Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

فيفو السابقين خلية الدم الحمراء الفحص انحلال الدم لتقييم درجة الحموضة التي تستجيب لتسليم وكلاء Endosomolytic عصاري خلوي من أدوية Biomacromolecular

Published: March 9, 2013 doi: 10.3791/50166
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 2,3, 1, 1,2, 4, 1,2,5,6, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Institute for Nanoscale Science & Engineering, Vanderbilt University, 3Interdisciplinary Materials Science Program, Vanderbilt University, 4Monroe Carell Jr. Children's Hospital, Vanderbilt University Medical Center, 5Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 6Department of Cancer Biology, Vanderbilt University
* These authors contributed equally

Summary

ويمكن استخدام فحص انحلال الدم كشاشة السريع الإنتاجية العالية، من cytocompatibility نظم لتقديم الأدوية 'والنشاط endosomolytic لنقل البضائع داخل الخلايا. الفحص يقيس تعطل الأغشية كرات الدم الحمراء بوصفها وظيفة من درجة الحموضة البيئية.

Abstract

يمكن طبقات ثنائية فسفوليبيد التي تشكل إندو-الليزوزومية الحويصلات تشكل عائقا أمام تسليم المخدرات البيولوجية لأهداف داخل الخلايا. للتغلب على هذا الحاجز، لقد تم تصميم عدد من ناقلات المخدرات الاصطناعية لتعطيل بنشاط الغشاء endosomal وتسليم البضائع إلى السيتوبلازم. هنا، نحن تصف مقايسة انحلال الدم، والتي يمكن أن تستخدم الشاشة السريع الإنتاجية العالية، لcytocompatibility والنشاط داخل الخلايا endosomolytic من نظم لتقديم الأدوية.

في مقايسة انحلال الدم، وخلايا الدم الحمراء ومواد الاختبار شارك في المحتضنة في مخازن في تعريف بالوسط التي تحاكي خارج الخلية، endosomal في وقت مبكر، وأواخر إندو-الليزوزومية البيئات. بعد الطرد المركزي خطوة لخلايا سليمة بيليه الدم الحمراء، يتم قياس طيفيا كمية الهيموجلوبين تطلق في المتوسط ​​(405 نانومتر لمجموعة ديناميكية أفضل). وكميا في المئة ثم خلايا الدم الحمراء نسبة إلى تعطيل عصيدة مراقبة إيجابيةليه هي lysed مع المنظفات. في هذا النظام النموذجي غشاء كرات الدم الحمراء بمثابة بديل للطبقة ثنائية المادة الدهنية التي إحاطة غشاء إندو-الليزوزومية الحويصلات. النتيجة المرجوة هي انحلال الدم لا يذكر في درجة الحموضة الفسيولوجية (7.4) وانحلال الدم قوية في نطاق درجة الحموضة إندو-الليزوزومية من الرقم الهيدروجيني 5-6،8 تقريبا.

Introduction

على الرغم من أن هناك العديد من إمكانيات عالية التأثير الأهداف العلاجية داخل الخلية، وتسليم من وكلاء داخل الخلايا يشكل تحديا كبيرا. في كثير من الأحيان، يتم إدماج المخدرات، وخاصة البيولوجية، والاتجار من قبل خلايا الحويصلات التي تؤدي إلى إما إلى تدهور محتوياتها من خلال مسار إندو-الليزوزومية، أو مكوكية مرة أخرى خارج الخلية عبر الإيماس. 1 في العملية الأخيرة، ودرجة الحموضة الداخلية من الحويصلات ويحمض إلى 5-6 تقريبا، وهو الرقم الهيدروجيني الأمثل لنشاط الإنزيمات التي تعمل في هذا الحيز، مثل الليزوزيم .. 2

