Summary
용혈 분석은 세포 내화물 배달 약물 전달 시스템 'cytocompatibility과 endosomolytic 활동의 빠른, 높은 처리량 화면으로 사용할 수 있습니다. 검정은 환경 산도의 함수로 적혈구 멤브레인의 중단을 측정합니다.
Abstract
엔도-lysosomal 소포를 구성 인지질의 bilayers은 세포 내 표적에 대한 생물학적 약물의 전달에 장벽을 야기 할 수 있습니다. 이 장벽을 극복하기 위해, 합성 약물 캐리어의 수는 적극적으로 endosomal 멤브레인을 방해하고 세포질로화물을 제공하도록 설계되었습니다. 여기, 우리는 세포 내 약물 전달 시스템의 cytocompatibility 및 endosomolytic 활동에 대한 신속하고 높은 처리량 화면으로 사용할 수있는 용혈 분석을 설명합니다.
용혈 분석에서 인간의 적혈구와 테스트 자료는 세포, 초기 endosomal, 늦은 엔도-lysosomal 환경을 모방 정의 PHS의 버퍼의 Co-incubated 수 있습니다. 펠렛 그대로 적혈구에 원심 분리 단계 후, 매체에 발표 헤모글로빈의 양이 spectrophotometrically (가장 동적 범위 405 nm의) 측정됩니다. %의 적혈구 장애는 이후 긍정적 인 제어 samp에 상대적으로 정량화된다레 세제로 lysed. 이 모델 시스템에서 적혈구 막에는 엔도-lysosomal 소포를 동봉 지질 이중층 막에 대한 대리 역할을합니다. 원하는 결과는 physiologic pH를 (7.4) 약 산도 5-6.8에서 엔도-lysosomal 산도 범위에서 강력한 용혈에서 무시할 용혈 수 있습니다.
Introduction
세포 내부에 많은 잠재적 영향력이 치료 대상이 있지만, 대리인의 세포 내 전달에 중요한 도전을 안겨주고 있습니다. 자주, 약물, 특히 biologics는 exocytosis를 통해 세포에 의해 internalized와 소포로 인신 매매 중 엔도-lysosomal 경로를 통해 내용의 저하로 연결, 또는 세포의 뒤쪽 shuttled 아르 수 있습니다. 후자의 과정에서 1 내부 pH는 소포의 효소의 활동을위한 최적의 산도입니다 약 5-6로 산성화되는 등 라이소자임 등이 칸에서 기능 2.
최근 자료 수는 특별히이 산성화가 자신의화물 cytosolic 전달을 촉진하기 endosomes 활용하여 설계되었습니다. 이 방법의 한 예는 그의 핵심 physiologic pH를 (예 : 7.4)에서 zwitterionic 및 충전 중립입니다 합성, 고분자 마이셀의 나노 입자를 사용합니다. 그러나, 산도 6.0에서- 6.5, 고분자는 protonated이되고 마이셀 코어를 destabilizes 그물 긍정적 인 요금을 습득하고, 노출 된 폴리머 세그먼트과 상호 작용할 수 있으며 endosomal 멤브레인을 방해. 이 활동은 그들의 cytosolic 목표에 액세스 할 수 있습니다 펩타이드 및 핵산 기반 치료학의 endosomal 탈출을 홍보하기 위해 표시되었습니다. 막 장벽을 방해 endosomal 탈출을 중재하기 위해 개발 방법의 3,4 다른 예는 또는 'fusogenic'펩티드를 포함 인지질 이중층에 막 융합 또는 과도 기공 형성을 중재 할 수 있습니다 단백질이. 같은 폴리 (propylacrylic 산)와 같은 음이온 알킬 아크릴 산의 5 Homopolymers 또 다른 잘 공부 접근 방법이며, 이러한 고분자에 펜던트 카르 복실 산의 protonation 상태를 전환 해주는 엔도-lysosomal 산도 범위에서 소수성으로, 막 중단 상태입니다. 6,7
endosomolytic 행동을 검사에 대해 하나의 유용한 모델 시스템은 전자입니다X 생체의 산도에 의존 용혈 분석 8.이 모델 시스템에서, 적혈구 막에는 엔도-lysosomal 소포를 동봉 지질 이중층 막에 대한 대리 역할을합니다. 이 generalizable 모델이 세포 관통 펩티드 및 기타 고분자 유전자 전달 시스템의 endosomolytic 행동을 평가하는 다른 사용되었습니다. 8-11이 실험에서 인간의 적혈구와 테스트 자료는 모방 정의 PHS에서 버퍼에 공동 incubated 아르 세포 (7.4), 초 (6.8) endosomal, 그리고 엔도-lysosomal 하순 (<6.8) 환경. 부화 기간 동안 출시 된 헤모글로빈의 양이 세제로 lysed 긍정적 인 제어 샘플에 출시 헤모글로빈의 양에 표준화되어 적혈구 용해의 측정으로 정량화되어 있습니다.
잠재적 endosomolytic 시험 자료의 작은 도서관을 심사에서, 하나는 산도 7.4에서 더 용혈을 생산하지 그 샘플을 추론하지만, 상당히 고농도의 헛기침 수산도 <6.5에서 olysis은 cytosolic 약물 전달을위한 가장 효과적이고 cytocompatible 후보 될 것입니다. 이 기준에 맞는 자료를 무차별 엔도-lysosomal 구획에 국제화에 따라 지역의 pH의 감소에 노출되는 때까지 지질 이중층의 세포막 (세포 독성을 일으킬 수 IE)를 파괴 불활성이 아닌 상태로 유지 될 것으로 예상됩니다.
이 프로토콜에서는 적혈구는 인간의 기증자로부터 분리되며, 산도 5.6, 6.2, 6.8, 또는 실험 endosomolytic 약물 전달 에이전트와 7.4에서 공동 incubated. 그대로 적혈구는 pelleted 있으며, supernatants은 (lysed 적혈구에서 출시 헤모글로빈을 포함) 플레이트 리더 (그림 1)를 통해 헤모글로빈의 특성 흡광도를 분석하고 있습니다.
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Protocol
1. 버퍼 및 시험 에이전트의 작성 및 살균
- 150 MM NaCl 버퍼 : nanopure 물 500 ML에 4.383 g NaCl의 결정을 디졸브.
- 산도 버퍼 : 일 염기의 및 이염 기성의 인산 나트륨의 적절한 양을 혼합하여 pH를 5.6, 6.2, 6.8 및 7.4에서 인산염 버퍼를 준비합니다. 샘플 등 구연산 버퍼로 다음 낮은 산도 값 (즉, 산도가 <5.6) 더 적절한 버퍼에서 테스트 할 경우 사용되어야합니다. 버퍼 요리법은 쉽게 이용하실 수 있으며, 예를 들어 참조는 여기에서 제공되었습니다. 12
- 병 꼭대기에 진공 여과 장치를 다시 확인 버퍼 산도의를 통해 위에서 언급 한 모든 버퍼를 검사.
- 20% 트리톤 X-100 (긍정적 제어) : 믹스 20 ML 순수 튼 nanopure 물 80 ML의 X-100. 힘차게 소용돌이과 분해하는 sonicate. 사용하기 전에 하룻밤 실온에서 둡니다.
2. 적혈구의 작성
- 혈액 FR의 25 ML을 확보응고를 방지하기 K 2 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 코팅 Vacutainer 튜브에 직접 그려 톰 익명의 인간 공여체.
참고 : 모든 절차는 해당 기관 검토위원회 (IRB) 및 venipuncture, 혈액 수집하여 사전 승인을 받아야합니다는 기증자에게 위험을 최소화하기 위해 훈련 phlebotomist가 수행해야합니다. 표준 정맥 절개 절차는 다른 출판되었습니다. 13
- 5 분, 그리고 혈소판의 마크 수준 (빨강, 낮은 층) 및 플라즈마 (노란색, 상부 층) 관에 500 XG에서 혈액을 원심 분리기.
- micropipettor을 통해 부드럽게 플라즈마를 대기음, 표백제로 추가 biohazardous 폐기물로 폐기하십시오.
- 150 MM NaCl 용액으로 표시된 선 (플라즈마의 원래 수준)에 혈소판 관을 입력합니다. 모자와 부드럽게 혼합 할 수있는 몇 번 반전. 5 분 500 XG에 원심 분리기.
- 다시 혈액 세포를 씻어 단계 2.3-2.4를 반복합니다. 그런 다음 supernat를 대기음개미와 산도 7.4에서 PBS로 교체하십시오. 혼합하는 반전.
- 테스트 할 각 산도에 해당하는, 균일하게 사 튜브에 혈액을 분할. 테스트 할 각 산도 (5.6, 6.2, 6.8, 7.4)에 따라 튜브를 붙입니다.
- 5 분 500 XG에서 혈액 튜브를 원심 분리기. 튜브의 레벨을 표시 한 후 표면에 뜨는 대기음.
- 적절한 산도 (로 2.6에 표시된)의 버퍼로 표시 줄에 각 관을 입력합니다.
- 라벨 네 50 ML 원뿔 튜브 (테스트에 산도를 하나씩), 각 원추형 튜브에 적절한 산도의 PBS의 pipet 49 ML.
- 1시 50분 희석에 해당하는 관으로 적혈구 (동일 PH) 1 ML을 추가합니다. 시각 흐린해야하며 방해받지 왼쪽하면 해결됩니다 희석 혈액을 검사한다. 더 펠렛 형태 경우, 세포는 lysed 있습니다.
3. 용해 분석 96 자 판 설치 및 정량화
- 테스트 할 20x 원하는 최종 농도에서 모든 실험 약물 투여 요원 재고 솔루션을 준비 (검정약물 전달 에이전트의 10 μl + 최종 테스트 혼합물로 원래의 약물 전달 에이전트 20분의 1 희석으로 이어지는 190 μl 희석 적혈구를)됩니다. 20, 100, 및 800 μg / ML의 주식은 각각 1, 5, 40 μg / ML의 최종 테스트 농도의 결과로, 제안합니다.
- V-하단에 각각의 재고 솔루션 96 - 웰 플레이트의 Pipet 10 μl. 최적의 결과를 얻으려면, 세중의 각 샘플을로드하거나 겹.
참고 : 쉽게, 그것은 별도의 96 - 웰 플레이트가 판 당 N에서 = 3-4로드 (각 농도에서) 각 샘플과 함께 테스트 할 각 산도를 준비해야하는 것이 좋습니다.
- 긍정적 인 제어 우물를 들어, 20 % 트리톤 X-100의 10 μl를 추가합니다.
- 부정적인 제어 우물를 들어, 인산염 버퍼 10 μl를 추가합니다. 테스트 할 같은 산도에서 버퍼를 사용합니다.
- 희석 적혈구의 Pipet 190 μl 각 우물 (2.10 참조), 남아 있는지 셀 재고 솔루션을전송 중에 균일. 힌트 :이 작업을 단순화하는 데 사용하는 멀티 채널 피펫.
- 1 시간 (: 궤도 셰이커 또는 로커를 사용하여 선택 사항)을 37 ° C에서 접시를 품다.
- 500 펠렛 그대로 적혈구에 XG에서 5 분에 대한 번호판을 원심 분리기. 참고 : 원심 분리기에서 판을 제거하고 다음 단계로 수송 할 때주의 처리하고 세포 펠렛을 방해하지 확신 할 수.
- 멀티 채널 pipet 사용하여 깨끗하고 평평한 바닥 96 - 웰 플레이트에 각 우물에서 표면에 뜨는 100 μl를 전송합니다. 참고 : 셀 펠렛가 실수로 어떤 샘플 (들)에 대한 방해를하는 경우, 하나는 표면에 뜨는 이전이 진행 다음 판을 다시 원심 분리기 수 있습니다.
- 플레이트 리더로 supernatants의 흡광도를 측정합니다. 파장의 범위가 (- 541 nm의 400)로 사용할 수 있습니다.
참고 : 다른 판 독자들이 다른 채도 포인트와 민감한있을 수 있습니다, 그래서 나를 위해 파장의 선택asurements는 세제 치료에 의해 유도로 실험 샘플의 용혈 데이터를 안정적으로 최대 용혈에 대한 표준화 할 수 있는지 여부에 따라 달라집니다. 이 긍정적 인 컨트롤 샘플의 흡광도 값의 정확한 측정이 필요합니다.
- Microsoft Excel 또는 이와 유사한 데이터 분석 소프트웨어를 사용, 각 산도 (단계 3.4)에 대한 설정 대조군 샘플에서 배경 흡광도 판독의 평균을 찾습니다. 그 산도에서 측정 된 모든 다른 샘플에서이 배경 흡광도 값을 뺍니다.
- 배경 제거 후, 긍정적 인 컨트롤의 평균 흡광도 세제 - 처리 샘플을 (단계 3.3)을 찾습니다. 그런 다음 100 % 용혈을 대표해야하는이 평균 흡광도 값으로 모든 실험 데이터 포인트를 정상화. 마지막으로, 세제 컨트롤도 상대적으로 각 개별에서 발생 %의 용혈을 계산하는 100 % 각각 잘 값을 곱합니다.
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Representative Results
일반적으로 이상적인 산도에 의존 용혈성 문제가 발생할 요원이 마약, 핵산, 또는 다른 bioactive 분자의 cytosolic 제공을위한 최고의 잠재력을 갖추고 있습니다. 이것은 산도 7.4에서 최소한의 용혈을 전시하고 그림 2에 묘사로 에이전트 # 1 예시하지만, endosomal 산도 범위 (<6.5)에서 용혈성 행동의 날카로운 증가하고 있습니다. 이러한 대리인이 hemocompatible되지 않을 수 있습니다 잠재적으로 이러한 농도에서 세포 독성이 될 수 있다고 제안; 일부 에이전트는 생리적 산도 범위 (그림 2 40 μg / ML에서 에이전트 # 2)에서 용혈성 행동의 상당 수준을 발생할 수 있습니다.
시험 물질의 농도 증가, 특히 (- 6.2 5.6) 테스트 낮은 pH의 범위에서 용혈 높은 수준의 대응으로 대부분의 경우, 용혈도 복용에 따라 달라지게된다.
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1 그림. 적혈구 용혈 분석의 개략도. 인간의 적혈구는 분리 physiologic (7.4) 후반 endosomes하기 / 리소좀 (5.6)에서 pH의 범위를 시뮬레이션 버퍼의 일련의 실험 endosomolytic 약물 투여 요원과 incubated 수 있습니다. 최적의 약물 전달 에이전트는 physiologic 산도의 적혈구에 방해가되지 않지만 더 많은 산성 조건에서 강력한 용혈을 전시합니다. %의 용혈을 평가하기 위해, 주변 매체에 헤모글로빈의 출시는 플레이트 리더에서 흡광도를 통해 측정됩니다.
그림 2. 용혈 분석 대표 결과 두 실험 Endos의 행동을 입증omolytic 에이전트는. 첫째, 차량의 평균 450가 (PBS) 제어는 해당 산도에서 시험 다른 샘플에서 공제되었다. 그 후 실험 샘플은 트라이 튼 X-100-처리 적혈구 샘플 450 표준화 및 100 %를 곱한했다. 이러한 컨트롤 샘플을 기반으로 적혈구를 lyse하는 실험 transfection 에이전트의 능력이 계산 될 수있다. 일반적으로 이상적인 endosomolytic 에이전트는 복용에 의존하고 pH의 종속적 인 용혈성 동작을 나타냅니다. 이상적인 대리인 (예 : 에이전트 # 1) 산도 7.4에서 최소한의 용혈하지만, endosomal 산도 범위 (<6.5)에서 용혈성 행동의 날카로운 증가를 나타냅니다. 일부 에이전트는이 요원이 농도에서 세포 독성이 될 수 있다는 제안, 생리 산도 범위 (40 μg / ML에서 에이전트 # 2)에 상당한 용혈성 동작을 나타냅니다. 오류 막대는 4 독립적 인 측정의 표준 편차를 나타냅니다.
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Discussion
endosomolytic 기능을 위해 설계 산도 - 응답 고분자 또는 다른 요원이 신속하게 될 효과적으로 endosome에서 발생 산도 값의 붉은 혈액 세포의 용해 (그림 1을 기준으로 검사를 할 수 있습니다, 산도 6.8 - 초기 endosome, 산도 6.2 - 늦은 endosome, pH를 5.6 - lysosome). 14-17 산도에 따라 달라 용혈은 biomacromolecular의 치료학 (예 : 펩티드, siRNA, ODNs, 단백질)의 endosomal 버전을 중재 할 사업자의 능력을 상영하는 데 사용되어,이 분석의 결과는 세포와 같은 성능을 예측 할 수 있습니다 약물 투여 차량. 따라서 3,4,8,18,19,이 분석은 산도에 따라 달라 막 방해를 기반으로 세포 내 약물 전달을 중재 할 고분자 약물 캐리어의 능력을 측정하는 효과적인 화면을 나타냅니다.
절차에 명시된 바와 같이 용혈은 실험과 치료 적혈구의 supernatants의 분광 측정을 통해 감지에이전트. 따라서 헤모글로빈에 추가, 그것은 단백질 및 탄수화물 등 다른 적혈구 파생 cytosolic 구성 요소를 포함 할 가능성이 있습니다. 다른 구성 요소가 분광 측정에 신호의 작은 금액을 기여 수 있지만, 100 % 용혈은 트라이 튼 X-100과 치료로 인해 적혈구 lysate로 조정되었습니다. 같은 기증자의 모든 적혈구는 헤모글로빈과 다른 분자의 유사한 수준을 포함하는 가정, 우리는 안전하게 '오염'구성 요소가 동일한 혈액 샘플은 모든 테스트에 사용됩니다 특히, 용혈 측정에 어떤 유물에 기여하지 않습니다 결론 할 수 있습니다. 그러나,이 특정 혈액 기증자에 대한, 혈액 조성과 혈소판의 작은 일상 유사하기 때문에, 내부 통제 샘플 (단계 3.3-3.4, 3.10-3.11)해야 될 가능성이 있는데, 가능성을 강조 모든 실험 분석했다.
하나는 항상 밀접하게 원시 배에 힘을 검사해야orbance 데이터입니다. 이 그림 2에 표시된 정규화 된 예제 데이터에 감사 할 수 있지만, 이러한 트라이 튼과 같은 합성 세제는 X-100을 효과적으로에 관계없이 산도의 적혈구 세포막을 불안정하게하고, 하나는 긍정적 인 컨트롤에서 샘플 다양성에 거의 샘플을 볼 수있을 것입니다. 트라이 튼의 흡광도 스펙트럼은 X-100이 검정 권장 400-600 nm의 범위에서 봉우리를 포함하지 않으며, 따라서, 또한. 실험 데이터의 정상화와 함께 (20) 방해해서는 안 대조군 샘플에 대해 하나 중요한 사항을 준수하지 말아야 (즉, 심지어 가장 산성 버퍼는 일반적으로이 기간에 용혈를 생성하지 않습니다)를 사용 버퍼의에서 1 시간의 부화 후 용혈. 대조군 샘플에 대한 배경 수치가 밀접하게 대략적인 배경 흡광도 수치가 신선한 버퍼에 촬영해야합니다.
이상적으로, 연구자는 expe을 특성화 보완 전략을 채용합니다rimental 약물 전달 시스템. 용혈 분석은 자연스럽게 - 발생 biomembranes에 대한 초기 endosomolytic 에이전트 진단을위한 유리한하지만, cytosolic 배달 에이전트를 테스트하기위한 약물 전달 연구의 armamentarium에있는 많은 도구 중 하나로서 간주해야합니다. 예를 들어, 용혈 분석 한 잠재적 결점은 endosomal 멤브레인의 생물학적 모델로 적혈구 막을 활용한다는 것입니다. 다른 보완 assays의 다양한 endosomal 막 조성과 행동을 모방하기 위해 개발 된이 그러나, endosomal 멤브레인의 조성과 지질 내용은 세포 유형에 따라 다르며 정확하게 혈액 세포 막에 의해 recapitulated 할 수 없습니다. 1. 21 22 한 대안은 형광 공명 에너지 전달 (걱정) - 침묵 주변 미디어에 fluorophores의 liposomes 및 릴리스 unquenched에 따라 불안정화가 fluorophores를 포함하는 liposomes을 활용하는 것입니다. 연구 일에이 방법을 채용에서 unquenched fluorophores의 정량화은 그 페이로드의 endosomal 탈출을 중재 할 수있는 차량의 능력과 상관 관계하는 것으로 확인되었습니다. 21,23 현미경 기반 측정에 대한 보완이보다 강력한하지만, 낮은 처리량 방법을 제공 할 수 있습니다 용혈 분석. 예를 들어, 염료 표시 리소좀 (예를 들어 생활 기술에 의해 LysoTracker)와 운송인의 colocalization 또는 약물 자체를 평가하는 것이 일반적이거나 트래픽 경로 (예 pHrodo의 산도에 민감한 염료 캐리어 복합 또는 약물 사용 나타낼 수있다 생명 기술). 24-26
endosomolytic 전달 시스템이 cytosolic화물 배달을 달성하기 위해 확인되면 용혈 분석도 endosomal 탈출가 발생하는을 통해이 장치에 정보를 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, polyethyleneimine에 따라 유전자 배달 차량 (PEI) 인지질의 세포막을 방해 할 수있는 고유 한 능력을 부족중성 또는 산성 pH의의. 11,27 대신에, PEI는 '양자 스펀지'효과를 통해 cytosolic 유전자 전달을 실현. 국제화 후, PEI이 구획을 시게하다 할 endosomal 막에서 펌핑을 "흡수"양자로 endosome을 버퍼. 결국,이 endosome 내부 초과 양자 및 카운터 이온의 축적로 연결됩니다. 삼투압 물 유입, 소포의 붓기, 그리고 endosomolysis의 상승이 발생합니다. 따라서 양자의 스폰지 효과의 성공은 endosome에 PEI의 중요한 농도의 축적을 필요로. '양자 스펀지'효과를 통해 endosomal 방해를 달성 27 배달 차량이 실제로 달성 적혈구 또는 liposomes, 그들의 효능을 방해하지 않습니다 세포 내 약물 전달은 삼투압 계산을 통해 평가하거나, 체외 현미경, 또는 기능 연구에 있어야합니다.
결론적으로, 용혈 분석이 여기에 설명생물학적 의약품의 세포 내 전달을 위해 설계 제약 에이전트를 진단을위한 신뢰할 수있는 모델입니다. 이 분석은 세포 내 타겟 biologics를 제공 제제의 급속한 발전을 가능하게, 마약 배달 차량 검사의 높은 처리량 방법을 제공합니다.
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Disclosures
IRB 승인 : 인간의 과목을 포함하는 절차는 밴더빌트 대학 기관 심사위원회 (IRB, 프로토콜 # 111251)에 의해 승인되었습니다. 관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 국방부를 통해 Congressionally 감독 의학 연구 프로그램 (# W81XWH-10-1-0445), 보건 국립 연구소 (NIH R21 HL110056)와 미국 심장 협회 (# 11SDG4890030)를 자금을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
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