Summary
Um ensaio de hemólise podem ser usados como um meio rápido, tela de alto rendimento de cytocompatibility sistemas de entrega de drogas e atividade endosomolytic para entrega intracelular de carga. O ensaio mede a ruptura das membranas dos eritrócitos em função do pH do meio ambiente.
Abstract
Bicamadas de fosfolipídios que formam endo-lisossômico vesículas podem representar uma barreira para a entrega de medicamentos biológicos para alvos intracelulares. Para ultrapassar esta barreira, uma série de transportadores de drogas sintéticas têm sido desenvolvidos para a perturbação activa da membrana endossomal e entregar a carga para dentro do citoplasma. Aqui, nós descrevemos o ensaio de hemólise, a qual pode ser usada como uma rápida, tela de alto rendimento para a actividade e cytocompatibility endosomolytic de sistemas de entrega de drogas intracelulares.
No ensaio de hemólise, as células vermelhas do sangue e os materiais de teste são co-incubados em tampões a pHs definidos que imitam extracelulares, cedo endossomais e lisossomais tarde endo-ambientes. Após um passo de centrifugação a pelota intactas as células vermelhas do sangue, a quantidade de hemoglobina libertada para o meio é medida por espectrofotometria (405 nm para melhor a gama dinâmica). A interrupção por cento de glóbulos vermelhos é então quantificada em relação ao controle positivo samples lisadas com detergente. Neste sistema modelo da membrana do eritrócito serve como um substituto para a membrana de camada dupla de lípido que encerram endo-lisossomais vesículas. O resultado desejado é a hemólise insignificante a um pH fisiológico (7,4) e hemólise robusto na gama de pH a partir de endo-lisossomal aproximadamente pH 5-6,8.
Introduction
Embora existam muitos potenciais de alto impacto alvos terapêuticos no interior da célula, a entrega intracelular de agentes representa um desafio significativo. Frequentemente, as drogas, especialmente produtos biológicos, são internalizados pelas células e de tráfico dentro de vesículas que, ou levar a uma degradação do seu conteúdo através da via endo-lisossomal, ou são transportados de volta para fora da célula através de exocitose. 1 No último processo, o pH interno das vesículas é acidificada para cerca de 5-6, que é o pH óptimo para a actividade das enzimas que funcionam neste compartimento, tal como a lisozima 2.
Recentemente, um certo número de materiais foram especificamente concebidos para aproveitar a acidificação dos endossomas para facilitar a entrega citosólica da sua carga. Um exemplo desta abordagem utiliza sintéticos, as nanopartículas de polímeros de micelas cujo núcleo é zwitteriónicos e carga neutra a um pH fisiológico (isto é, 7.4). No entanto, a pH 6,0- 6,5, os polímeros tornam-se protonado e adquirem uma carga positiva, que desestabiliza o núcleo micelar, e os segmentos de polímeros expostos interagir com e romper a membrana endossomal. Esta actividade tem sido mostrado para promover a fuga endossomal de péptidos e ácidos nucleicos baseados em terapêutica, o que lhes permite aceder aos seus alvos citosólicas. 3,4 Outros exemplos de métodos desenvolvidos para mediar fuga endossomal que interromper a barreira da membrana incluem as "" péptidos fusogénicos ou proteínas que podem mediar a fusão da membrana, ou a formação de poros transientes na bicamada fosfolipídica. 5 homopolímeros de ácidos acrílicos aniónicos de alquilo, tais como poli (ácido propylacrylic) são outra abordagem bem estudada e, nestes polímeros, o estado de protonação do ácido carboxílico pendente dita transição em um hidrofóbico, estado da membrana disruptiva em gamas de endo-lisossomais pH 6,7.
Um sistema modelo útil para a triagem comportamento endosomolytic é o e-x dependente do pH in vivo ensaio de hemólise. 8 Neste sistema modelo, a membrana do eritrócito serve como um substituto para a membrana de camada dupla de lípido que encerram endo-lisossomais vesículas. Este modelo generalizável tem sido utilizado por outros para avaliar o comportamento de células endosomolytic penetrantes péptidos e outros sistemas de entrega de genes poliméricos. 8-11 Nesta experiência, as células vermelhas do sangue e os materiais de teste são co-incubados em tampões a pH definidos que imitam extracelulares (7,4), no início endossomais (6,8), e no final endo-lisossomal (<6,8) ambientes. A quantidade de hemoglobina libertada durante o período de incubação é quantificada como uma medida da lise dos glóbulos vermelhos, que é normalizado para a quantidade de hemoglobina libertada nas amostras de controlo positivo lisadas com detergente.