مؤخرا، تم عدد من المواد المهندسة وتحديدا للاستفادة من تحمض الإندوسومات لتسهيل تسليم عصاري خلوي من حمولتها. واحد الأمثلة على هذا النهج يستخدم الاصطناعية، والبوليمر النانوية التي مذيلة الأساسية هي ثنائي الشحنة وهو ورسوم محايدة في درجة الحموضة الفسيولوجية (أي 7.4). ومع ذلك، عند 6.0 درجة الحموضة- 6.5، البوليمرات تصبح البروتونية والحصول على شحنة موجبة صافية أن يزعزع استقرار مذيلة الأساسية، وشرائح البوليمر يتعرض التفاعل مع وتعطيل الغشاء endosomal. وقد تبين هذا النشاط لتعزيز الهروب من endosomal التداوي القائم على حمض النووي الببتيد و، والسماح لهم للوصول إلى أهدافها عصاري خلوي. 3،4 أمثلة أخرى من الطرق وضعت للتوسط الهروب endosomal التي تعطل حاجز الغشاء تشمل 'fusogenic "الببتيدات أو البروتينات التي يمكن أن توسط الانصهار الغشاء أو تشكيل المسام عابرة في طبقة ثنائية فسفوليبيد .. 5 مجموعة السلفات من الأحماض أنيوني الاكريليك ألكيل مثل بولي (حمض propylacrylic) هي مقاربة أخرى مدروسة، وهذه البوليمرات في، الدولة بروتوناتيون من حمض الكربوكسيلية قلادة يملي الانتقال في مسعور، غشاء التخريبية الدولة في نطاقات درجة الحموضة إندو-الليزوزومية. 6،7

نظام واحد نموذجا مفيدا لفحص السلوك هو endosomolytic هX فيفو مقايسة درجة الحموضة التي تعتمد على انحلال الدم. 8 في هذا النظام النموذجي، وغشاء كرات الدم الحمراء بمثابة بديل للطبقة ثنائية المادة الدهنية التي إحاطة غشاء إندو-الليزوزومية الحويصلات. وقد استخدم هذا النموذج للتعميم من قبل الآخرين لتقييم السلوك endosomolytic من اختراق الخلايا الببتيدات وغيرها من أنظمة توصيل الجينات البوليمرية. 8-11 في هذه التجربة، الإنسان خلايا الدم الحمراء ومواد الاختبار شارك في المحتضنة في مخازن في تعريف بالوسط التي تحاكي خارج الخلية (7.4)، في وقت مبكر endosomal (6.8)، وأواخر إندو-الليزوزومية (<6.8) البيئات. وكميا كمية الهيموجلوبين صدر خلال فترة الحضانة كمقياس لتحلل الخلايا الحمراء في الدم، والتي يتم تطبيع لكمية الهيموجلوبين صدر في عينات مراقبة إيجابية هي lysed مع المنظفات.

من فحص مكتبة صغيرة من مواد الاختبار endosomolytic يحتمل، يمكن للمرء أن يستنتج أن العينات التي تنتج أي انحلال الدم في درجة الحموضة 7.4، ولكن تنحنح مرتفعة بشكل ملحوظolysis في درجة الحموضة <6.5، وسوف يكون المرشحين الأكثر فعالية وcytocompatible لتسليم المخدرات عصاري خلوي. ومن المتوقع أن المواد التي تناسب هذه المعايير أن تظل خاملة وليس بشكل عشوائي تدمير الأغشية طبقة ثنائية المادة الدهنية (أي التي يمكن أن تسبب السمسة) حتى التعرض لانخفاض الرقم الهيدروجيني في استيعاب المحلية بعد في إندو-الليزوزومية المقصورات.

