Isolere og farging Lymfocytter og dendrittiske celler fra Murine Peyer er Patches
Summary
Det er en økende interesse for å forstå de immunologiske funksjoner til spesifikke subpopulasjoner av celler i Peyer er patcher (PPS), den primære induktive områder av gut-tilknyttede lymfevev. Her skisserer vi parallelle protokoller for å forberede PP encellete forberedelsene til flowcytometrisk analyse og PP cryosections for farging.
Abstract
Peyer er patcher (PPS) er integrerte komponenter av gut-tilknyttede lymfevev (GALT) og spille en sentral rolle i intestinal immunosurveillance og homeostase. Partikulære antigener og mikrober i intestinal lumen er kontinuerlig samplet av PP M celler i hårsekken-assosiert epitel (FAE) og transportert til et underliggende nettverk av dendrittiske celler (DCS), makrofager og lymfocytter. I denne artikkelen beskriver vi protokoller hvor murine PPs er (i) dissosiert til enkle cellesuspensjoner og underkastet flowcytometri og (ii) fremstilt for cryosectioning og farging. Ved flowcytometri, PPS er mekanisk dissosiert og deretter filtrert gjennom 70 mikrometer membraner å generere enkle cellesuspensjoner fri av epitelceller og stort rusk. Starter med 20-25 PPs (fra fire mus), gir denne raske og reproduserbar metode en befolkning på> 2,5 x 10 6 celler med> 90% celleviabilitet. For cryosectioning, friskly isolerte PPs er nedsenket i Optimal Cutting Temperatur (OCT) medium, snap-frossen i flytende nitrogen, og deretter delt med en cryomicrotome. Vevssnitt (5-12 mikrometer) er luft-tørket, fast med aceton eller metanol, og deretter underkastet immunolabeling.
Introduction
Peyer er patcher (PPS) er makroskopiske aggregater av organiserte lymfoide follikler stede gjennom hele tynntarmen hos mennesker og mus (figur 1) og utgjør den primære områder hvor mucosal immunreaksjoner er initiert mot kosttilskudd antigener, commensal bakterier, mikrobielle patogener, og muntlig vaksiner 1-4. I motsetning til andre perifere lymfoide vev som mesenteric lymfeknuter, PPs mangler afferente lymfekar. Som sådan, adaptive immunresponser i PPS drives i respons til antigener avledet fra intestinal lumen. Prøvetaking av luminal antigener oppnås den ved follicle-assosiert epitel (FAE), som består av både enterocytter og antigen-sampling celler kjent som M celler. Under FAE, i sub-epiteliale kuppel (SED) region, ligger et nettverk av dendrittiske celler (DCS) blandet med makrofager, B-celler, og CD4 + T celler 5-9. I kjernen av hver PP lymfoid follicle er follikulære dendrittiske celler (FDCs) og en B-celle-rik sentrale germinal sentrum, flankert av T celle-rik interfollicular soner. Antigen prøvetaking av PP resultater i utviklingen av IgA + B-celle plasmablasts og CD4 + effektor og minne celler som frø rundt lamina propria og gi immunitet til et bredt spekter til mucosal inntrengere.
Dissekere de komplekse immunologiske hendelser assosiert med antigen prøvetaking, behandling og presentasjon i PPs er en vanskelig oppgave, med tanke på at PP-celler utgjør bare en liten brøkdel av de totale lymfoide celler i tarmslimhinnen. For å hjelpe i in vitro karakterisering av celler i dette miljøet, gir vi en protokoll for fremstilling totale mus PP celler for flowcytometrisk og funksjonell analyse, så vel som en protokoll for fremstilling PP cryosections for immunfluorescens mikroskopi og immunohistology. Vår protokoll for isolering, karakterisering og farging av mouse PP-celler er ikke romanen per se, noe som gjenspeiles av det faktum at det er mange referanser dateres tilbake mer enn 25 år som siterer disse teknikkene 5,6,9-11. Snarere gir vår protokoll en strømlinjeformet (og visuelle) metode for etterforskerne samle PPs for første gang. Teknikkene vi beskriver er lett mestret og lett gi et stort antall celler med> 90% celleviabilitet. Den cryosectioning protokollen gir svært reproduserbare seriesnitt ideell for immunfluorescens flekker og confocal imaging. Videre utfyller vår protokoll to andre nyere Jove artikler. Den første, etter Fukuda og kolleger, beskriver bruken av ligert ileal sløyfe analyser å vurdere opptaket av patogene bakterier av PP M celler 12. Den andre, etter Geem og kolleger beskriver isolering og karakterisering av DCS og makrofager fra musen tarmslimhinnen, men eksplisitt utelukker PPs fra deres analyse 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen har vi gitt parallelle protokoller for å forberede PP encellete forberedelsene til flowcytometrisk og funksjonell analyse og cryosections for farging. Begge metodene er meget reproduserbare og lett tilgjengelig, forutsatt et flowcytometer og kryostat er tilgjengelig. For første gang undersøkere det skal påpekes at i forhold til milt, totale celleutbytter fra PPs er relativt dårlig. Likevel, protokollen vi skissere generelt gir mellom 0,8 til 1,2 x 10 6 totalt PP celler fra en enkelt mu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Renjie Song (Wadsworth senter flowcytometri Core) for å få hjelp i celle analyse og Helen Johnson (Wadsworth senter Animal Histopatologi Core) for utarbeidelse av parafinsnitt. Vi takker Dr. Richard A. Cole (Wadsworth senter Light Mikroskopi Core) for å få hjelp med konfokalmikroskopi og bildesamling. Vi ønsker å erkjenne Andy Bentley (Wadsworth Center Bilde og illustrasjon) for å få hjelp med animasjoner.
MDJ støttes av Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA er støttet av en Wadsworth Center-Helse Research Inc. egenutført postdoktorstipend. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH tilskudd HD061916 og GM082978.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
- Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA’s complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
- Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
- Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
- Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
- Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer’s patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
- Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
- Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer’s Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
- Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer’s patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
- Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
- Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer’s patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
- Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer’s patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).
