अलग और immunostaining लिम्फोसाइटों और murine Peyer पैच से वृक्ष के समान कोशिकाओं
Summary
Peyer पैच में कोशिकाओं के विशिष्ट subpopulations (पी पी एस), आंत से जुड़े lymphoid ऊतकों के प्राथमिक आगमनात्मक साइटों के प्रतिरक्षाविज्ञानी कार्यों को समझने में एक बढ़ती रुचि है. यहाँ हम पीपी प्रवाह cytometric विश्लेषण और immunostaining के लिए पीपी cryosections के लिए एकल कक्ष की तैयारी की तैयारी के लिए समानांतर प्रोटोकॉल रूपरेखा.
Abstract
Peyer पैच (पी पी एस) आंत से जुड़े lymphoid ऊतकों के अभिन्न घटकों (Galt) और आंत्र immunosurveillance और homeostasis में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं. आंतों लुमेन में पार्टिकुलेट प्रतिजनों और रोगाणुओं कूप से जुड़े उपकला (FAE) में लगातार पीपी एम कोशिकाओं द्वारा जांचा और वृक्ष के समान कोशिकाओं के एक अंतर्निहित नेटवर्क (DCs), मैक्रोफेज, और लिम्फोसाइटों पहुँचाया. इस अनुच्छेद में, हम प्रोटोकॉल जिसमें murine पी पी एस (i) एकल कक्ष निलंबन dissociated में और प्रवाह cytometry के अधीन है और (ii) cryosectioning और immunostaining के लिए तैयार का वर्णन. प्रवाह cytometry के लिए, पी पी एस यंत्रवत् dissociated और फिर 70 सुक्ष्ममापी झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करने के लिए एक सेल उपकला कोशिकाओं और बड़े मलबे के निलंबन मुक्त उत्पन्न कर रहे हैं. 20-25 पी पी एस (चार चूहों से) के साथ शुरू, इस त्वरित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि पैदावार 2.5> आबादी x 10> 90% सेल व्यवहार्यता के साथ 6 कोशिकाओं. Cryosectioning ताजा,ly पृथक पी पी एस इष्टतम काटना तापमान मध्यम (अक्टूबर), तस्वीर तरल नाइट्रोजन में जमे हुए है, और फिर sectioned एक cryomicrotome का उपयोग में डूब रहे हैं. ऊतक वर्गों (5-12 सुक्ष्ममापी) हवा सूखे, एसीटोन या मेथनॉल के साथ तय हो गई है, और तो immunolabeling के अधीन करने के लिए.
Introduction
Peyer पैच (पी पी एस) संगठित lymphoid मनुष्यों और चूहों (1 चित्रा) की छोटी आंत भर में मौजूद के रोम के macroscopic समुच्चय हैं और प्राथमिक जो साइटों पर mucosal प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आहार एंटीजन, खानेवाला बैक्टीरिया, माइक्रोबियल रोगज़नक़ों, और मौखिक टीके के खिलाफ शुरू कर रहे हैं गठन 1-4. Mesenteric लिम्फ नोड्स के रूप में अन्य परिधीय lymphoid ऊतकों के विपरीत, पी पी एस अभिवाही lymphatics की कमी है. जैसे, पी पी एस में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आंतों लुमेन से प्राप्त प्रतिजनों के जवाब में संचालित कर रहे हैं. luminal प्रतिजनों के नमूने कूप से जुड़े (FAE) उपकला, जो दोनों enterocytes और प्रतिजन कोशिकाओं के नमूने एम कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है के होते हैं के द्वारा पूरा किया है. FAE नीचे, उप उपकला (SED) गुंबद क्षेत्र में वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, और सीडी 4 + टी कोशिकाओं 5-9 के साथ intermingled एक नेटवर्क निहित है. प्रत्येक पीपी lymphoid follicl के मूल मेंई कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं (FDCs) और एक बी सेल युक्त केंद्रीय कृमिसंबंधी केंद्र, टी सेल अमीर interfollicular क्षेत्र द्वारा flanked हैं. IgA + बी कोशिका plasmablasts और CD4 + effector और स्मृति कोशिकाओं के विकास में पी पी एस परिणाम द्वारा Antigen नमूना है कि बीज आसपास के लामिना propria और एक विस्तृत श्रृंखला के mucosal आक्रमणकारियों को उन्मुक्ति प्रदान.
जटिल immunologic प्रतिजन नमूने, प्रसंस्करण, पी पी एस में और प्रस्तुति के साथ जुड़े घटनाओं विदारक एक चुनौतीपूर्ण काम है, विचार है कि पीपी कोशिकाओं आंत्र mucosa में कुल lymphoid कोशिकाओं के केवल एक छोटे से अंश का गठन. कोशिकाओं के इस माहौल में इन विट्रो में लक्षण वर्णन में सहायता हम प्रवाह cytometric और कार्यात्मक विश्लेषण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पीपी immunofluorescence माइक्रोस्कोपी और immunohistology के लिए cryosections की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए कुल माउस पीपी कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. , समझौता ज्ञापनों का अलगाव, लक्षण और immunostaining के लिए हमारा प्रोटोकॉलई पीपी कोशिकाओं से प्रति उपन्यास नहीं है, के रूप में तथ्य यह है कि वहाँ कई वापस डेटिंग 25 से अधिक वर्षों उल्लेख है कि इन तकनीकों का हवाला देते हैं 5,6,9-11 द्वारा evidenced. बल्कि, हमारी प्रोटोकॉल (और दृश्य) पहली बार के लिए पी पी एस एकत्रित जांचकर्ताओं के लिए एक सुव्यवस्थित विधि प्रदान करता है. हम तकनीक का वर्णन आसानी से महारत हासिल कर रहे हैं और आसानी से> 90% सेल व्यवहार्यता के साथ कोशिकाओं की बड़ी संख्या उपज. प्रोटोकॉल cryosectioning पैदावार अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य धारावाहिक आदर्श immunofluorescence धुंधला हो जाना और confocal इमेजिंग के लिए उपयुक्त वर्गों. इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल दो अन्य हाल जौव लेख पूरक. 1, फुकुदा और उनके सहयोगियों द्वारा ligated ileal पाश assays का उपयोग करने के पीपी एम 12 कोशिकाओं द्वारा रोगजनक बैक्टीरिया के तेज का आकलन बताता है. अन्य, Geem और उनके सहयोगियों द्वारा, अलगाव और DCs और माउस आंत्र mucosa से मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन का वर्णन है, लेकिन स्पष्ट रूप से उनके विश्लेषण से 13 पी पी एस शामिल नहीं.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अनुच्छेद में, हम immunostaining के लिए पीपी प्रवाह cytometric और कार्यात्मक विश्लेषण और cryosections के लिए एकल कक्ष की तैयारी की तैयारी करने के लिए समानांतर प्रोटोकॉल उपलब्ध कराई है. दोनों तरीकों अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सेल विश्लेषण और पैराफिन वर्गों की तैयारी के लिए हेलेन जॉनसन (Wadsworth केंद्र पशु हिस्तोपैथोलोजी कोर) में सहायता के लिए धन्यवाद Renjie सांग (Wadsworth केंद्र फ्लो कोर). हम confocal माइक्रोस्कोपी और छवि संग्रह के साथ सहायता के लिए धन्यवाद डॉ. रिचर्ड ए कोल (Wadsworth केंद्र लाइट माइक्रोस्कोपी कोर). हम एनिमेशन के साथ सहायता के लिए एंडी बेंटले (Wadsworth केंद्र फोटो और चित्रण) स्वीकार करना चाहते हैं.
MDJ लाइफ साइंसेज रिसर्च फाउंडेशन, हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (HHMI) फैलोशिप द्वारा समर्थित है. SA Wadsworth केंद्र स्वास्थ्य अनुसंधान इंक अंदर postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है. इस काम के हिस्से में NIH HD061916 और GM082978 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
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