في هذا البروتوكول، يتم عزل الكريات الحمراء من المتبرع الإنسان وشارك في حضنت في درجة الحموضة 5.6، 6.2، 6.8، أو 7.4 مع وكلاء التجريبية endosomolytic تسليم المخدرات. الكريات الحمراء سليمة هي مكعبات، ويتم تحليل supernatants (التي تحتوي على الهيموغلوبين أفرج عنه من الكريات الحمراء هي lysed) لامتصاص سمة من الهيموجلوبين عن طريق قارئ لوحة (الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وتعقيم المخازن وكلاء الاختبار

  1. 150 ملي كلوريد الصوديوم العازلة: 4،383 ز حل بلورات كلوريد الصوديوم في 500 مل من الماء nanopure.
  2. المخازن المؤقتة درجة الحموضة: إعداد مخازن الفوسفات في درجة الحموضة 5.6، 6.2، 6.8، و 7.4 عن طريق خلط كميات مناسبة من أحادى فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة و. إذا العينات لفحصها في انخفاض الرقم الهيدروجيني القيم (أي درجة الحموضة <5.6) ثم منطقة عازلة أكثر ملاءمة، مثل سترات العازلة، يجب استخدام. وصفات العازلة متوفرة بسهولة، وقدمت إشارة سبيل المثال هنا 12
  3. تعقيم جميع المخازن المؤقتة المشار إليها أعلاه من خلال جهاز الترشيح فراغ زجاجة الأعلى وإعادة فحص درجة الحموضة عازلة لل.
  4. 20٪ تريتون X-100 (مراقبة إيجابية): مزيج نقي 20 مل تريتون X-100 في 80 مل من الماء nanopure. دوامة بقوة ويصوتن حل. ترك في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها قبل الاستخدام.

2. إعداد تبدي الكريات الحمر

  1. الحصول على 25 مل من الدم الابام متبرع مجهول الإنسان، والمستمدة مباشرة إلى K أنابيب Vacutainer 2-EDTA المغلفة لمنع التخثر.

يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات يجب اعتمادها مسبقا من مجلس المراجعة المؤسسية المناسبة (IRB)، وبزل الوريد وجمع الدم من قبل فصاد المدربين من أجل تقليل المخاطر التي يتعرض لها المتبرع: NOTE. وقد نشرت معيار الإجراءات الفصد في أماكن أخرى 13

  1. أجهزة الطرد المركزي في 500 XG الدم لمدة 5 دقائق، ومستويات الهيماتوكريت علامة (حمراء، وانخفاض طبقة) والبلازما (مصفر، الطبقة العليا) على أنبوب.
  2. نضح البلازما بلطف عبر micropipettor، إضافة إلى التبييض، وتجاهل إلى نفايات biohazardous.
  3. ملء أنبوب الهيماتوكريت إلى خط علامة (المستوى الأصلي من البلازما) مع محلول كلوريد الصوديوم 150 ملم. الغطاء وقلب عدة مرات لخلط بلطف. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. كرر الخطوة 2،3-2،4 لغسل خلايا الدم مرة أخرى. ثم نضح supernatالنمل واستبدالها مع PBS في درجة الحموضة 7.4. قلب لخلط.
  5. تقسيم بالتساوي الدم إلى أربعة أنابيب، المقابلة لكل درجة الحموضة التي سيتم اختبارها. تسمية أنابيب وفقا لدرجة الحموضة كل لفحصها (5.6، 6.2، 6.8، 7.4).
  6. أجهزة الطرد المركزي أنابيب الدم في 500 x ج لمدة 5 دقائق. بمناسبة مستويات على أنابيب، ثم طاف نضح.
  7. ملء كل أنبوب إلى خط ملحوظ مع العازلة الرقم الهيدروجيني المناسب (كما هو موضح في 2.6).
  8. التسمية 4 مل المخروطية أنابيب 50 (واحد لكل درجة الحموضة للاختبار)، والماصة 49 مل من برنامج تلفزيوني من درجة الحموضة المناسبة في كل أنبوب مخروطي الشكل.
  9. إضافة 1 مل من الكريات الحمراء (درجة الحموضة نفسه) في أنبوب المقابلة لتخفيف 1:50. تفقد البصر الدم الواحد، التي ينبغي أن عكرا وسوف يستقر إذا ما تركت دون عائق. إذا لم أشكال بيليه، وهي lysed الخلايا.

