais e ventriculares do canal Kv auxiliares ratinhos knockout de subunidade. Cardiomiócitos isolados podem então ser imediatamente utilizados para celulares estudos eletrofisiológicos, bioquímicos ou imunofluorescência (IF) ensaios.
Abstract
KCNE genes codificam para uma pequena família de subunidades de canais Kv auxiliares que formam complexos heteroméricos com subunidades alfa dos canais Kv para modificar as suas propriedades funcionais. Mutações em genes KCNE foram encontrados em pacientes com arritmias cardíacas, tais como a síndroma de QT longo e / ou fibrilação atrial. No entanto, a fisiopatologia molecular preciso que conduz a estas doenças permanece elusiva. Em estudos anteriores, as propriedades eletrofisiológicas da doença que causa mutações nestes genes têm sido mais estudada em sistemas de expressão heterólogos e não podemos ter certeza se os efeitos relatados podem ser diretamente traduzidos em cardiomiócitos nativos. Em nosso laboratório, portanto, usar uma abordagem diferente. Nós estudar diretamente os efeitos da KCNE deleção do gene em cardiomiócitos isolados de camundongos knockout por eletrofisiologia celular - uma técnica única que descrevemos nesta edição do Jornal de Experimentos visualizado. Os corações de geneticaratinhos KCNE lly modificadas são rapidamente excisado e montado num aparelho de Langendorff por canulação. Grátis Ca 2 + no miocárdio está vinculado por EGTA, e dissociação de miócitos cardíacos é então obtida por perfusão retrógrada das artérias coronárias com um baixo Ca 2 especializado colagenase tampão contendo +. Átrios, parede livre do ventrículo direito e no ventrículo esquerdo pode, então, ser separados por técnicas microcirúrgicas. O cálcio é então adicionado lentamente de volta para cardiomiócitos isolados em um passo múltiplo compreendendo procedimento de lavagem. Cardiomiócitos atriais e ventriculares de aparência saudável sem contracções espontâneas são então imediatamente sujeitas a análises eletrofisiológicas pela técnica patch clamp ou outras análises bioquímicas dentro das primeiras 6 horas após o isolamento.
Protocol
1. Anestesia animal e extração de órgãos
- Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal (ip) de cetamina (200 mg / kg de peso corporal) e xilazina (20 mg / kg de peso corporal).
- Para anticoagulate injetar 250 ip UI de heparina para evitar a formação de coágulos sangüíneos e trombo.
- Espere até narcose profunda é atingido, o qual é caracterizado por arreflexia. Para verificar arreflexia reflexo teste, córnea por tocar suavemente a córnea ou reflexo voo de teste por beliscar a cauda.
- Transferir o mouse para mesa de operação e corrigi-lo em posição supina.
- Faça uma incisão na pele ea parede abdominal abaixo do xifóide e toracotomia garra: estender o corte para ambos os lados ao longo do arco costal e posteriormente cortado costelas na linha axilar média, desviar para cima da caixa torácica.
- Abra pericárdio, localizar grandes vasos. Pressione suavemente caudal coração, para melhor visualizar a aorta. Grampo da aorta com a pinça.
- Colocar o coração no concavidade de um par de s cissors e dissecar todos os navios de conexão com um único corte. Certifique-se de preservar uma parte suficientemente grande da aorta ascendente para a canulação Langendorff.
- Transferir coração excisado imediatamente para uma placa de Petri cheia de gelo frio e pré-oxigenado solução 1 (para soluções, ver Tabela 1).
2. Preparação de perfusão do coração e Langendorff
- Canular a aorta, com uma cânula de aço 1.8F. Certifique-se de evitar a embolia aérea.
- Fixar a cânula na aorta, com uma sutura cirúrgica e coronárias, lave com 1 ml de solução 1.
- Ligue cânula com um aparelho de Langendorff.
- Certifique-se de tempo a partir de toracotomia para canulação Langendorff não excede 120 s, para evitar lesão de isquemia / reperfusão prolongada para o miocárdio.
- Coração perfundir com 10 ml de solução de Ca 2 + 2 livre (4 ml / min).
- Coração perfundir com colagenase solução 3 para 8 min (4 ml / min).
- Transferir para um centro de pré-aquecido placa de Petri de 100 mm contendo Ca 2 + baixo solução 4.
- Remova cuidadosamente aórtica e outros tecidos não-cardíaca com tesoura e descartá-lo.
