Summary
एक hemolysis परख दवा वितरण प्रणाली और intracellular माल डिलीवरी लिए endosomolytic गतिविधि cytocompatibility की एक तेजी से, उच्च throughput स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. परख पर्यावरण पीएच के एक समारोह के रूप में एरिथ्रोसाइट झिल्ली के विघटन के उपाय.
Abstract
फॉस्फोलिपिड bilayers कि एंडो - lysosomal vesicles का गठन जीवविज्ञान दवाओं के intracellular लक्ष्य को प्रसव के लिए एक बाधा पैदा कर सकते हैं. इस बाधा को दूर करने के लिए, सिंथेटिक दवा वाहक के एक नंबर के लिए सक्रिय रूप से endosomal झिल्ली बाधित और cytoplasm में माल देने के लिए इंजीनियर किया गया है. यहाँ, हम hemolysis परख है, जो तेजी से, cytocompatibility और intracellular दवा वितरण प्रणाली के endosomolytic गतिविधि के लिए उच्च throughput स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन करता है.
Hemolysis परख में, मानव लाल रक्त कोशिकाओं और परीक्षण सामग्री परिभाषित PHS कि बाह्य है, जल्दी endosomal, और देर एंडो lysosomal वातावरण की नकल पर buffers में सह incubated. गोली बरकरार लाल रक्त कोशिकाओं को एक centrifugation कदम के बाद, हीमोग्लोबिन की मात्रा मध्यम में जारी spectrophotometrically (सबसे अच्छा गतिशील रेंज के लिए 405 एनएम) में मापा जाता है. प्रतिशत लाल रक्त कोशिका विघटन तो सकारात्मक नियंत्रण samp सापेक्ष मात्रा निर्धारित हैएक साबुन के साथ लेस lysed. इस मॉडल प्रणाली में एरिथ्रोसाइट झिल्ली लिपिड bilayer झिल्ली कि एंडो - lysosomal vesicles संलग्न करने के लिए एक किराए के रूप में कार्य करता है. वांछित परिणाम शारीरिक पीएच (7.4) और एंडो lysosomal लगभग 5-6.8 पीएच से पीएच रेंज में मजबूत hemolysis नगण्य hemolysis है.
Introduction
हालांकि वहाँ कई सेल के अंदर संभावित उच्च प्रभाव चिकित्सकीय लक्ष्य कर रहे हैं, एजेंटों के intracellular वितरण एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गया है. अक्सर, दवाओं, विशेष रूप से biologics, कोशिकाओं द्वारा भली भाँति हैं और vesicles में तस्करी कि या तो उनकी सामग्री की गिरावट एंडो - lysosomal मार्ग के माध्यम से करने के लिए नेतृत्व कर रहे हैं या वापस सेल के बाहर shuttled exocytosis के माध्यम से बाद की प्रक्रिया में, आंतरिक पीएच 1. vesicles के लगभग 5-6 acidified है, जो एंजाइमों की गतिविधि के लिए इष्टतम पीएच है कि इस डिब्बे में लाइसोजाइम के रूप में इस तरह के समारोह 2.
हाल ही में, सामग्री की संख्या विशेष रूप से किया गया है का लाभ उठाने के अम्लीकरण के लिए अपने माल की साइटोसोलिक वितरण की सुविधा endosomes इंजीनियर. इस दृष्टिकोण का एक उदाहरण सिंथेटिक बहुलक micelle नैनोकणों जिसका मुख्य शारीरिक पीएच (7.4) अर्थात् zwitterionic और आरोप तटस्थ है का उपयोग करता है. हालांकि, पीएच 6.0 पर- 6.5, पॉलिमर protonated हो जाते हैं और एक सकारात्मक चार्ज शुद्ध है कि micelle कोर destabilizes के अधिग्रहण, और उजागर बहुलक क्षेत्रों के साथ बातचीत और endosomal झिल्ली को बाधित. इस गतिविधि पेप्टाइड और न्यूक्लिक एसिड आधारित चिकित्सा विज्ञान की endosomal भागने को बढ़ावा देने के लिए, उन्हें अपने साइटोसोलिक लक्ष्य तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है के लिए दिखाया गया है endosomal भागने मध्यस्थता है कि झिल्ली बाधा को बाधित करने के लिए विकसित की विधियों की 3,4 अन्य उदाहरण है. 'Fusogenic' पेप्टाइड्स शामिल हैं या प्रोटीन है कि फॉस्फोलिपिड bilayer में झिल्ली संलयन या क्षणिक ताकना गठन मध्यस्थता कर सकते हैं. anionic (propylacrylic एसिड) पाली में alkyl एक्रिलिक एसिड की 5 homopolymers दूसरे दृष्टिकोण अच्छी तरह से अध्ययन कर रहे हैं, और इन पॉलिमर में, लटकन कार्बोक्जिलिक एसिड के protonation राज्य संक्रमण पैदा करती है एक hydrophobic में एंडो lysosomal पीएच पर्वतमाला में राज्य झिल्ली विघटनकारी 6,7.