3. تحلل الفحص 96 لوحة الإعداد حسنا والكمي

  1. إعداد تقييم حلول جميع وكلاء المخدرات التسليم التجريبية، في 20X تركيز النهائي المطلوب لفحصها (الفحصوسوف يستغرق 10 ميكرولتر من عامل توصيل الدواء + 190 ميكرولتر المخفف خلايا الدم الحمراء، مما يؤدي إلى التخفيف 1/20 من وكيل تسليم المخدرات إلى الخليط الأصلي الاختبار النهائي). واقترح الأسهم من 20، 100، و 800 ميكروغرام / مل، مما أدى إلى تركيزات الاختبار النهائي من 5، 1، و 40 ميكروغرام / لتر، على التوالي.
  2. الماصة 10 ميكرولتر من محلول المخزون في كل V-96-أسفل وحات جيدة. لأفضل النتائج، تحميل كل عينة في ثلاث نسخ أو quadruplicate.

ملاحظة: للحصول على سهولة، فمن المستحسن أن تعد منفصلة 96-وحة جيدا لكل درجة الحموضة لفحصها، مع كل عينة (في كل التركيز) في تحميل العدد = 3-4 في لوحة.

  1. لآبار مراقبة إيجابية، إضافة 10 ميكرولتر من 20٪ تريتون X-100.
  2. لآبار المراقبة السلبية، إضافة 10 ميكرولتر من العازلة الفوسفات. استخدام المخزن المؤقت في نفس درجة الحموضة لفحصها.
  3. الماصة 190 ميكرولتر من الكريات الحمراء المخفف (انظر 2.10) إلى كل بئر، والتأكد من محلول المخزون الخلية لا يزالمتجانسة أثناء النقل. تلميح: استخدام متعدد القنوات ماصة لتبسيط هذه المهمة.
  4. احتضان لوحات في C ° 37 لمدة ساعة (اختياري: استخدام شاكر المداري أو الروك).
  5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق لوحات في 500 XG إلى الكريات الحمراء بيليه سليمة. ملاحظة: عند إزالة لوحة من أجهزة الطرد المركزي ونقله إلى الخطوة التالية، والتعامل مع بعناية وتكون على يقين من عدم تعطيل بيليه الخلية.
  6. باستخدام الماصة متعددة، نقل 100 ميكرولتر من طاف من كل بئر في واضحة، لوحة 96-مسطحة القاع جيدا. ملاحظة: إذا تشعر بالانزعاج بطريق الخطأ بيليه الخلية لأي عينة (ق)، ويمكن للمرء أن إعادة أجهزة الطرد المركزي لوحة ومن ثم المضي قدما في نقل طاف.
  7. قياس الامتصاصية من supernatants مع قارئ لوحة. لاحظ أنه يمكن استخدام مجموعة واسعة من الأطوال الموجية (400-541 نانومتر).

ملاحظة: لوحة مختلفة القراء قد يكون نقطة التشبع والحساسيات المختلفة، وبالتالي فإن اختيار الطول الموجي بالنسبة ليasurements يعتمد على ما إذا كان أو لا يمكن انحلال الدم البيانات من نماذج تجريبية تطبيع موثوق ضد انحلال الدم الناجم عن الحد الأقصى والعلاج المنظفات. هذا يتطلب القياس الدقيق للقيم الامتصاصية للعينات مراقبة إيجابية.