- Átrios e ventrículos separados e continuar com cada câmara separadamente. Manter as células imersas em solução 4. Use volumes pequenos (menos de 5 ml).
4. Dissociação adicional de cardiomiócitos
- Cardiomiócitos atriais:
- Para individualizar cardiomiócitos atriais transferir os átrios em um prato separado cultura pré-aquecido de 100 mm e dissociar o tecido através puxando-o distante com uma pinça fina. Assegurar uma dissociação quase completa do tecido.
- Usar uma pipeta de 1 ml com uma ponta de pipeta alargada fogo polida plástico para suspender as células em 1 ml de solução a 5 por 5 min.
- Separa-se as células a partir de detritos por meio de um filtro celular (200 malhagem jim). <li> Adicionar 5 ml de solução de 5 a suspensão de células e centrifugação durante 2 min a 16 xg à temperatura ambiente.
- Os passos seguintes são operados sob uma capa de cultura de células. Descartar o sobrenadante e re-suspensão do sedimento em 5 ml de uma solução de 6.
- Após a sedimentação por acção da gravidade, durante 10 minutos em um tubo de 15 ml e centrifugar durante 1 min a 16 xg à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante. Re-suspender as células, dependendo da sua quantidade em 1-5 ml de uma solução de 6.
- Dissecar a região ventricular esquerda de interesse com uma pinça fina em 5 ml de solução 4.
- Suspender as células por pipetagem suave até que a maioria das células são separadas. Transferir a solução de células após a filtragem (200 malhagem um) para um tubo de 50 ml, adicionar um volume de 25 ml.
- Centrifugar durante 2 minutos a 16 xg à temperatura ambiente.
- Os passos seguintes são operados sob uma capa de cultura de células. Remover o sobrenadante, re-suspender o sedimento em 25 ml desolução a 6 e permitir a sedimentação das células durante 10 min.
- Contar as células e remover o sobrenadante, adicionar 25-50 ml de solução 6 sobre as células.
5. Preparação de cardiomiócitos para celular Eletrofisiologia, Bioquímica ou se os estudos
- Para os estudos de electrofisiologia, manter os miócitos em solução a 6 num tubo de 50 ml e inibir a sedimentação.
- Para estudos bioquímicos, de imagem de cálcio, por exemplo, miócitos placa sobre placas de cultura de células revestidas de laminina (concentração final de 20 ug / ml de laminina em PBS).
- Para coloração por imunofluorescência preparar um prato de cultura de células da placa com lamelas de vidro e revestida com laminina solução (concentração final de 50 ng / ml de laminina em PBS).
- Remover a solução de revestimento antes de miócitos. Placa das células e controlar a densidade de células, usando um microscópio.
- Deixe os miócitos aderir a tampa deslizante, durante 1 hora a 37 ° C em 2% de CO 2, remover a solução dee começar imediatamente com um protocolo padrão de coloração procedimento.
- Incubar com fixador, por exemplo, PFA 4% em PBS (pH 7,5) durante 10 min à temperatura ambiente e seguir com três passos de lavagem com PBS durante 5 minutos cada.
- Para permeabilizar as células e para inibir a ligação do anticorpo não específico incubar os miócitos com soro a 10%, Triton 0,3%, BSA a 0,2% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
- Incubar com o anticorpo primário durante 1 hora a 37 ° C e lava-se, tal como descrito antes.
- Incubar com o anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. Para contracoloração os núcleos e α-actinina utilização DAPI e faloidina conjugada fluorocromo (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
- Após a lavagem, transferir a tampa de vidro desliza cuidadosamente sobre silano lâminas de microscópio tratados e células embed meio de montagem de fluorescência.
6. Eletrofisiologia celular
- Realize Whole-cell patch-clamp gravações em freshly isolado cardiomiócitos atriais e ventriculares, à temperatura ambiente.
- Transferir saudáveis cardiomiócitos que aparecem na câmara de perfusão preenchido com um determinado volume de solução de banho extracelular. 117 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 1 mM de KH 2 PO 4, 4 mM de NaHCO3, 1,7 mM MgCl 2, 3 mM de CoCl2, 10 mM de HEPES, 10 mM de glucose, e 0,02 mM de tetrodotoxina (TTX), (pH 7,4) . Use NaOH para ajuste a valor de pH.
- Use equipamento adequado de fixação adesivo (isto é, microscópio invertido IX71, um amplificador Multiclamp 700B, um sistema de aquisição de Digidata 1440A e PC com pClamp10.3 software (Molecular Devices)).