स्क्रीनिंग endosomolytic व्यवहार के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली ई हैx vivo निर्भर पीएच hemolysis इस मॉडल प्रणाली में. परख 8, एरिथ्रोसाइट झिल्ली लिपिड bilayer झिल्ली कि एंडो - lysosomal vesicles संलग्न करने के लिए एक किराए के रूप में कार्य करता है. इस generalizable मॉडल दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया गया है सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स और अन्य polymeric जीन वितरण प्रणाली के endosomolytic व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रयोग में 8-11, मानव लाल रक्त कोशिकाओं और परीक्षा सामग्री buffers में परिभाषित PHS है कि नकल पर सह incubated कोशिकी (7.4), जल्दी (6.8), और endosomal एंडो lysosomal देर वातावरण (<6.8). ऊष्मायन अवधि के दौरान जारी हीमोग्लोबिन की मात्रा लाल रक्त सेल है, जो हीमोग्लोबिन की राशि एक साबुन के साथ सकारात्मक नियंत्रण lysed नमूनों में जारी करने के लिए normalized है की एक उपाय के रूप में मात्रा निर्धारित है.
स्क्रीनिंग से संभावित endosomolytic परीक्षण सामग्री का एक छोटा सा पुस्तकालय, एक कि नमूने है कि पीएच 7.4 में कोई hemolysis उत्पादन अनुमान कर सकते हैं, लेकिन काफी ऊंचा हेम<6.5 पीएच में olysis, साइटोसोलिक दवा वितरण के लिए सबसे प्रभावी और cytocompatible उम्मीदवार होगा. सामग्री है कि इन मानदंडों को फिट करने के लिए निष्क्रिय और अंधाधुंध एंडो lysosomal डिब्बों में internalization के बाद जब तक स्थानीय पीएच में एक बूंद के लिए उजागर झिल्ली bilayer लिपिड (यानी कि cytotoxicity का कारण बन सकता है) को नष्ट नहीं रहने की उम्मीद होगी.
इस प्रोटोकॉल में एरिथ्रोसाइट्स एक मानव दाता से अलग कर रहे हैं और पीएच 5.6, 6.2, 6.8, या 7.4 प्रयोगात्मक endosomolytic दवा वितरण एजेंटों के साथ सह incubated. बरकरार एरिथ्रोसाइट्स pelleted हैं, और supernatants (lysed एरिथ्रोसाइट्स से जारी हीमोग्लोबिन युक्त) हीमोग्लोबिन की विशेषता absorbance के लिए एक प्लेट पाठक (1 चित्रा) के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं.
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Protocol
1. और Buffers और टेस्ट एजेंटों की तैयारी बंध्याकरण
- 150 मिमी NaCl बफर: 4.383 छ NaCl क्रिस्टल nanopure पानी की 500 मिलीलीटर में भंग.
- पीएच Buffers पीएच 5.6, 6.2, 6.8, और 7.4 में एक भस्मक और dibasic सोडियम फॉस्फेट की उचित मात्रा के मिश्रण से तैयार फॉस्फेट buffers. यदि नमूने कम पीएच (यानी पीएच <5.6) तो साइट्रेट बफर के रूप में एक और अधिक उपयुक्त बफर मूल्यों, में परीक्षण किया जा रहे हैं, किया जाना चाहिए. बफर व्यंजनों आसानी से उपलब्ध हैं, और 12 एक उदाहरण संदर्भ यहाँ प्रदान की गई है.
- सभी एक निर्वात बोतल शीर्ष निस्पंदन उपकरण और फिर से जांच बफर पीएच के माध्यम से ऊपर उल्लेख किया buffers जीवाणुरहित.