  1. باستخدام Microsoft Excel أو تحليل البيانات برامج مماثلة، والعثور على متوسط ​​قراءات الامتصاصية الخلفية من عينات المراقبة السلبية التي أنشئت من أجل كل درجة الحموضة (الخطوة 3.4). طرح هذه القيمة الامتصاصية الخلفية من جميع العينات الأخرى التي تم قياس درجة الحموضة في ذلك.
  2. بعد الطرح الخلفية، والعثور على امتصاص متوسط ​​مراقبة إيجابية المنظفات المعالجة عينات (الخطوة 3.3). ثم تطبيع جميع نقاط البيانات التجريبية لهذه القيمة يعني الامتصاصية، التي ينبغي أن تمثل 100٪ انحلال الدم. وأخيرا، وتتضاعف كل قيمة جيدة بنسبة 100٪ لحساب انحلال الدم٪ التي وقعت في كل فرد النسبي بشكل جيد للتحكم المنظفات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عادة، والعوامل التي يحمل الرقم الهيدروجيني المثالي التي تعتمد على السلوك الانحلالي لديها أعلى احتمال تسليم عصاري خلوي من المخدرات، والأحماض النووية، أو الجزيئات الحيوية النشطة الأخرى. ويتمثل ذلك من خلال وكيل # 1 كما صورت في الشكل 2، والذي يسلك انحلال الدم في الحد الأدنى من درجة الحموضة 7.4، ولكن زيادة حادة في السلوك الانحلالي في نطاقات درجة الحموضة endosomal (<6.5). قد تظهر بعض وكلاء مستويات كبيرة من السلوك الانحلالي في نطاقات الرقم الهيدروجيني الفسيولوجية (وكيل رقم 2 في 40 ميكروغرام / مل؛ الشكل 2)، مما يدل على أن هذه العوامل قد لا تكون وhemocompatible من المحتمل أن تكون سامة للخلايا في هذه التركيزات.

في معظم الحالات، هو أيضا انحلال الدم تعتمد على الجرعة، وزيادة تركيزات المواد اختبار تتوافق مع مستويات أعلى من انحلال الدم، وخاصة في نطاقات انخفاض الرقم الهيدروجيني اختبار (5،6-6،2).

"بديل =" الشكل 1 "FO: المحتوى العرض =" 4in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50166/50166fig1highres.jpg "/>
الشكل 1. يتم عزل رسم تخطيطي من خلايا الدم الحمراء الفحص انحلال الدم. الكريات الحمراء البشرية وحضنت مع وكلاء التجريبية endosomolytic تسليم المخدرات في سلسلة من المخازن المؤقتة محاكاة مجموعة من الرقم الهيدروجيني الفسيولوجية (7.4) الجسيمات الحالة / لالإندوسومات في وقت متأخر (5.6). فإن تسليم المخدرات الأمثل وكلاء لا يعطل الكريات الحمراء عند درجة الحموضة الفسيولوجية ولكن سوف تظهر في ظروف انحلال الدم قوية أكثر حمضية. لتقييم انحلال الدم في المئة، ويقاس الإفراج عن الهيموغلوبين في الوسط المحيط عن طريق الامتصاص على قارئ لوحة.