- Usar pipetas de remendo com resistências de 3-5 MQ quando preenchidos com a solução intracelular contendo 130 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 11 mM de HEPES, 11 mM de EGTA, 5 mM de Na 2 ATP, 0,4 mM de Na 2 GTP, 5 mM de Na 2 CP e 4,9 mM de CaCl 2 (pH 7,2). Use KOH para ajuste a valor de pH.
- Evoke exterior K + correntes dupassos do anel 4,5-sec tensão para testar potenciais entre -60 e +50 mV em incrementos de 10 mV a partir de um potencial de manutenção de -70 mV, depois de um 20-mseg prepulse mV para -40.
- Certifique-se de correntes de fuga são sempre <100 pA.
- Para dissecção de K + diferente correntes utilizar inibidores específicos, tais como a 4-aminopiridina (4-AP; ICN Biomedicals, Irvine, CA, EUA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) ou de tetraetilamónio (TEA, Sigma). As soluções-mãe devem ser preparados em uma solução de banho extracelular, e aplicado directamente na vizinhança mais próxima possível da célula através de um microtip depois "de base" de gravações. Equilíbrio deve ser permitida por 2-3 minutos antes de "drogas" gravações.
- Para a análise de normalizar as amplitudes de corrente nas células individuais de tamanho de célula (células inteiras capacitância de membrana). Analisar dados offline usando pClamp10.3 software (Molecular Devices) ou software comparável.
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Representative Results
Isolamento de cardiomiócitos murinos adultos de camundongos geneticamente modificados para estudar a função de genes específicos de interesse in vitro tornou-se uma ferramenta poderosa para entender a fisiopatologia cardíaca. Este método é usado atualmente por apenas um número pequeno mas crescente de laboratórios de ciências básicas em todo o mundo. No entanto, o isolamento dos cardiomiócitos do ventrículo adultos murinos pode ser complicado e precisa ser feito cuidadosamente e repetidamente por mãos experientes. Figura 1 mostra recém cardiomiócitos exemplares isolados atriais e ventriculares. Para cardiomiócitos ventriculares recomendamos usar apenas em forma de bastonete, miócitos ventriculares estriados de aparência saudável sem contrações espontâneas. Comparado com miócitos ventriculares, os miócitos atriais são mais curtos e mais finos. A estriação característica e forma de haste dos cardiomiócitos do ventrículo está faltando em adultos atriais cardiomiócitos murinos. O rendimento de cardiomiócitos ventriculares isoladasa partir de um coração de rato intacto é 5x10 5 - 1x10 6. Para cardiomiócitos atriais é significativamente menor. Em geral, esperamos para isolar cerca de 5 - 25 mil células atriais de um coração de rato. Uma vez isolados, os cardiomiócitos podem ser submetidos a diferentes técnicas in vitro, incluindo gravações electrofisiológicos (Figura 1). Recomendamos o uso de cardiomiócitos isolados dentro do primeiro 6 horas após o isolamento. Mostra a Figura 1 exemplar gravações de canais Kv exteriores (à direita) de cardiomiócitos atriais e ventriculares evocados por despolarização passos diferentes por toda célula técnica de patch clamp. A forma característica de murino adulto ventricular e atrial canal Kv repolarizante correntes pode ser visto ao longo de um curso de tempo definido (aqui 4 segundos, a Figura 1). Por favor, note que a amplitude da corrente é significativamente menor em murinos adultos cardiomiócitos atriais comparação com cardiomycytes ventriculares.
| Solução | Conteúdo (em mM, se não especificado de maneira diferente) |
| 1 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 mM de HEPES, 1 de KH 2 PO 4, 4 NaHCO3, 1,7 MgCl2, 10 Glucose |
| 2 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 mM de HEPES, 1 de KH 2 PO 4, 4 NaHCO3, 1,7 MgCl2, 10 Glucose + 229,5 mM EGTA |
| 3 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 mM de HEPES, 1 de KH 2 PO 4, 4 NaHCO3, 1,7 de MgCl2, 10 de glucose, CaCl2 0,1 + 0,8 g / L de colagenase Tipo 2 (300 U / L) * |
| 4 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 mM de HEPES, 1 de KH 2 PO 4, 4 NaHCO3, 1,7 de MgCl2, 10 de glucose, CaCl2 0,2 + 0,8 g / L de colagenase Tipo 2 (300 U / l) * + BSA (1 g / L) |
| 5 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 mM de HEPES, 1 KH 2 4, 4 NaHCO3, 1,7 de MgCl2, 10 de glucose, CaCl2 0,5 + BSA (1 g / L) |
| 6 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 mM de HEPES, 1 de KH 2 PO 4, 4 NaHCO3, 1,7 de MgCl2, 10 de glucose, CaCl2 1,0 + BSA (1 g / L) |
Tabela 1. Soluções de isolamento. Equilibradas durante 10 min com Carbogen (95% O 2, 5% CO 2), a 37 ° C, pH = 7,4 (NaOH). * Actividade pode depender do número do lote, o teste de modo prévio da actividade da colagenase é recomendada.
Figura 1 superior esquerdo:. Manchado cardiomiócitos Exemplar ventricular com DAPI (núcleos, azul) e Farinha Alexa 488 Faloidina (α-actinina, verde) superior direito:. Exemplares traços de fixação de células inteiras de patchgravação inferior esquerdo:.. manchado cardiomiócitos Exemplar atrial com DAPI (núcleos, azul) e Faloidina conjugado fluorocromo (α-actinina, verde) inferior direito: traços exemplares de toda a gravação grampo celular patch.
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Discussion
Com o desenvolvimento crescente de estirpes de ratos geneticamente modificados para estudar a função cardíaca e patologia cardíaca relacionada com deleção do gene também existe um crescente interesse em métodos especializados para estudar os efeitos da supressão do gene específico in vitro. Em nosso laboratório estudamos os papéis de uma família de subunidades Kv canais auxiliares na repolarização cardíaca. Os genes KCNE compreendem uma família de cinco genes (KCNE1-5) que desempenham papéis importantes em ventricular humana e repolarização atrial 11, 15. KCNEs são únicos transmembrana domínio subunidades Kv canais auxiliares que não pode passar nenhum correntes de potássio por conta própria, mas podem formar complexos com subunidades alfa dos canais Kv e modular as suas propriedades funcionais, tais como gating, a condutância da farmacologia, e de tráfico dentro da célula de forma significativa. Mutações e polimorfismos comuns em KCNE2 por exemplo, são associados com as formas herdadas e adquiridas of síndrome do QT longo (SQTL) 1, 16.
Trabalho pioneiro no isolamento e caracterização eletrofisiológica de diferentes Kv subunidades de canais alfa e sua contribuição para o rato, mas também ventricular murino e repolarização atrial foi feito pelo grupo do Dr. Nerbonne da Universidade Washington de St. Louis na década de 1990 3, 5, 7. No entanto, muito menos se conhece sobre a contribuição das subunidades de canais Kv auxiliares de repolarização atrial e ventricular no miocárdio roedor. KCNEs ter sido principalmente estudada em sistemas de expressão heterólogos, tais como células CHO e oócitos de Xenopus laevis. Usando estes métodos de subunidades KCNE demonstraram ser altamente promíscuo na formação de complexos heteroméricos de canais Kv identificar uma gama de diferentes subunidades Kv canal alfa como potenciais parceiros para KCNEs 10. No entanto, não podemos ter certeza se estes específica heteromérico Kv canal complementarxes também ocorrer em cardiomiócitos nativos ou se os observados heteroméricos KCNE Kv canal parcerias subunidade alfa são artefatos de expressão heteróloga 1. Por isso, a técnica de isolamento adoptada e os protocolos de canal Kv gravação a partir do laboratório Nerbonne e modificá-los, tal como indicado na secção de protocolo deste artigo para dissecar os canais Kv diferentes de repolarização de murino, que são controlados por genes KCNE. Utilizando esta abordagem, recentemente, descobriu que o canal Kv subunidade acessória KCNE2 controla duas correntes distintas na Kv murino miocárdio ventricular (I Kslow, 1 e I, f). Por aplicação de inibidores específicos para os diferentes canais de potássio que foram capazes de mostrar que a deleção do gene murino KCNE2 provoca uma redução significativa em ambas as correntes de Kv1.5 e Kv4.2 14. Regulamento de Kv1.5 por KCNE2 não era conhecida anteriormente, whereas de regulação Kv4.2 por KCNE2 já foi demonstrada in vitro por meio de estudos de expressão heterólogos 20.