- 20% ट्राइटन सकारात्मक (नियंत्रण) X-100: Mix 20 मिलीलीटर शुद्ध ट्राइटन nanopure पानी की 80 मिलीलीटर में X-100. सख्ती भंवर और भंग करने के sonicate. उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर रातोंरात छोड़ दो.
2. एरिथ्रोसाइट्स की तैयारी
- रक्त fr की 25 मिलीलीटर प्राप्तओम एक गुमनाम मानव दाता, 2-EDTA लेपित Vacutainer ट्यूबों कश्मीर में सीधे खींचा जमावट को रोकने के.
नोट: सभी प्रक्रियाओं उचित संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी), और venipuncture और रक्त संग्रह किया जाना चाहिए द्वारा मंजूरी दे दी एक प्रशिक्षित phlebotomist द्वारा निष्पादित किया जाना चाहिए क्रम में दाता के जोखिम को कम करने के लिए. मानक फ़स्त खोलना प्रक्रियाओं कहीं प्रकाशित किया गया है 13.
- 500 XG पर 5 मिनट hematocrit के निशान के स्तर (लाल, निचली परत) और प्लाज्मा ट्यूब पर (पीले, ऊपरी परत) के लिए रक्त अपकेंद्रित्र.
- प्लाज्मा धीरे एक micropipettor माध्यम Aspirate, ब्लीच में जोड़ने के लिए, और biohazardous कचरे में त्यागें.
- के रूप में चिह्नित लाइन (प्लाज्मा के मूल स्तर) hematocrit ट्यूब 150 मिमी NaCl समाधान के साथ भरें. कैप और मिश्रण धीरे कुछ बार पलटना. 5 मिनट के लिए 500 XG अपकेंद्रित्र.
- 2.3-2.4 दोहराएँ कदम को रक्त कोशिकाओं को फिर से धोना. तो supernat aspirateचींटी और पीबीएस के साथ बदलने में पीएच 7.4. मिश्रण करने के लिए उलटें.
- रक्त चार ट्यूबों में समान रूप से विभाजित, प्रत्येक पीएच है कि परीक्षण किया जाएगा करने के लिए इसी. प्रत्येक के लिए परीक्षण किया जा पीएच (5.6, 6.2, 6.8, 7.4) के अनुसार ट्यूबों लेबल.
- 5 मिनट के लिए 500 XG में रक्त ट्यूबों अपकेंद्रित्र. मार्क ट्यूब पर स्तर है, तो सतह पर तैरनेवाला aspirate.
- के रूप में चिह्नित लाइन के लिए उपयुक्त पीएच (के रूप में 2.6 में संकेत) के बफर के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें.
- चार लेबल 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (एक परीक्षण के लिए पीएच प्रति), और pipet प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब में उचित पीएच के पीबीएस के 49 मिलीलीटर.
- इसी ट्यूब में एक 1:50 कमजोर पड़ने के लिए एरिथ्रोसाइट्स (एक ही पीएच) के 1 मिलीलीटर जोड़ें. दिखने में पतला खून है, जो और turbid किया जाना चाहिए अगर undisturbed छोड़ आदी हो जाएगा का निरीक्षण किया. यदि कोई गोली रूपों, कोशिकाओं lysed है.
3. Lysis परख 96 अच्छी तरह से थाली सेटअप और मात्रा
- सभी प्रयोगात्मक दवा वितरण एजेंटों के शेयर समाधान तैयार करने के लिए, 20x वांछित अंतिम एकाग्रता में परीक्षण किया जा (परखदवा वितरण एजेंट के 10 μl + 190 μl पतला लाल रक्त कोशिकाओं, अंतिम परीक्षण मिश्रण में मूल दवा वितरण एजेंट की एक कमजोर पड़ने / 20 1 अग्रणी) ले जाएगा. 20, 100, और 800 छ / मिलीलीटर के स्टॉक्स में सुझाव दिया है, कर रहे हैं और 1, 5, और 40 / छ मिलीलीटर, क्रमशः का अंतिम परीक्षण सांद्रता में जिसके परिणामस्वरूप.
- Pipet वि तल में प्रत्येक स्टॉक समाधान 96-अच्छी तरह से प्लेटों के 10 μl. इष्टतम परिणामों के लिए, तीन प्रतियों में प्रत्येक नमूना लोड या चतुर्गुण.
नोट: आसानी के लिए, यह सिफारिश की है कि एक अलग प्लेट 96-प्रत्येक पीएच के लिए अच्छी तरह से तैयार किया जाना चाहिए, प्रत्येक नमूना के साथ परीक्षण किया (प्रत्येक एकाग्रता में) लोड n = थाली प्रति 3-4.
- सकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए, 20% ट्राइटन X-100 के 10 μl जोड़ें.
- नकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए, फॉस्फेट बफर के 10 μl जोड़ें. ही परीक्षण किया जा पीएच बफर का प्रयोग करें.
- Pipet पतला एरिथ्रोसाइट्स की 190 μl एक अच्छी तरह से (2.10 देखें), यकीन है कि सेल स्टॉक समाधान बना रहता हैहस्तांतरण के दौरान समरूप है. सुझाव: मल्टी चैनल विंदुक का उपयोग करने के लिए इस काम को आसान बनाने में.
- एक घंटे (एक कक्षीय हिलनेवाला या घुमाव उपयोग वैकल्पिक) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.
- 500 गोली बरकरार एरिथ्रोसाइट्स XG पर 5 मिनट के लिए प्लेटों अपकेंद्रित्र. नोट: जब अपकेंद्रित्र से थाली हटाने और अगले कदम के लिए परिवहन, देखभाल के साथ संभाल और सेल गोली को बाधित नहीं करने के लिए कुछ हो.
- एक multichannel pipet का उपयोग करते हुए, एक स्पष्ट, फ्लैट तली 96-अच्छी तरह से थाली में हर अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला के 100 μl हस्तांतरण. नोट: अगर सेल गोली गलती से किसी भी नमूने (ओं) के लिए परेशान है, एक थाली फिर से अपकेंद्रित्र कर सकते हैं और फिर सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण के साथ आगे बढ़ना है.
- Supernatants के absorbance उपाय एक थाली पाठक के साथ. ध्यान दें कि तरंगदैर्य की एक सीमा (400 - 541 एनएम) का उपयोग किया जा सकता है.
नोट: अलग प्लेट पाठकों अलग संतृप्ति अंक और संवेदनशीलता हो सकता है, तो मेरे लिए एक तरंग दैर्ध्य की पसंदasurements चाहे या नहीं प्रयोगात्मक नमूने से hemolysis डेटा मज़बूती अधिकतम hemolysis के खिलाफ सामान्यीकृत किया जा सकता है के रूप में डिटर्जेंट उपचार द्वारा प्रेरित पर निर्भर करता है. यह सकारात्मक नियंत्रण के नमूने के absorbance मूल्यों का सही माप की आवश्यकता है.
- Microsoft Excel या एक समान डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग, नकारात्मक नियंत्रण प्रत्येक पीएच (3.4 कदम) के लिए स्थापित नमूनों से पृष्ठभूमि absorbance रीडिंग के औसत लगता है. अन्य सभी नमूनों है कि पीएच में मापा गया से इस पृष्ठभूमि absorbance मूल्य घटाना.
- पृष्ठभूमि घटाव के बाद, सकारात्मक नियंत्रण के औसत डिटर्जेंट इलाज absorbance नमूने (3.3 कदम) लगता है. तो इसका मतलब यह absorbance मूल्य सभी प्रयोगात्मक डेटा बिंदुओं मानक के अनुसार, जो 100% hemolysis का प्रतिनिधित्व करना चाहिए. अंत में, 100% से प्रत्येक अच्छी तरह से मूल्य गुणा% hemolysis कि प्रत्येक डिटर्जेंट नियंत्रण के सापेक्ष व्यक्ति में हुई गणना.
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Representative Results
आमतौर पर, एजेंटों है है कि आदर्श पीएच निर्भर रक्तलायी व्यवहार एक्ज़िबिट दवाओं, nucleic एसिड, या अन्य bioactive अणुओं के साइटोसोलिक प्रसव के लिए उच्चतम क्षमता है. यह # 1 एजेंट द्वारा उदाहरण है के रूप में 2 चित्रा, है जो पीएच 7.4 में न्यूनतम hemolysis दर्शाती में चित्रित किया गया है, लेकिन endosomal पीएच पर्वतमाला (<6.5) में एक रक्तलायी व्यवहार में तेजी से वृद्धि हुई है. कुछ एजेंट शारीरिक पीएच पर्वतमाला (40 ग्राम / मिलीलीटर # 2 एजेंट, चित्रा 2) पर रक्तलायी व्यवहार के महत्वपूर्ण स्तर का प्रदर्शन कर सकते हैं, सुझाव है कि इन एजेंटों hemocompatible नहीं हो सकता है और संभवतः इन सांद्रता में साइटोटोक्सिक हो सकता हो सकता है.
ज्यादातर मामलों में, hemolysis भी खुराक पर निर्भर है, के रूप में परीक्षा सामग्री की बढ़ती सांद्रता hemolysis के उच्च स्तर के साथ, विशेष रूप से कम पीएच (5.6 - 6.2) का परीक्षण किया पर्वतमाला में अनुरूप.
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चित्रा 1. लाल रक्त कोशिका hemolysis परख के योजनाबद्ध आरेख मानव एरिथ्रोसाइट्स अलग कर रहे हैं प्रयोगात्मक शारीरिक (7.4) के लिए देर हो endosomes / lysosomes (5.6) से पीएच रेंज अनुकरण buffers की एक श्रृंखला में endosomolytic दवा वितरण एजेंटों के साथ incubated. इष्टतम दवा वितरण एजेंटों शारीरिक पीएच में एरिथ्रोसाइट्स बाधित नहीं लेकिन अधिक अम्लीय परिस्थितियों में मजबूत रक्तापघटन प्रदर्शन होगा. प्रतिशत hemolysis का आकलन, मध्यम आसपास में हीमोग्लोबिन की रिहाई के एक प्लेट पाठक पर absorbance के माध्यम से मापा जाता है.
चित्रा 2. प्रतिनिधि एक hemolysis परख के परिणाम दो प्रयोगात्मक Endos के व्यवहार का प्रदर्शनसबसे पहले, omolytic एजेंटों. वाहन के औसत 450 (पीबीएस) नियंत्रण कि पीएच में अन्य नमूनों का परीक्षण से घटाया गया था. बाद में, प्रयोगात्मक नमूने ट्राइटन X-100-इलाज एरिथ्रोसाइट नमूने की एक 450 normalized थे और 100% से गुणा. इन पर नियंत्रण के नमूने के आधार पर, प्रयोगात्मक अभिकर्मक एजेंटों की क्षमता एरिथ्रोसाइट्स lyse गणना की जा सकती है. आमतौर पर, आदर्श endosomolytic एजेंट खुराक पर निर्भर है और पीएच निर्भर रक्तलायी व्यवहार दिखा रहे हैं. आदर्श एजेंट (जैसे # 1 एजेंट के रूप में) 7.4 पीएच में न्यूनतम hemolysis, लेकिन endosomal पीएच पर्वतमाला (<6.5) में hemolytic व्यवहार में एक तेज वृद्धि दिखा रहे हैं. कुछ एजेंट शारीरिक पीएच पर्वतमाला (40 ग्राम / मिलीलीटर # 2 एजेंट) के प्रदर्शन में पर्याप्त रक्तलायी व्यवहार, सुझाव है कि इन एजेंटों के इन सांद्रता में साइटोटोक्सिक हो सकता है. त्रुटि सलाखों 4 स्वतंत्र माप मानक विचलन का संकेत मिलता है.
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Discussion
पीएच उत्तरदायी पॉलिमर या अन्य एजेंट endosomolytic समारोह के लिए बनाया गया हो तेजी से और प्रभावी ढंग से पीएच endosome में सामना करना पड़ा मूल्यों में लाल रक्त कोशिकाओं की lysis (1 चित्र के आधार पर जांच कर सकते हैं, पीएच 6.8 जल्दी endosome, 6.2 पीएच - देर endosome, 5.6 पीएच - lysosome) 14-17 hemolysis पीएच निर्भर वाहकों की क्षमता के लिए biomacromolecular चिकित्सा विज्ञान (जैसे पेप्टाइड siRNA, ODNs, प्रोटीन) की endosomal रिहाई मध्यस्थता स्क्रीन का इस्तेमाल किया गया है, और इस परख के परिणाम के रूप में एक intracellular प्रदर्शन के भविष्य कहनेवाला हो सकता है. दवा वितरण वाहन 3,4,8,18,19 इस प्रकार, इस परख का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक प्रभावी स्क्रीन polymeric दवा वाहक की क्षमता के लिए intracellular दवा उनके झिल्ली पीएच निर्भर विघटन के आधार पर वितरण मध्यस्थता गेज.
प्रक्रिया के रूप में उल्लेख किया, hemolysis लाल रक्त कोशिकाओं के supernatants spectrophotometric माप प्रयोगात्मक के साथ इलाज के माध्यम से पता चला हैएजेंटों. इसलिए, हीमोग्लोबिन के अलावा, यह प्रोटीन और कार्बोहाइड्रेट सहित अन्य एरिथ्रोसाइट व्युत्पन्न साइटोसोलिक घटकों, शामिल होने की संभावना है. जबकि इन अन्य घटकों spectrophotometric माप के लिए संकेत की एक छोटी राशि का योगदान कर सकते हैं, 100% hemolysis एरिथ्रोसाइट Triton X-100 के साथ इलाज से उत्पन्न lysate कैलिब्रेटेड था. मान लिया जाये कि एक ही दाता से सभी एरिथ्रोसाइट्स हीमोग्लोबिन और अन्य biomolecules के समान स्तर पर होते हैं, हम सुरक्षित रूप से निष्कर्ष है कि 'contaminating घटकों किसी भी कलाकृतियों hemolysis माप योगदान नहीं, विशेष रूप से यदि एक ही रक्त नमूना सभी परीक्षणों के लिए प्रयोग किया जाता है कर सकते हैं. हालांकि, यह संभावना है कि, किसी भी रक्त दाता के लिए, वहाँ रक्त संरचना और hematocrit में छोटे एक दिन का बदलाव, और इसलिए, आंतरिक नियंत्रण (3.3-3.4 कदम, 3.10-3.11) नमूने होना चाहिए होने की संभावना पर प्रकाश डाला गया सभी प्रयोगों के लिए विश्लेषण.
एक भी हमेशा निकट कच्चे पेट की जांच करनी चाहिएorbance डेटा. हालांकि यह सामान्यीकृत उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया डेटा में नहीं की सराहना कर सकते हैं, ट्राइटन के रूप में इस तरह के डिटर्जेंट X-100 प्रभावी ढंग से एरिथ्रोसाइट झिल्ली पीएच की परवाह किए बिना को अस्थिर करने, और एक सकारात्मक नियंत्रण में नमूना परिवर्तनशीलता बहुत कम नमूना देखने की उम्मीद करनी चाहिए. absorbance स्पेक्ट्रम की ट्राइटन X-100 400-600 एनएम इस परख के लिए सिफारिश की रेंज में चोटियों को शामिल नहीं करता, और इसलिए, प्रयोगात्मक डेटा सामान्य के साथ हस्तक्षेप नहीं 20 इसके अलावा चाहिए, नकारात्मक नियंत्रण के नमूने के लिए एक महत्वपूर्ण नहीं का पालन करना चाहिए 1 घंटा ऊष्मायन के बाद किसी भी प्रयोग किया जाता है (यानी भी सबसे अम्लीय बफर आम तौर पर इस समय सीमा पर hemolysis उत्पन्न नहीं करता है) buffers में hemolysis. नकारात्मक नियंत्रण के नमूने पर पृष्ठभूमि रीडिंग के निकट लगभग पृष्ठभूमि absorbance रीडिंग ताजा buffers पर लिया जाना चाहिए.
आदर्श रूप में, शोधकर्ताओं ने पूरक रणनीतियों को रोजगार के लिए अपने अनुभव विशेषताएँrimental दवा वितरण प्रणाली. hemolysis परख प्रारंभिक स्वाभाविक रूप से घटनेवाला biomembranes पर endosomolytic एजेंट स्क्रीनिंग के लिए लाभप्रद है, लेकिन केवल एक साइटोसोलिक वितरण एजेंटों परीक्षण लिए दवा वितरण शोधकर्ता armamentarium में कई उपकरण के रूप में माना जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, एक hemolysis परख की संभावित कमी यह है कि यह लाल रक्त कोशिका झिल्ली endosomal झिल्ली के लिए एक मॉडल के रूप में जैविक का इस्तेमाल. हालांकि, endosomal झिल्ली के ऊपर और लिपिड सामग्री सेल प्रकार से भिन्न होता है और रक्त कोशिका झिल्ली से नहीं हो सकता है सही recapitulated एक अन्य पूरक assays की एक किस्म है endosomal झिल्ली संरचना और व्यवहार की नकल करने के लिए विकसित किया गया है. 21, 22 करने के लिए एक वैकल्पिक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) quenched fluorophores, जो unquenched और liposomes fluorophores के आसपास मीडिया रिलीज के बाद अस्थिरता बन युक्त liposomes का उपयोग करने के लिए है. अध्ययनों से पता वें मेंइस विधि को रोजगार, unquenched fluorophores की मात्रा का ठहराव के लिए एक वाहन की क्षमता के लिए अपनी पेलोड की endosomal भागने मध्यस्थता के साथ सहसंबंधी पाया गया है 21,23 माइक्रोस्कोपी आधारित मापन एक और अधिक मजबूत है, लेकिन कम throughput तरीका है कि करने के लिए पूरक है प्रदान कर सकते हैं. hemolysis परख. उदाहरण के लिए, यह आम है डाई लेबल lysosomes (जैसे जीवन टेक्नोलॉजीज द्वारा LysoTracker) के साथ कैरियर की colocalization या इस दवा को खुद का आकलन करने के लिए, या की तस्करी रास्ते पीएच के प्रति संवेदनशील रंगों वाहक संयुग्मित या दवा (pHrodo जैसे द्वारा प्रयोग में लक्षण वर्णन किया जा सकता है टेक्नोलॉजीज जीवन) 24-26.
एक बार एक endosomolytic वितरण प्रणाली साइटोसोलिक कार्गो वितरण को प्राप्त करने के लिए पुष्टि की गई है, hemolysis परख भी व्यवस्था है जिसके माध्यम से endosomal भागने होता पर जानकारी प्रदान कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, जीन वितरण polyethyleneimine पर आधारित वाहनों (पी) एक अंतर्निहित फॉस्फोलिपिड झिल्ली को बाधित करने की क्षमता की कमी हैतटस्थ या अम्लीय पीएच. 11,27 इसके बजाय, पी एक 'प्रोटॉन स्पंज' के प्रभाव के माध्यम से साइटोसोलिक जीन डिलीवरी प्राप्त होता है. Internalization के बाद, पी "अवशोषित" प्रोटॉन कि endosomal झिल्ली भर पंप हैं इन डिब्बों acidify द्वारा endosome buffers. आखिरकार, इस अतिरिक्त अंदर endosome और प्रोटॉन उनके काउंटर आयनों के buildup की ओर जाता है. आसमाटिक दबाव, पानी बाढ़, पुटिका सूजन, और endosomolysis में वृद्धि में यह परिणाम है. इसलिए, प्रोटॉन स्पंज प्रभाव की सफलता एक endosome में पी का एक महत्वपूर्ण एकाग्रता के संचय जरूरी 27 डिलिवरी वाहनों है कि 'प्रोटॉन स्पंज' के प्रभाव के माध्यम से endosomal विघटन हासिल शारीरिक रूप से प्राप्त करने में लाल रक्त कोशिकाओं या liposomes, और उनके प्रभाव को बाधित नहीं होगा. intracellular दवा वितरण आसमाटिक दबाव गणना के माध्यम से मूल्यांकन किया जाना चाहिए, या इन विट्रो माइक्रोस्कोपी, या कार्यात्मक अध्ययन में.
अंत में, hemolysis परख यहाँ वर्णितदवा जीवविज्ञान दवाओं के intracellular प्रसव के लिए बनाया गया एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए एक विश्वसनीय मॉडल है. इस परख दवा वितरण वाहन स्क्रीनिंग के एक उच्च throughput साधन प्रदान करता है, योगों कि लक्ष्य के साथ intracellular biologics देने के तेजी से विकास को सक्षम है.
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Disclosures
आईआरबी अनुमोदन: मानव विषयों को शामिल प्रक्रियाओं Vanderbilt विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी, # प्रोटोकॉल 111,251) द्वारा अनुमोदित किया गया है. ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के रक्षा विभाग के माध्यम से Congressionally निर्देशित चिकित्सा अनुसंधान (# W81XWH 10-1-+०,४४५) कार्यक्रम, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21 HL110056 NIH), और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (11SDG4890030 #) धन को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
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