الشكل 2
الشكل 2. النتائج ممثلا لمصلحة دمغ المصوغات انحلال الدم إظهار سلوك اثنين Endos التجريبيةوكلاء omolytic أولا، فإن متوسط ​​A 450 من السيارة (PBS) تم طرح التحكم من اختبار عينات أخرى في ذلك الرقم الهيدروجيني. بعد ذلك، تم تطبيع نماذج تجريبية إلى 450 A العينات X-100-تريتون كرات الدم الحمراء والمعالجة تضاعفت بنسبة 100٪. بناء على هذه العينات التحكم، يمكن حساب قدرة وكلاء ترنسفكأيشن التجريبية لالكريات الحمراء ليز. عادة، وكلاء endosomolytic يظهرون سلوكا مثاليا الانحلالي تعتمد على الجرعة ودرجة الحموضة التي تعتمد على. وكلاء مثالية (مثل وكيل # 1) يحمل الحد الأدنى من انحلال الدم في درجة الحموضة 7.4، ولكن زيادة حادة في السلوك الانحلالي في نطاقات درجة الحموضة endosomal (<6.5). بعض وكلاء يحمل سلوك الانحلالي كبير في درجة الحموضة تتراوح الفسيولوجية (وكيل رقم 2 في 40 ميكروغرام / مل)، مما يوحي بأن هذه العوامل قد تكون سامة للخلايا في هذه التركيزات. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري من 4 قياسات مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن الرقم الهيدروجيني التي تستجيب للبوليمرات أو غيرها من العوامل صممت لتكون وظيفة endosomolytic بسرعة وفعالية فحص يعتمد على تحلل كريات الدم الحمراء عند قيم الرقم الهيدروجيني ووجهت في دخلول؛ جسيم داخلي (الشكل 1؛ درجة الحموضة 6.8 - دخلول؛ جسيم داخلي في وقت مبكر، ودرجة الحموضة 6.2 - دخلول؛ جسيم داخلي أواخر، ودرجة الحموضة 5.6 - يحلول). وقد استخدم 14-17 درجة الحموضة التي تعتمد على انحلال الدم لفحص قدرة الناقلين للتوسط الإفراج endosomal من العلاجات biomacromolecular (الببتيدات على سبيل المثال، سيرنا، ODNs والبروتينات)، ونتائج هذا الفحص يمكن أن يكون التنبؤية لأداء باعتبارها الخلايا المخدرات المركبة الناقلة. 3،4،8،18،19 وهكذا، وهذا الفحص يمثل شاشة فعالة لقياس قدرة ناقلات المخدرات البوليمرية للتوسط بين الخلايا لتقديم الأدوية الخاصة بهم على أساس اضطراب الغشاء التي تعتمد على درجة الحموضة.

كما لوحظ في الإجراء، يتم الكشف عن انحلال الدم من خلال قياس الطيفي للsupernatants من خلايا الدم الحمراء تعامل مع التجريبيةوكلاء. لذلك، بالإضافة إلى الهيموغلوبين، فمن المحتمل أن تحتوي على كرات الدم الحمراء الأخرى المشتقة من مكونات عصاري خلوي، بما في ذلك البروتينات والكربوهيدرات. في حين أن هذه المكونات الأخرى يمكن أن تسهم كمية صغيرة من إشارة إلى القياس الطيفي، ومعايرة 100٪ إلى انحلال الدم المحللة كرات الدم الحمراء الناتجة عن المعالجة مع تريتون X-100. على افتراض أن جميع الكريات الحمراء من المتبرع نفسه تحتوي على مستويات مماثلة من الهيموجلوبين والجزيئات الحيوية الأخرى، يمكننا أن نستنتج أن مكونات بأمان 'تلويث' لن يسهم أي من الاعمال الفنية لقياس انحلال الدم، وخاصة إذا تم استخدام عينة من الدم لجميع الاختبارات نفس. ومع ذلك، وهذا يسلط الضوء على احتمال أن لأي متبرع بالدم معين، هناك من المحتمل أن تكون صغيرة يوما بعد يوم تغيرات في تكوين الدم والهيماتوكريت، وبالتالي، عينات الرقابة الداخلية (3،3-3،4 الخطوات، 3،10-3،11) ينبغي أن يكون تحليل لجميع التجارب.