A fibrilação atrial (FA) é a arritmia sustentada mais freqüente na prática clínica e está associada a significativa morbidade e mortalidade 4. As mutações em todos os KCNEs diferentes foram recentemente associados com FA em humanos. Recentemente, dois não sinônimas mutações foram encontradas em KCNE1 em pacientes com FA que não estavam presentes no grupo controle (Olesen et al., 2012). Mecanicamente, os estudos de expressão heterólogos identificado um efeito de ganho-de-função, em KCNQ1 correntes, como o mecanismo subjacente provável. Além disso, recentemente, foi demonstrado que KCNE1 - / - ratos sofrem de episódios espontâneos de FA paroxística 17. Em um estudo que avaliou 28 famílias chinesas não relacionados com FA isolada, Yang et al. identificada uma mutação no KCNE2,o que resultou numa substituição de arginina para cisteína (R27C). A análise funcional do canal do mutante em estudos de expressão heterólogos revelou um efeito de ganho-de-função em KCNQ1 canais (I Ks) 18. No entanto, KCNE2 podem também formar complexos com uma série de outros canais Kv α subunidades incluindo Kv1.5, o que também tem sido implicado em AF. Mostrámos recentemente que KCNE2 pode modular Kv1.5 correntes no ventrículo murino levando a um prolongamento da APD ventricular em ratos 15. Por conseguinte, a ruptura da atriais Kv1.5 correntes por disfunção KCNE2 também pode representar o mecanismo subjacente arritmogênico para FA no nosso KCNE2 - / - modelo do rato e / ou em pacientes portadores de mutações no KCNE2 sofrem de AF. Mutações em KCNE3 também foram recentemente identificado em um paciente com AF familiar 8. Registros eletrofisiológicos revelaram uma incrementosactividade de ased Kv4.3/KCNE3 e Kv11.1/KCNE3 correntes geradas por mutação, conferindo assim a susceptibilidade dos portadores da mutação para a repolarização cardíaca potencial acção mais rápido e, portanto, a vulnerabilidade a reentrantes wavelets nos átrios. A mutação missense KCNE3 V17M entanto não teve efeito KCNE3/KCNQ1 correntes, apesar do facto de que as formas KCNE3 complexos funcionais com KCNQ1 no miocárdio. Além disso, foi recentemente mostrado KCNE3 ser regulada para cima em populações humanas com valvular AF suportando a hipótese de que KCNE3 desempenha um papel não apenas no AF familiar, mas também valvular AF 6. Recentemente, um polimorfismo de um único nucleótido (G / T) foi identificado em KCNE4 resultando em um ácido glutâmico (Glu, E) / ácido aspártico (Asp, D) de substituição na posição 145 do péptido KCNE4 19. Análise funcional subsequente deste polimorfismo revelou que o polimorfismo KCNE4exerce o efeito de "ganho de função" nas KCNQ1 canais 9. Mais uma vez, esses estudos foram realizados em sistemas de expressão heteróloga e evidências experimentais de cardiomiócitos nativos ainda está faltando. Mais recentemente, um caso não familiar isolado de FA com uma mutação missense (L65F) foi identificado numa coorte de 158 pacientes dinamarqueses com FA 12. Além disso, um polimorfismo no KCNE5 (C97T) foi identificado dentro da população mesmo estudo, o que foi associado com um maior risco de desenvolver AF 13. Interacção de ambos mutante β-subunidades (KCNE2 e KCNE5) com o canal de KCNQ1 produzido um efeito de ganho-de-função com correntes IKs aumentados. O KCNQ1 α subunidade do canal de IKs pode associar-se com qualquer um dos cinco acessório β-subunidades (KCNE1-5). Portanto KCNQ1 parece ser um provável candidato α-subunidade parceiro na busca de um substrato molecular in patogênese da KCNE associada AF. No entanto, dada a promiscuidade pronunciado de subunidades KCNE outros alvos moleculares são possíveis e que, por conseguinte, a intenção de investigar especificamente estes possíveis KCNE / Kv alfa subunidade interacções. Estudos realizados em nosso laboratório, portanto, também atualmente destinada a elucidar os mecanismos por trás KCNE associada AF utilizando a técnica descrita neste artigo - o isolamento de cardiomiócitos murinos atriais e subseqüentes em gravações eletrofisiológicas in vitro com aplicação de inibidores específicos para diferentes Kv subunidades alfa do canal e análises bioquímicas de cardiomiócitos nativos de camundongos knockout KCNEx.
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Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz Thyssen--Stiftung e Charité / MDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrodotoxin | Alomone | ||
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals | ||
| Heteropodatoxin 2 | Alomone | ||
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington |
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