Summary
溶血アッセイは、細胞内の貨物の配達のための薬物送達システム "cytocompatibilityとエンドソーム溶解活性の急速な、高スループットの画面として使用することができます。アッセイは、環境pHの関数としての赤血球膜の破壊を測定します。
Abstract
エンド-リソソーム小胞を構成するリン脂質二重層は細胞内標的に対する生物学的薬剤の送達に障壁をもたらすことができます。この障壁を克服するために、合成麻薬キャリアの数を積極的にエンドソーム膜を破壊し、細胞質内に貨物を提供するように設計されています。ここでは、細胞内薬物送達システムのcytocompatibilityとエンドソーム溶解活性のために迅速、ハイスループットスクリーニングとして使用することができ溶血アッセイを、説明します。
溶血アッセイ、ヒト赤血球および試験材料では、細胞外の早期エンドソーム、後期のendo-リソソーム環境を模倣する定義されたpHの緩衝液中で同時インキュベートされています。ペレット無傷赤血球に遠心分離工程に続いて、培地中に放出されたヘモグロビンの量を分光光度法（最高のダイナミックレンジの405 nm）で測定されます。パーセント赤血球の破壊は、その後陽性対照SAMPに対する相対定量化されLESは、洗剤を用いて溶解。このモデル系では赤血球膜には、エンド - リソソーム小胞を囲む脂質二重膜の代用として機能します。所望の結果は、生理学的pH（7.4）とpH約5から6.8からのendo-リソソームのpH範囲で堅牢な溶血で無視できる溶血です。
Introduction
細胞内の多くの潜在的な影響力の大きい治療標的がありますが、薬剤の細胞内送達は、重要な課題となっています。頻繁に、薬剤、特に生物学的製剤は、エキソサイトーシスを介して細胞によって内在化および小胞に人身売買どちらのendo-リソソーム経路を介して、それらの内容の劣化につながること、またはセルの裏に運ばれますされています。後者の過程で1、内部のpHが小胞の酵素の活性の至適pHである、約5から6に酸性化されているリゾチームなど、この区画内の関数は、図2
最近では、材料の数は、特にの酸性化は、その貨物の細胞質送達を容易にするエンドソームを活用するように操作されている。このアプローチの一つの例では、コア生理学的pH（ すなわち 7.4）で両性イオンと電荷的に中性である合成、高分子ミセルのナノ粒子を使用しています。しかし、pH6.0で- 6.5、ポリマーがプロトン化になるとミセルのコアを不安定正味の正電荷を取得し、露出したポリマーセグメントと相互作用し、エンドソーム膜を破壊する。この活動は、彼らの細胞質ゾルのターゲットにアクセスできるように、ペプチドおよび核酸ベースの治療薬のエンドソーム脱出を促進することが示されている。膜障壁を崩壊エンドソーム脱出を媒介するために開発された方法の3,4他の例は、または'融合'ペプチドが含まれるリン脂質二重層の膜融合や過渡孔形成を媒介することができるタンパク質は、例えば、ポリ（プロピルアクリル酸）のようなアニオン性アルキルアクリル酸の5ホモは別のよく研究されたアプローチであり、これらのポリマーに、ペンダントカルボン酸のプロトン化状態が遷移を指示エンド-リソソームのpH範囲において、疎水性膜の中断状態になります。6,7
エンドソーム溶解挙動をスクリーニングするための一つの有用なモデル系はeですX生体内pH依存性溶血アッセイ。このモデルシステムでは8、赤血球膜は、エンド-リソソーム小胞を囲む脂質二重膜の代用として機能します。この一般化モデルは細胞透過性ペプチドおよび他の高分子遺伝子送達システムのエンドソーム溶解挙動を評価するために他の人によって使用されています8月11日今回の実験では、ヒト赤血球および試験材料は模倣する定義されたpHで緩衝液中で同時インキュベートアール、（7.4）は、細胞外（6.8）初期エンドソーム、およびエンドリソソーム後期（<6.8）環境に対応しています。潜伏期間中に放出されたヘモグロビンの量は、洗剤を用いて溶解し、陽性対照試料で放出されたヘモグロビンの量に正規化されている赤血球の溶解、の尺度として定量化される。
潜在的にエンドソーム溶解試験材料の小さなライブラリーをスクリーニングすることから、1つは、pH7.4で全く溶血を生じないが、有意に上昇し、その裾のサンプルを推測することができますpHでolysis <6.5は、細胞質ゾルの薬物送達のための最も効果的かつcytocompatible候補となります。これらの基準に適合する材料は、不活性のままで無差別にエンド-リソソーム区画に内在化後の局所pHの低下にさらされるまで、脂質二重膜（細胞毒性を引き起こす可能性がIE）を破壊しないことが予想される。
このプロトコルでは、赤血球はヒトのドナーから単離されており、実験的なエンドソーム溶解薬物送達剤を用いてpHを5.6、6.2、6.8、または7.4で共存培養した。無傷赤血球をペレット化し、上清を（溶解赤血球から放出されたヘモグロビンを含む）プレートリーダー（ 図1）を経由してヘモグロビンの吸光特性を分析する。
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Protocol
1。バッファおよびテストエージェントの調製と滅菌
- 150mMのNaCl緩衝液：ナノ純水500ml中に4.383グラムNaCl結晶を溶かす。
- pH緩衝液：一塩基と二塩基性リン酸ナトリウムの適切な量を混合することにより、pHが5.6、6.2、6.8、および7.4のリン酸緩衝液を準備します。サンプルは低いpH値（ すなわち pHが<5.6）などのクエン酸緩衝液として、より適切な緩衝液、でテストする場合は、使用すべきである。バッファのレシピは、容易に入手可能であり、例えば参照がここで提供されています12
- ボトルトップ吸引ろ過装置と再確認バッファーのpHを介して上記のようにすべてのバッファーを滅菌する。
- 20パーセントのTriton X-100（陽性対照）：ミックス20ミリリットル純粋トリトンX-100ナノ純水80mlインチ激しくボルテックスし、溶解するために超音波処理する。使用前に室温で一晩にしておきます。
2。赤血球の調製
- 血液frの25ミリリットルを得る凝固を防ぐために、K 2-EDTA-コーティングさバキュテイナー管に直接描かれたOMは、匿名の人間のドナー、。
注：すべての手順は、適切な治験審査委員会（IRB）による事前承認を受けなければならず、静脈穿刺および採血がドナーへのリスクを最小限にするために訓練された瀉血専門医が行う必要があります。標準的な瀉血の手続きは、他の場所で公開されている13
- 5分間、チューブ上のヘマトクリット値（赤、下層）と血漿（黄色がかった、上層）のマーク·レベルについては、500×gで血液を遠心分離します。
- マイクロピペッターを介して緩やかにプラズマを吸引除去し、漂白剤に追加して、バイオハザード廃棄物に捨ててください。
- 150mMのNaCl溶液でマークされた行（プラズマの元のレベル）にヘマトクリット管を埋める。キャップ、穏やかに混合するために数回転倒。 5分間、500×gで遠心分離します。
- 再び血液細胞を洗浄するステップ2.3から2.4を繰り返します。その後supernatを吸引アリとpH7.4のPBSで置き換える。混在させる反転。
- テストされる各pHに対応する4つのチューブ内に均等に血を分割します。 （5.6、6.2、6.8、7.4）でテストする各pHに応じてチューブにラベルする。
- 5分間、500×gで採血管を遠心する。チューブ上のレベルにマークを付け、その後、上清を吸引除去する。
- 適切なpH（2.6に示されるように）のバッファでマークされた行に各管を埋める。
- ラベル4 50 mlコニカルチューブ（試験へのpH当たり1）、および各コニカルチューブに適切なpHのPBSのピペット49ミリリットル。
- 1:50希釈のための対応するチューブに赤血球の1ミリリットル（同じpH）を追加します。視覚的に混濁されるべきであり、邪魔されずに放置しておくと落ち着きます希釈血液を検査。ペレットの形していない場合は、細胞を溶解した。
3。溶解アッセイ96ウェルプレートのセットアップと定量
- テストする20X所望の最終濃度で、すべての実験薬物送達剤のストック溶液を準備します（アッセイ薬物送達剤+ 190μlの希釈赤血球、最終テスト混合物の中に、元の薬物送達剤の1/20希釈につながる）の10μlがかかります。 20、100、800μg/ mlの株式がそれぞれ1,5、および40μg/ mlのの最終試験濃度で、その結果、提案されている。
- V底96ウェルプレートに各ストック溶液の10μlのピペット。最適な結果を得るために、三重または四重に各サンプルをロードします。
注：簡単にするために、それは独立した96ウェルプレートは、n = 3-4あたりのプレートにロードされた各サンプル（各濃度における）で、テストする各pHのために準備することをお勧めします。
- 正の対照ウェルは、10μlの20％Triton X-100を追加します。
- 陰性対照ウェルは、リン酸緩衝液10μlを加える。テストする同じpHでバッファを使用します。
- 希釈された赤血球のピペットで190μL（2.10参照）を各ウェルに、残っていることを確認細胞原液を作る転送中に均質。ヒント：このタスクを簡素化するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。
- 1時間（：オービタルシェーカーやロッカーを使用して、オプション）を37℃でプレートをインキュベートする。
- 500はペレット無傷赤血球にxgで5分間プレートを遠心します。注：遠心分離機からプレートを外して、次のステップにそれを輸送する際、取り扱いに注意し、細胞ペレットを妨害しないように注意する。
- マルチチャンネルピペットを使用し、クリア、平底96ウェルプレートに各ウェルから100μlの上清を移す。注：細胞ペレットを誤って任意のサンプル（s）の妨害された場合は、1つは、再遠心することができますプレート後、上澄みの転送を続行します。
- プレートリーダーを用いて上清の吸光度を測定します。波長の範囲は（ - 541 nmの400）を使用することができることに注意してください。
注：異なるプレートリーダーが異なる飽和点と感度を持っている可能性がありますので、私のために波長の選択asurementsは、界面活性剤処理により誘導されるような実験サンプルから溶血データが確実に最大溶血に対して正規化することができるかどうかによって異なります。これは、ポジティブコントロールサンプルの吸光度の値を正確に測定する必要があります。
- Microsoft Excelまたは類似のデータ解析ソフトウェアを使用して、各pH（ステップ3.4）用に設定され陰性対照試料からのバックグラウンド吸光度の測定値の平均を求める。そのpHで測定した他のすべての試料から、このバックグラウンドの吸光度の値を減算します。
- バックグラウンドを差し引いた後、陽性コントロールの平均吸光度洗剤で処理したサンプル（ステップ3.3）を見つける。次いで100％溶血を表すべきであるこの平均吸光度値にすべての実験データ点を正規化します。最後に、洗剤コントロールに対する相対的なだけでなく、個々に発生した％溶血を計算するために100％で各ウェルの値を乗算します。
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Representative Results
典型的には、理想的なpH依存性溶血性挙動を示す薬剤は、薬物、核酸、または他の生物活性分子の細胞質送達のための最高の可能性を秘めている。これは、pH7.4で最小限の溶血を示し、 図2に描かエージェントとして第1に代表されるが、エンドソームのpH範囲（<6.5）における溶血性行動が急激に増加しています。これらの薬剤は血液適合性ではない可能性があり、潜在的にこれらの濃度で細胞毒性の可能性がありますことを示唆して、いくつかの薬剤は、生理的pH範囲（ 図2の 40μg/ mlのエージェント＃2）で溶血性行動の有意なレベルを示すことができる。
試験物質の濃度を増加させ、特に（ - 6.2 5.6）テスト低いpH範囲で、溶血のより高いレベルに対応するように、ほとんどの場合、溶血は、また、用量依存的である。
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図1。赤血球溶血アッセイの模式図。ヒト赤血球を単離し、生理学的（7.4）後期エンドソームする/リソソーム（5.6）から、pHの範囲をシミュレートする一連のバッファにおける実験エンドソーム溶解薬物送達剤と共にインキュベートする。最適な薬物送達剤は、生理的pHで赤血球を中断されることはありませんが、より多くの酸性条件下で堅牢な溶血を示すであろう。 ％の溶血性を評価するために、周囲の媒体へのヘモグロビンの放出は、プレートリーダーで吸光度を介して測定される。
図2。溶血アッセイの代表的な結果は、2つの実験Endosの動作を実証omolyticエージェントはまず、平均的には、車両の450（PBS）の制御はそのpHで試験された他のサンプルから差し引いた。その後、実験的なサンプルはTriton X-100で処理した赤血球の試料450に正規化し、100％を乗じた。これらの制御のサンプルに基づいて、赤血球を溶解するための実験的なトランスフェクション剤の能力を計算することができます。典型的には、理想的なエンドソーム溶解剤は、用量依存性、pH依存性溶血性挙動を示す。理想的な薬剤（例えば、エージェント＃1など）、pH7.4で最小限の溶血が、エンドソームのpH範囲（<6.5）における溶血性行動の急激な増加を示す。エージェントによっては、これらの薬剤はこれらの濃度で細胞毒性であることを示唆し、生理的pHの範囲（40μg/ mlのエージェント＃2）で実質的溶血性挙動を示す。エラーバーは4つの独立した測定値の標準偏差を示す。
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Discussion
-初期エンドソームのpH 6.2 -後期エンドソームのpH 5.6 - pHは6.8、エンドソーム溶解機能のために設計されたpH応答性ポリマーまたは他の薬剤を迅速かつ効果的にエンドソーム（ 図1に遭遇したpH値で赤血球の溶解に基づいてスクリーニングすることができるリソソーム）14から17、pH依存性溶血は、生体高分子の治療法（ 例えば、ペプチドは、siRNA、ODNは、タンパク質）のエンドソーム放出を仲介する事業者の能力をスクリーニングするために使用されており、このアッセイの結果は、細胞内のように性能を予測することができます薬物送達ビヒクル。3,4,8,18,19はこのように、このアッセイは、それらのpH依存性膜破壊に基づく細胞内薬物送達を媒介する高分子薬物担体の能力を測るための効果的な画面を表します。
手順で説明したように、溶血は実験で処理赤血球の上清の吸光光度測定により検出されたエージェント。したがって、ヘモグロビンに加えて、それは、タンパク質と炭水化物を含む他の赤血球由来の細胞質成分を含有する可能性があります。これらの他のコンポーネントは分光光度測定信号に少量の貢献かもしれませんが、100％の溶血はトリトンX-100を用いた治療に伴う赤血球ライセートに較正した。同じドナーからすべての赤血球はヘモグロビンやその他の生体分子の同じようなレベルを含んでいると仮定すると、我々は無事に '汚染'コンポーネントが同じ血液試料はすべてのテストで使用されている場合は特に、溶血の測定にどんなアーティファクトが寄与しないと結論付けることができます。しかし、これは、任意の献血者のために、血液組成及びヘマトクリット値の小さな日々変動する可能性がある可能性を強調するため、内部統制サンプル（ステップ3.3から3.4、3.10から3.11）がなければなりませんすべての実験を分析した。
一つは、常に密接に生腹筋を調べる必要がありますorbanceデータ。けれどもそれは、界面活性剤は、Triton X-100を効果的にかかわらず、pHの赤血球膜を不安定化し、一つはポジティブコントロールの変動をサンプリングするための非常に小さなサンプルを見て期待してくださいように、 図2に示すように正規化されたデータ例で理解することはできません。トリトンX-100の吸収スペクトルは、このアッセイのために推奨される400から600 nmの範囲内のピークを含んでいないため、実験データの正規化を妨げるべきではない20はまた、陰性対照試料のため、一つはかなりのを観察するべきではありません（ すなわち 、最も酸性緩衝液は、通常、この時間枠で溶血を生成しません）に使用されるバッファのいずれかで1時間のインキュベーション後に溶血。陰性対照試料上の背景の読みは非常に近いバックグラウンドの吸光度の測定値は、新鮮なバッファーで撮影する必要があります。
理想的には、研究者はEXPEを特徴づけるために補完的な戦略を採用するrimental薬物送達システム。溶血アッセイは、天然に存在する生体膜上の初期エンドソーム溶解剤のスクリーニングのために有利であるが、細胞質配送エージェントをテストするための薬物送達の研究者の装備一式で多くのツールの一つとしてのみ考慮されるべきである。例えば、溶血アッセイの1つの潜在的な欠点は、エンドソーム膜のための生物学的モデルとして、赤血球膜を利用できることです。他の様々なしかし、メイクアップとエンドソーム膜の脂質含量、細胞型によって異なり、正確に血球膜によって要約されないことがあります。1、相補アッセイはエンドソーム膜の組成と行動を模倣するために開発されている21、 〜22別な方法としては、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）焼入れ周囲のメディアへのフルオロフォアのリポソームおよびリリースの後に消されていない不安定になる蛍光色素分子を含むリポソームを利用することである。研究番目でで、消されていない蛍光物質の定量は、そのペイロードのエンドソーム脱出を仲介する車両の能力と相関することが見出されているこの方法を採用しています。21,23顕微鏡ベースの測定は相補的であるが、より堅牢な低スループット方法を提供することができる溶血アッセイ。例えば、それは、色素標識リソソーム（ 例えば Life Technologies社によってLysoTracker）とキャリアの局在や薬物自体を評価することが一般的であるか、輸送経路（ 例えば pHrodoによるpH感受性色素キャリアコンジュゲートまたは薬物を使用して特徴づけることができるLife Technologies）を24〜26
エンドソーム溶解送達システムは細胞質ゾルの貨物配送を達成することが確認された後、溶血アッセイはまた、エンドソーム脱出が発生するメカニズムについての情報を提供することができます。例えば、ポリエチレンイミン（PEI）に基づいて、遺伝子送達ビヒクルは、リン脂質膜を破壊するための固有の能力を欠いている中性または酸性のpH。11,27代わりに、PEIは、 "プロトンスポンジ"効果により細胞質遺伝子送達を達成しています。内在化した後に、PEIは、これらの区画を酸性にするエンドソーム膜を横切ってポンピングされる "吸収"プロトンによってエンドソームをバッファリングします。結局、これはエンドソーム内の過剰な陽子とその対イオンの蓄積につながる。浸透圧、水の流入、小胞の腫れ、及びendosomolysisの上昇をもたらします。したがって、プロトンスポンジ効果の成功はエンドソームにPEIの臨界濃度の蓄積が必要となる。 "プロトンスポンジ"効果によりエンドソーム混乱を達成27配送車両が物理的に達成するために赤血球またはリポソーム、及びそれらの効力を中断されることはありません細胞内薬物送達は、浸透圧の計算を介して、またはin vitroでの顕微鏡検査、または機能の研究で評価されなければならない。
結論として、溶血アッセイは、ここで説明生物学的薬物の細胞内送達用に設計された薬剤をスクリーニングするための信頼性の高いモデルです。このアッセイは、細胞内標的と生物学的製剤を提供する製剤を迅速に開発できるようになり、薬物送達車両のスクリーニングのハイスループットな手段を提供します。
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Disclosures
IRBの承認：ヒトを対象とする手順は、バンダービルト大学治験審査委員会（;プロトコル＃111251 IRB）により承認されている。特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、国防総省を通じて議会監督医学研究プログラム（＃W81XWH-10-1から0445）、国立衛生研究所（NIH R21をHL110056）、および米国心臓協会（＃11SDG4890030）を資金認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
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