ينبغي للمرء أيضا دراسة عن كثب دائما ABS الخامorbance البيانات. على الرغم من أنه لا يمكن تقديره في المثال تطبيع البيانات هو موضح في الشكل 2، المنظفات مثل تريتون X-100 زعزعة استقرار كرات الدم الحمراء بشكل فعال الأغشية بغض النظر عن درجة الحموضة، وينبغي للمرء أن نتوقع أن نرى عينة قليلة جدا لتقلب العينة في الضوابط الإيجابية. الطيف الامتصاصية من تريتون X-100 لا يتضمن قمم في نطاق 400-600 نانومتر الموصى بها لهذا الاختبار، وبالتالي، يجب أن لا تتدخل في تطبيع البيانات التجريبية 20 وعلاوة على ذلك، لعينات المراقبة السلبية، لا ينبغي لأحد أن نلاحظ كبيرة انحلال الدم بعد ساعة الحضانة 1 في أي من المخازن المؤقتة المستخدمة (أي حتى المخزن المؤقت أكثر حمضية لا تولد عادة انحلال الدم على هذا الإطار الزمني). يجب قراءات أساسية عن عينات المراقبة السلبية عن كثب تقريبي قراءات الامتصاصية الخلفية المتخذة على مخازن جديدة.

ومن الناحية المثالية، فإن الباحثين توظيف استراتيجيات متكاملة لتوصيف بة علىrimental نظم المخدرات التسليم. الفحص انحلال الدم هو مفيد لفحص أولي وكيل endosomolytic على طبيعيا biomembranes، ولكن ينبغي النظر في واحدة فقط من العديد من الأدوات في عتاد الباحث تسليم المخدرات لاختبار وكلاء تسليم عصاري خلوي. على سبيل المثال، عيب واحد المحتملة للفحص انحلال الدم هو أنه يستخدم خلايا الدم الحمراء غشاء كنموذج للأغشية البيولوجية endosomal. ومع ذلك، فإن محتوى المكياج والدهون في الأغشية endosomal يختلف وفقا لنوع الخلية وربما لا تلخيصها بدقة عن طريق الدم غشاء الخلية. 1 A متنوعة من فحوصات وغيرها مكملة وضعت لتقليد endosomal تكوين الغشاء والسلوك 21، 22 بديل واحد هو استخدام لالليبوزومات تحتوي على مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق)-مروي fluorophores، والتي أصبحت بعد unquenched زعزعة الاستقرار في الجسيمات الشحمية والإفراج عن fluorophores إلى وسائل الإعلام المحيطة بها. في الدراسات الفي توظيف هذه الطريقة، وقد تم العثور على القياس الكمي للfluorophores unquenched لربط مع قدرة وسيلة لهروب التوسط endosomal من حمولتها. 21،23 المجهر قياسات يمكن أن توفر وسيلة أكثر قوة ولكنها أقل إنتاجية، وهذا هو مكملة لل وفحص انحلال الدم. على سبيل المثال، فإنه من الشائع لتقييم colocalization من الناقل أو المخدرات نفسها مع صبغ المسمى الجسيمات الحالة (على سبيل المثال بواسطة تقنيات LysoTracker الحياة)، أو يمكن وصفها باستخدام مسارات الاتجار درجة الحموضة حساسة الأصباغ مترافق الناقل أو المخدرات (على سبيل المثال من قبل pHrodo الحياة تكنولوجيز). 24-26

مرة واحدة وقد تم تأكيد نظام الدفع endosomolytic لتحقيق عصاري خلوي نقل البضائع، يمكن للفحص انحلال الدم أيضا تقديم معلومات عن آلية يمكن من خلالها الهروب endosomal يحدث. على سبيل المثال، لتوصيل الجينات المركبات على أساس polyethyleneimine (PEI) تفتقر إلى القدرة الكامنة لتعطيل الأغشية فسفوليبيدفي الرقم الهيدروجيني المحايدة أو الحمضية. 11،27 بدلا من ذلك، PEI يحقق عصاري خلوي من خلال توصيل الجينات واقع الأمر "الاسفنج بروتون". بعد استيعاب، PEI مخازن للدخلول؛ جسيم داخلي من البروتونات "استيعاب" التي تضخ عبر الغشاء endosomal لتحمض هذه المقصورات. في نهاية المطاف، وهذا يؤدي إلى تراكم فائض من البروتونات والأيونات مكافحة مكانتهم داخل دخلول؛ جسيم داخلي. وهذا يؤدي إلى ارتفاع في ضغط التناضحي، تدفق المياه، وتورم الحويصلة، وendosomolysis. ولذلك، فإن نجاح تأثير الإسفنج بروتون يتطلب تراكم تركيز الحاسمة في PEI جسيم داخلي. السيارات تسليم ال 27 التي تعطل تحقيق endosomal من خلال تأثير "الاسفنج بروتون" لن يعطل فعليا خلايا الدم الحمراء أو الجسيمات الشحمية، ومدى فعاليتها في تحقيق يجب أن يقدر بين الخلايا من خلال تقديم الأدوية حسابات الضغط التناضحي، أو في المختبر المجهري، أو الدراسات الفنية.