De rastreio de uma pequena biblioteca de materiais de teste potencialmente endosomolytic, pode-se inferir que as amostras que não produzem hemólise, a pH 7,4, mas bainha significativamente elevadosolysis a pH <6,5, serão os candidatos mais eficazes e cytocompatible para a entrega da droga citosólica. Os materiais que se enquadram nestes critérios seria de esperar que permanecem inertes e não indiscriminadamente destruir bicamadas lipídicas (isto é, que poderia causar a citotoxicidade) até serem expostos a uma queda no pH local na sequência de internalização em endo-lisossomais compartimentos.
Neste protocolo, os eritrócitos são isoladas a partir de um dador humano e co-incubou-se a pH 5,6, 6,2, 6,8, ou 7,4 com experimentais agentes de entrega de droga endosomolytic. Eritrócitos intactos são sedimentadas e os sobrenadantes (que contêm hemoglobina libertada a partir de eritrócitos lisados) são analisadas para a característica de absorção de hemoglobina através de um leitor de placa (Figura 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação e Esterilização de Buffers e agentes de teste
- 150 mM de NaCl: Dissolver 4,383 g de cristais de NaCl em 500 ml de água nanopura.
- Os tampões de pH: Preparar tampão fosfato a pH 5,6, 6,2, 6,8, e 7,4 por mistura de quantidades apropriadas de fosfato monobásico e fosfato de sódio dibásico. Se as amostras são testadas a valores de pH mais baixos (isto é, pH <5,6), em seguida, um tampão mais apropriado, tal como tampão de citrato, deve ser usado. Receitas tampão estão facilmente disponíveis, e um exemplo de referência tenha sido fornecido aqui 12.
- Esterilizar todos os buffers acima indicadas através de um aparelho de filtração garrafa-top vácuo e re-check tampão pH.
- 20% de Triton X-100 (testemunha positiva): Misturar 20 ml puro Triton X-100 em 80 ml de água nanopura. Vortex vigorosamente e sonicar a dissolver-se. Deixar a temperatura ambiente durante a noite antes da utilização.
2. Preparação de eritrócitos
- Obter 25 ml de sangue from um anônimo doador humano, elaborado diretamente em tubos de K 2-EDTA revestidos Vacutainer para impedir a coagulação.
NOTA: Todos os procedimentos devem ser pré-aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional apropriado (IRB), e punção venosa e coleta de sangue deve ser realizada por um flebotomista treinado, a fim de minimizar o risco para o doador. Os procedimentos padrão de flebotomia ter sido publicado anteriormente 13.
- Centrifugar o sangue a 500 xg durante 5 min, e os níveis de hematócrito marca (vermelho, a camada inferior) e de plasma (camada superior amarelada) no tubo.
- Aspirar plasma suavemente através de uma micropipeta, adicionar em água sanitária, e descartar em resíduos com risco biológico.
- Encher o tubo hematócrito a linha marcada (nível original de plasma) com 150 mM de solução de NaCl. Cap e inverter algumas vezes para misturar suavemente. Centrifugar a 500 xg durante 5 min.
- Repita o passo 2,3-2,4 para lavar as células do sangue novamente. Em seguida, aspire supernatformiga e substituir com PBS a pH 7,4. Inverter para misturar.
- Dividir sangue uniformemente em quatro tubos, correspondendo a cada pH que será testado. Rotular os tubos de acordo com cada valor de pH a ser testado (5.6, 6.2, 6.8, 7.4).
- Centrifugar os tubos de sangue a 500 xg durante 5 min. Marcar níveis em tubos, em seguida, aspirar o sobrenadante.
- Encher cada tubo de linha marcada com tampão de pH apropriado (como indicado em 2.6).
- Etiqueta quatro tubos de 50 ml (um por pH de teste), e pipeta de 49 ml de PBS de pH apropriado para cada tubo cónico.
- Adicionar 1 ml de eritrócitos (mesmo pH) para dentro do tubo correspondente para uma diluição de 1:50. Inspecionar visualmente o sangue diluído, que deve ser turva e vai resolver, se deixado em repouso. Se nenhuma forma de pelotas, as células têm lisadas.
3. Lise Ensaio 96 Configuração da Bem e Quantificação
- Preparar soluções de reserva de todos os agentes de entrega de droga experimental, a 20x a concentração final desejada para ser testado (Ensaioterá 10 ul de agente de entrega de droga + 190 ul diluídas células vermelhas do sangue, conduzindo a uma diluição de 1/20 do original de agente de libertação de fármacos para a mistura de ensaio final). Os estoques de 20, 100, e 800 ug / ml são sugeridas, resultando em concentrações de ensaio finais de 1, 5, e 40 ug / ml, respectivamente.
- Pipetar 10 ul de cada solução de estoque em Fundo em V de 96 poços. Para melhores resultados, coloque cada amostra em triplicado ou quadruplicado.
NOTA: Para facilidade, recomenda-se que uma placa de 96 poços separada deve ser preparada para cada pH a ser testado, com cada uma das amostras (a cada concentração) carregado com n = 3-4 por prato.
- Para poços de controlo positivo, adicionar 10 ul de Triton X-20% 100.
- Para poços de controlo negativo, adicionam-se 10 ul de tampão de fosfato. Utilize uma solução tampão ao mesmo pH a ser testado.
- Pipete 190 pi de eritrócitos diluídas (ver 2.10) a cada poço, tornando solução stock certeza célula permanecehomogénea durante a transferência. Dica: Use uma pipeta multi-canal para simplificar essa tarefa.
- Incubar as placas a 37 ° C durante uma hora (Opcional: Utilizar um agitador orbital ou oscilante).
- Centrifugar as placas durante 5 minutos a 500 xg para eritrócitos intactos pelota. Nota: durante a remoção da placa da centrífuga e transportá-lo para o passo seguinte, manusear com cuidado e ter a certeza de não perturbar o sedimento celular.
- Utilizando uma pipeta multicanal, transferir 100 ul do sobrenadante de cada poço para uma clara, de fundo chato de placas de 96 poços. Observação: se o sedimento de células foi acidentalmente perturbado por qualquer amostra (s), pode-se re-centrifugar a placa e, em seguida, proceder à transferência de sobrenadante.
- Medir a absorvância do sobrenadante com um leitor de placas. Note-se que uma gama de comprimentos de onda podem ser utilizados (400 - 541 nm).
NOTA: leitores de placas diferentes podem ter pontos de saturação e sensibilidades diferentes, para a escolha de um comprimento de onda para measurements depende ou não de dados de hemólise de amostras experimentais podem ser confiavelmente normalizado contra hemólise máximo induzido por tratamento com detergente. Isto requer uma medição precisa dos valores de absorvância das amostras de controlo positivo.
- Usando o Microsoft Excel ou um software de análise de dados semelhante, encontre a média das leituras de absorvência de fundo a partir das amostras de controlo negativo criados para cada pH (passo 3.4). Subtrair o valor de absorvância de fundo a partir de todas as outras amostras que foram medidas naquele pH.
- Após subtracção do fundo, encontrar a absorvência média do controlo positivo detergente tratados com amostras (passo 3.3.) Então normalizar todos os pontos de dados experimentais, para este valor de absorvância média, a qual deve representar 100% de hemólise. Finalmente, multiplicar cada valor bem por 100% para calcular% de hemólise, que ocorreu em cada poço individual em relação ao controlo de detergente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tipicamente, os agentes que exibem um comportamento dependente do pH ideal hemolítica têm o maior potencial para a entrega de drogas citosólica, ácidos nucleicos ou outras moléculas bioactivas. Isto é exemplificado pelo agente # 1, como mostrado na Figura 2, o qual exibe a hemólise mínima a um pH de 7,4, mas um aumento significativo no comportamento hemolítica em gamas de pH endossomais (<6,5). Alguns agentes podem exibir níveis significativos de comportamento hemolítica em gamas de pH fisiológico (agente # 2 a 40 ug / mL), Figura 2, o que sugere que estes agentes não possam ser hemocompatibilidade e poderia ser potencialmente citotóxicos a estas concentrações.
Na maioria dos casos, a hemólise é também dependente da dose, as concentrações cada vez maiores de materiais de teste correspondem com os níveis mais elevados de hemólise, especialmente nos intervalos de pH mais baixos testados (5,6-6,2).
"Alt =" Figura 1 "fo: conteúdo largura =" 4in "fo: src =" files/ftp_upload/50166/50166fig1highres.jpg / "/>
Figura 1. Diagrama esquemático de Red ensaio de hemólise de Células Sanguíneas. Eritrócitos humanos foram isolados e incubados com drogas experimentais agentes endosomolytic entrega em uma série de tampões, simulando a gama de pH fisiológicos de (7,4) para o final endossomas / lisossomas (5.6). Os agentes de entrega de drogas ideais não prejudicar as hemácias em pH fisiológico, mas irá apresentar hemólise robusta em condições mais ácidas. Para avaliar a percentagem de hemólise, a libertação de hemoglobina para o meio circundante através de absorvância é medida num leitor de placas.
Figura 2. Resultados representativos de um ensaio de hemólise Demonstrando comportamento de dois Endos experimentaisAgentes omolytic. Primeiro, a 450 A média do veículo (PBS) foi subtraída das outras amostras testadas a que pH. Depois disso, as amostras experimentais foram normalizados para a 450 A de Triton X-100 tratadas com amostras de eritrócitos e multiplicado por 100%. Com base nestas amostras de controlo, a capacidade dos agentes de transfecção experimentais para lisar os eritrócitos pode ser calculada. Tipicamente, os agentes ideais endosomolytic exibem dependente da dose e dependente do pH comportamento hemolítica. Agentes ideais (tais como agente # 1) exibem hemólise mínima a um pH de 7,4, mas um aumento significativo no comportamento hemolítica em gamas de pH endossomais (<6,5). Alguns agentes apresentam comportamento hemolítica substancial em gamas de pH fisiológico (Agent # 2 a 40 ug / ml), sugerindo que estes agentes podem ser citotóxicos a estas concentrações. As barras de erro indicam o desvio padrão de 4 medições independentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
pH-responsivos polímeros ou outros agentes destinados a função endosomolytic pode ser rápida e eficazmente rastreados com base na lise de células vermelhas do sangue em valores de pH encontrados no endossoma (Figura 1, pH 6,8 - endossomo precoce, a pH 6,2 - endossoma tardio, pH 5,6 - lisossoma). 14-17 hemólise dependente do pH foi usado para analisar a capacidade de mediar a libertação transportadoras endossomal da terapêutica biomacromolecular péptidos (por exemplo, siRNA, ODNs, proteínas), e os resultados deste ensaio podem ser preditivos de desempenho como intracelular veículo de entrega da droga. 3,4,8,18,19 Assim, este ensaio representa um ecrã eficaz para medir a capacidade dos transportadores de droga poliméricos para mediar a entrega da droga intracelular com base na sua ruptura da membrana dependente do pH.
Como foi observado no procedimento, a hemólise é detectado através de medições espectrofotométricas de sobrenadantes de células vermelhas do sangue tratado com experimentalagentes. Portanto, além de hemoglobina, que é susceptível de conter outros componentes derivados de eritrócitos citosólicos, incluindo proteínas e hidratos de carbono. Embora estes outros componentes podem contribuir com uma pequena quantidade de sinal para a medição espectrofotométrica, 100% de hemólise foi calibrado para o lisado de eritrócitos resultante do tratamento com Triton X-100. Supondo que todos os eritrócitos do mesmo doador contêm níveis similares de hemoglobina e outras biomoléculas, pode-se concluir com segurança que a "contaminação" componentes não contribuirá quaisquer artefactos para a medição de hemólise, especialmente se a mesma amostra de sangue é utilizado para todos os testes. No entanto, o que reforça a possibilidade de que, para qualquer dador de sangue dada, não são susceptíveis de ser pequenas do dia-a-dia de variações na composição do sangue e no hematócrito, e, portanto, as amostras de controlo interno (passos 3,3-3,4, 3,10-3,11) devem ser analisadas para todos os experimentos.
Deve-se também sempre examinar de perto o abs-primaorbance dados. Embora ela não pode ser apreciado nos dados normalizados exemplo mostrado na Figura 2, os detergentes tais como Triton X-100 de forma eficaz desestabilizar as membranas de eritrócitos, independentemente do pH, e deve-se esperar ver amostra muito pequena de amostra variabilidade nos controlos positivos. O espectro de absorvância de Triton X-100 não inclui picos no intervalo de 400-600 nm recomendados para este ensaio e, portanto, não deve interferir com a normalização dos dados experimentais. 20 Por outro lado, para as amostras de controlo negativo, que não se deve observar significativa hemólise após a incubação de 1 hora, em qualquer um dos tampões utilizados (isto é, mesmo tampão o mais ácido tipicamente não gerar hemólise neste período de tempo). Leituras de fundo em amostras de controlo negativo deve intimamente leituras de absorbância aproximados fundo tomada sobre os buffers frescos.
Idealmente, os pesquisadores vão empregar estratégias complementares para caracterizar a sua expesistemas de entrega de drogas rimental. O ensaio de hemólise é vantajoso para a triagem inicial de agente endosomolytic em que ocorrem naturalmente biomembranas, mas devem ser considerados como apenas uma das muitas ferramentas no arsenal do pesquisador entrega da droga para testar agentes de entrega citosólicas. Por exemplo, uma desvantagem potencial de o ensaio de hemólise é que ele utiliza a membrana dos glóbulos vermelhos como modelo biológico para membranas endossomais. No entanto, o conteúdo da composição e de lípidos de membranas endossomais varia de acordo com tipo de célula e não pode ser exactamente recapitulados pela membrana de células sanguíneas. 1 Uma variedade de outros ensaios complementares foram desenvolvidas para imitar composição da membrana endossomal e comportamento. 21, 22 Uma alternativa é a utilização de lipossomas que contêm a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET)-temperados fluoróforos, que se tornam inextinguível desestabilização na sequência dos lipossomas e libertação dos fluoróforos aos meios circundantes. Em estudos ªa empregar este método, a quantificação dos fluoróforos unquenched tenha sido correlacionadas com a capacidade de um veículo para mediar fuga endossomal da sua carga útil. 21,23 Microscopia baseados em medições podem fornecer um método mais robusto, mas de menor rendimento, que é complementar à o ensaio de hemólise. Por exemplo, é comum para avaliar colocalização do transportador ou a droga em si, com corante (por exemplo, marcados lisossomas Lyso Tracker por Life Technologies), as vias de transporte do ou pode ser caracterizada utilizando os corantes sensíveis ao pH conjugado do transportador ou de drogas (por exemplo, por pHrodo Life Technologies). 24-26
Uma vez que um sistema de entrega de endosomolytic foi confirmado para conseguir a entrega de cargas citosólico, o ensaio de hemólise também pode fornecer informação sobre o mecanismo pelo qual ocorre fuga endossomal. Por exemplo, os veículos de distribuição de genes com base em polietilenoimina (PEI) carecem de uma capacidade inerente para romper as membranas fosfolipídicasa pH neutro ou ácido do. 11,27 Em vez disso, a entrega do gene PEI alcança citosólica através um efeito de "esponja de protões". Após internalização, PEI buffers o endossoma por "absorventes" protões que são bombeados através da membrana endossomal para acidificar estes compartimentos. Eventualmente, isto conduz a um aumento de protões em excesso e os seus contra-iões no interior do endossoma. Isso resulta em um aumento na pressão osmótica, fluxo de água, inchaço, vesículas e endosomolysis. Por conseguinte, o sucesso do protão efeito esponja exige a acumulação de uma concentração crítica de PEI para um endossoma. 27 veículos de entrega que atingem ruptura endossomal através do efeito "esponja de protões" não vai perturbar fisicamente as células vermelhas do sangue ou lipossomas, e sua eficácia na consecução entrega da droga intracelular deve ser avaliada através de cálculos de pressão osmótica, ou in vitro, microscopia ou estudos funcionais.
Em conclusão, o ensaio de hemólise descrito aquié um modelo fiável para o rastreio de agentes farmacêuticos concebidos para administração intracelular de medicamentos biológicos. Este ensaio proporciona um meio de elevada capacidade de rastreio de drogas veículo de entrega, permitindo o rápido desenvolvimento de formulações que proporcionam produtos biológicos com alvos intracelulares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aprovação IRB: Procedimentos que envolvem seres humanos tenham sido aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Vanderbilt (IRB; Protocolo # 111251). Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o financiamento através do Departamento de Defesa pelo Congresso dirigiu programas de Investigação Médica (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) e American Heart Association (# 11SDG4890030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th, Garland Science. (2002).
- Boasson, E. H.
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
- Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
- Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
- Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
- Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
- Behr, J. -P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
- Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. Data for Biochemical Research. , 3rd, Oxford University Press. (1986).
- Ernst, D. J. Applied Phlebotomy. , 1st, Lippincott Williams & Wilkins. (2005).
- Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
- Lackey, C. A., et al.
- Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
- Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
- Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
- Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
- Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
- Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
- Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
- Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
- Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
- Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).