وفي الختام، وصف فحص انحلال الدم هناهو نموذج يمكن الاعتماد عليها لفحص المستحضرات الصيدلانية مصممة للتسليم داخل الخلايا من الأدوية البيولوجية. هذا الاختبار يوفر وسيلة إنتاجية عالية لاستخدام العقاقير فحص السيارة، مما يتيح التطور السريع للصيغ التي تقدم البيولوجية مع أهداف داخل الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الموافقة IRB: تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على البشر من قبل مجلس المراجعة المؤسساتي جامعة فاندربيلت (IRB؛ # 111251 البروتوكول). الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب يقر تمويل من خلال وزارة الدفاع الكونغرس إخراج برامج البحوث الطبية (# W81XWH-10-1-0445)، المعاهد الوطنية للصحة (NIH R21 HL110056)، وجمعية القلب الأمريكية (# 11SDG4890030).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes Fisher Scientific 22-253-145 For blood collection
BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge Fisher Scientific 02-665-31 For blood collection
BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter Fisher Scientific 22-289-953 For blood collection
BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs Fisher Scientific 13-680-63 For blood collection
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet Fisher Scientific 02-657-6 For blood collection
Hydrochloric acid (conc.) Fisher Scientific A144-500 For adjustment of pH of D-PBS.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Positive control
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190
Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane Fisher Scientific 09-740-44A
BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene Fisher Scientific 08-772-2C For plate-reading at the end of the assay.
BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene Fisher Scientific 08-772-17 For incubation of red blood cells with experimental agents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th, Garland Science. (2002).
  2. Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
  3. Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
  4. Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
  5. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  6. Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
  7. Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
  8. Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
  9. Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
  10. Behr, J. -P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
  11. Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. Data for Biochemical Research. , 3rd, Oxford University Press. (1986).
  12. Ernst, D. J. Applied Phlebotomy. , 1st, Lippincott Williams & Wilkins. (2005).
  13. Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
  14. Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
  15. Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
  16. Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
  17. Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
  18. Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
  19. Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
  20. Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
  21. Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
  22. Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
  23. Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
  24. Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).

Tags

علم المناعة، العدد 73، الخليوي علم الأحياء، الطب، الهندسة الطبية الحيوية، الهندسة الحيوية، علم الأحياء السرطان، علم الأحياء الجزيئي، كرات الدم الحمراء، الإندوسومات، RNA الصغيرة التدخل، والعلاج الجيني، لطب النانوي، والتسليم الجينات، النانوية، الهروب دخلول؛ جسيم داخلي، الاتجار داخل الخلايا، عصاري خلوي تسليم المخدرات، والأحمر خلايا الدم، فحص
<em>فيفو السابقين</em> خلية الدم الحمراء الفحص انحلال الدم لتقييم درجة الحموضة التي تستجيب لتسليم وكلاء Endosomolytic عصاري خلوي من أدوية Biomacromolecular
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evans, B. C., Nelson, C. E., Yu, S.… More

Evans, B. C., Nelson, C. E., Yu, S. S., Beavers, K. R., Kim, A. J., Li, H., Nelson, H. M., Giorgio, T. D., Duvall, C. L. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. J. Vis. Exp. (73), e50166, doi:10.3791/50166 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter