Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

В режиме реального времени Анализы транспорта ретинола на мембранный рецептор плазменных Retinol Binding Protein

Published: January 28, 2013 doi: 10.3791/50169
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства высококачественных витаминов A / RBP комплекс и два мониторинга в реальном времени методы для изучения витамина транспорта STRA6, RBP рецепторов.

Abstract

Витамин А необходим для зрения и роста / дифференциации практически всех органов человека. Плазменные ретинол-связывающего белка (РСБ) является принципом и конкретным носителем витамина А в крови. Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства и очистки голо-RBP и два в реальном времени методы мониторинга для изучения транспорта витамина А на высокое сродство рецептора RBP STRA6. Первый метод позволяет производить большое количество высококачественного голо-RBP (100% загружены с ретинолом) витамина транспорта анализов. Высокое качество RBP имеет важное значение для функционального анализа, потому что неправильно свернутых RBP-релизы витамин А легко и бактериального загрязнения в подготовке RBP может привести к появлению артефактов. Мониторинг в реальном времени методы, как электрофизиологии внесли решающий вклад в исследования мембранного транспорта. RBP рецептор-опосредованного транспорта ретинола не были проанализированы в реальном времени до недавнего времени. Второй метод, описанный здесь, является причинамл-временной анализ STRA6 катализируемой ретинол освобождение или нагрузки. Третий способ в режиме реального времени анализ STRA6 катализируемой ретинол транспорта от голо-RBP к сотовым ретинол связывающий белок I (CRBP-I). Эти технологии обеспечивают высокую чувствительность и разрешение при выявлении витамина RBP рецептора механизм усвоения.

Introduction

Витамин А является органической молекулой, которая необходима для выживания человека и надлежащее функционирование практически всех органов человека. Производные витамина А (ретиноиды) участвовать в разнообразных биохимических и клеточных событий, в том числе датчиков света за 1,2 видение и регуляции экспрессии генов и белков перевода во время эмбрионального развития и в тканях взрослого 3-6. Несмотря на то, ретинол обладает способностью диффундировать системно, эволюция придумала плазмы ретинол связывающий белок, специфический белок-носитель витамина транспорта в крови для достижения высокой эффективности и специфичности и, чтобы избежать токсичности, связанной со случайным диффузии 7-10. Высокое сродство рецептора, который связывается с ОДП и занимает витамин Была выдвинута гипотеза, в 1970-х годах 11-13. Несмотря на фактических данных, накопленных в течение трех десятилетий о существовании рецепторов RBP 14-31, рецептор гипотеза обсуждалась в течение многих лет из-за existencе неправильное определение голо-РСБ. Правильное определение голо-РСБ является то, что высокое сродство комплекса 1:1 между ретинолом и ОДП. Повторное извлечение голо-RBP органических растворителей необходимо производить апо-РСБ. Это определение используется почти во всех лабораториях изучения RBP 7,9,32-35 или рецептора RBP 14-31,36-42. Неверное определение голо-РСБ, который был использован, чтобы опровергнуть существование рецепторов КПБ является острая смесь свободного ретинола с апо-РСБ. Поскольку функция RBP рецептора витамина поглощения от голо-РСБ является освобождение ретинола от голо-РСБ, рецептор RBP будет играть никакой роли в ретинол поглощения, если ретинол является бесплатным для начала (как это было предложено неправильное определение голо -RBP).

Последнее определение RBP рецептора белка домена multitransmembrane называется STRA636 и его функции витамина поглощения от голо-RBP 36-43 решительно выступает против гипотезы, что RBP ненужно рецепторов для доставки витамина А. Подробный анализ показал, что STRA6 имеет 9 трансмембранных доменов с N-конца расположены внеклеточно и С-концом расположена внутриклеточно 40. Расположенный между трансмембранными 6 и 7 является одним из важнейших RBP связывающий домен 39. STRA6 соединен с обеих LRAT и CRBP-I в витамин А поглощение от голо-РСБ, но ни LRAT ни CRBP-я абсолютно необходима для повышения STRA6 деятельности 41. Способность STRA6 по активизации ретинол освобождение от голо-РСБ является ключом к ее поглощению витаминов деятельности 41. Опираясь на STRA6 выпустить свой ретинол, витамины доставки RBP может транспортировать витамин А к клеткам-мишеням в периферических тканях с высокой специфичностью и эффективностью.

Решающее значение голо-RBP определению и подготовке иллюстрируется не только исторические дебаты о существовании рецепторов КПБ, но и трех связанных с недавних работ на основе голо-RBP определения различотличный от оригинала и правильное определение 44-46. В первом документе использованы голо-RBP определение, которое было использовано для одобряют существование RBP рецепторов для изучения рецепторов RBP 44. Вторая и третья работы придумали третье определение голо-РСБ, что сделало его еще менее вероятно, для ретинола должны быть изучены, чтобы сформировать правильный комплекс с ОДП 45,46. Эти исследования подготовлены 3 H-retinol/RBP путем смешивания голо-RBP (даже не апо-РСБ) с 3 H-ретинол. С этого анализа не есть 3 H-retinol/RBP сформирован и не снять излишнее бесплатно 3 H-ретинол 45,46, это не тест для 3 H-ретинол поглощения от 3 ​​H-retinol/RBP, но это бесплатный 3 H-ретинол диффузии анализа. Было показано ранее, что STRA6 не увеличивает поглощение клетками свободного ретинола по LRAT 38 или CRBP-I 41. Практически все ретинола связана с ОДП в крови, и нет обнаруживаемых частотыэлектронной ретинола. Основной функцией рецептора RBP является ускорение ретинол освобождение от голо-РСБ во время ретинол поглощения от голо-RBP 41. Если ретинол искусственно выпустили или в свободной форме, чтобы начать с 45,46, рецептор RBP не нужен. Резко отличается от результатов, полученных свободной анализа диффузии ретинола по сравнению с анализы, основанные на правильно подготовленную голо-RBP показывают, что правильная подготовка RBP имеет решающее значение для его функционального анализа.

RBP может быть очищен из сыворотки крови человека 41, но процедура является сложной и низкая урожайность. Альтернативным подходом является создание RBP в E. палочки. Потому E. палочки не имеют возможности правильно сложить млекопитающих секретируемых белков с более чем одной парой дисульфидных связей, как RBP, важно, чтобы сложите RBP и очистить правильно сложить белка. Неправильно упакованных белков не только ведут себя иначе, исправлены сложенном RBP в различные анализы,но и привести к агрегации белков при хранении. По той же причине, апо-RBP производится только из высококачественных голо-РСБ. Мы описываем здесь оптимизированный протокол для получения высокого качества RBP загружены на 100% с ретинолом через бактериальные выражения, рефолдинг, и ВЭЖХ очистки. ВЭЖХ очистки не только удаляет неправильно сложил ОДП, но и значительное бактериальное загрязнение, которое может вызвать серьезные артефакты, если RBP используются в анализах сигнала. Мы также описывают два чувствительных мониторинга в реальном времени методы для изучения ретинол транспорта STRA6. Оба метода зависит от высокого качества RBP. Из-за ограниченности пространства, классические методы радиоактивного ретиноидов основе и ВЭЖХ на основе витамина А поглощение анализы не были описаны здесь.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Производство, складывая и ВЭЖХ очистки Холо-RBP

  1. Преобразование BL-21cells с вектором рЕТ3а несущие кДНК человека RBP с 6-кратным теги Его на N-конце. Расти превращается BL-21 клеток в шейкере при 37 ° С в 40 мл LB среды с карбенициллин до OD при 600 нм достигает 0,5. Вызвать RBP экспрессии белка путем добавления IPTG до 1 мм. Рост бактерий при 37 ° C еще 5 часов.
  2. RBP производится в E.coli в основном присутствует в нерастворимые телец включения. Для обогащения телец включения, осадок клеток при 10000 х г в течение 20 мин. Тогда разрушать ультразвуком клетки на льду в 5 мл PBS с ингибиторами протеазы, а затем 2 циклов замораживания и оттаивания. Пелле по тел включения при 20000 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Удалите супернатант и сохранить осадок на льду.
  3. Растворения включения тела гранулы с помощью ультразвука в 10 мл 7,5 М гидрохлорида гуанидина. Добавить половину объема (5 мл) в 25 мМ Трис-буфера, рН 9,0 и DTT до конечной сoncentration 10 мМ. Энергично перемешайте раствор на вихревой смеситель ночь при комнатной температуре в полной мере уменьшения и денатурации белков.
  4. Центрифуга белковый раствор для удаления нерастворимого материала при 18000 х г в течение 20 мин при 4 ° C. После того, как спина, передает супернатант в новую пробирку и поместить пробирку на льду.
  5. Подготовка четырех томах (60 мл) рефолдинг буфере (25 мМ Трис, рН 9,0, 0,3 мМ цистин, цистеин 3,0 мМ, 1 мМ ЭДТА). Дега рефолдинг буфера. Также приготовьте 600 мкл 10 мМ ретинола в этаноле при тусклом красном свете. Держите его в темноте на льду. Оба буфера повторной укладки и ретинола решения должны быть свежеприготовленной.
  6. Охладить и белкового раствора и складывая буфера на льду в течение по крайней мере 30 мин. Повышение температуры всего снижает качество сложил ОДП. Добавить 1 мл рефолдинг по каплям буфера и 10 мкл ретинол решение в свою очередь, в то время как белковый раствор энергично смешать в стакане со льдом. Повторите этот шаг, пока все буфере повторной укладки и ретинолдобавлены. Продолжайте размешивать реакция на льду в темноте в течение 5 часов.
  7. Спином вниз рефолдинг реакции при 24000 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Важно, чтобы удалить агрегатов сразу после рефолдинг реакции.
  8. Концентрат супернатант решения с использованием Amicon Ультра 15 концентратора (MWCO 10 K) до примерно 10 мл. Не концентрируйтесь сложил решение более такого уровня. Обогатительный слишком много приведет к агрегации белков и снижает конечный выход и качество правильно сложить ОДП. Развести концентрированный образца с холодным PBS до 100 мл. Цель этого шага заключается в удалении компонентов в рефолдинг реакции, которые мешают очистке никеля.
  9. Побочные решение еще раз при 24000 х г в течение 20 мин при 4 ° C. Важно, чтобы удалить осадок. Передача супернатант до двух 50 мл пробирок, содержащих по 1 мл Ni-NTA суспензии, которая была промывали PBS. Поворот трубы при 4 ° С в течение одного часа. Инкубация разбавленный раствор Fили 1 часа может привести к выпадению неправильно упакованных белков, которые должны быть удалены.
  10. Спином вниз трубы при 500 мкг в течение 3 мин. Удалить супернатант осторожно. Все плавающие должны быть удалены. Добавить холодным PBS до 30 мл для каждой трубки. Побочные снова и удалите супернатант. Повторите этот процесс, пока Вы не увидите ничего, кроме бисера в трубке.
  11. Передача Ni-NTA смолы в пустую колонку. Вымойте смолы с 20 объемами колонки 10 мМ имидазола, 500 мМ NaCl в PBS. Его Элюировать-RBP в 5 объемов колонки 100 мМ имидазола в PBS. Не хранить это решение в течение длительного периода времени, а также замораживание снижает конечный выход и качество. Для получения лучшего результата, очищают с помощью ВЭЖХ RBP немедленно.
  12. Его диализировать-RBP очищают от Ni-NTA смолы против 25 мМ Трис, рН 8,4, 120 мМ NaCl. Концентратор также может быть использована для буфера обмена. Ясно образцов для ВЭЖХ путем центрифугирования при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° C перед каждым запуском.
  13. Очищают голо-RBP на ВЭЖХ с использованием ионнойобменной колонны AX-300 от градиента NaCl шагом (220 мм 12 мин, 360 мм, 15 мин и 1.000 мм 15 мин) с использованием 25 мМ Трис, рН 8,4 в качестве подвижной фазы на 1 мл / мин. Как NaCl повышении концентрации, голо-His-RBP выпущена в то время как апо-RBP и неправильно свернутых RBP остаются связанными с колонкой (рис. 1). Если RBP рефолдинг не сделать оптимально, неправильно свернутых RBP (например, неправильно свернутых RBP-я в рис. 1) может преобладать всей подготовки.
  14. Восстановление правильно сложить голо-RBP от пика фракций на 360 мм NaCl. Внимательно следите профиль элюирования правильно сложить и неправильно свернутых Его-RBP. В 1000 мм NaCl, большинство из неправильно свернутых Его-RBP должны быть освобождены.
  15. Фракции, содержащие голо-RBP объединяют, концентрируют и диализуют против PBS в течение ночи при 4 ° C. Дата окончательного урожайности и качества (330 nm/280 нм) на спектрофотометре. Правильно сложить продукт должен иметь nm/280 330 нм отношение немного выше, чем за 1 (рис. 1).
  16. Для производстваэлектронной апо-РСБ, добавляют равный объем гептана в очищенном голо-RBP и аккуратно перемешать, вращая течение ночи при 4 ° C. Центрифуга при 16000 г в течение 10 мин при 4 ° C и тщательно передать нижней водной фазы в новую пробирку (избегая осадок на границе). Повторите процедуру три раза с 3 ч инкубации для каждого. Проверьте поглощения на спектрофотометре NanoDrop чтобы убедиться, что 330 нм пика снизилась до фонового уровня.

2. В режиме реального времени мониторинг STRA6 катализируемой Ретинол Ретинол выбросов и Загрузка

  1. Блок черный 96-а Microfluor-2 пластины (Thermo Scientific) с 200 мкл Blocker казеина (Pierce) в течение ночи при 4 ° С, чтобы предотвратить прилипание неспецифической голо-RBP к пластику. Blocker казеина дает лучший блокирующий эффект все блокировки решений мы тестировали.
  2. Мембраны свежеприготовленный из клеток, экспрессирующих STRA6 или контроль клетки промывали PBS использования и пропускают через Гамильтон шприц (GastiGHT # 1710) 6 раз до получения однородной суспензии в PBS. Мы обычно используют мембраны, полученные от 1/100 до 1/20 клеток, выращенных на 100 мм блюдо за реакцией.
  3. Промойте лунки из Microfluor-2 пластины один раз 200 мкл PBS. Охладить пластины на льду перед добавлением суспензии мембран (50 мкл на лунку).
  4. Мониторинг в режиме реального времени ретинола флуоресценции измеряют с помощью флуоресценции оптики Полярная звезда Omega (BMG Labtech) с возбуждением фильтр 320EX и фильтр твердых 460-10. Программа установлена ​​в режим чтения Endpoint. Плита режим также может быть использован для измерения времени, конечно, если интервалы времени не изменяется. Сигнал от каждого момента времени является в среднем на 10 измерений (орбитальная усреднения с диаметром 2 мм), а коэффициент усиления установлен на уровне 1.800. Пластину встряхивают в течение 10 сек при 500 оборотов в минуту использовании двойных орбитальное вращение перед каждым измерением.
  5. Чтобы начать ретинол анализа релизе, скважин читать один раз, используя Endpoint м чтенииода до голо-RBP (как правило, 1 мкМ конечной концентрации) добавляют при 0 мин. Как только голо-RBP добавляют, реакция постоянно контролируется каждые 5-10 мин в течение 1-3 часов. Чтобы начать ретинол анализа загрузки, полностью транс-ретинол (как правило, 1 мкМ конечной концентрации) добавляют в лунки при тусклом красном свете. Пластина читается один раз перед апо-RBP добавляют при 0 мин. Как только апо-RBP добавляют, реакция постоянно контролируется каждые 5-10 мин в течение 1-3 часов.
  6. После всех измерений сделано, скачать исходные данные (например, показано на рисунке 2) из анализа Omega данных программного обеспечения (BMG Labtech) в Microsoft Excel для анализа данных. Каждый раз, когда точка создает файл, который содержит показания всех экспериментальных условиях. Например, если имеется 20 временных точках, консолидировать 20 файлов в один файл Excel для анализа данных.
  7. Для анализа данных, сигналов флуоресценции перед добавлением ретинола или голо-RBP на 0 мин считаются фоне сигналовD вычитается из окончательной сигналов флуоресценции во всех временных точках. Несмотря на фоне сигналов низкой по сравнению с ретинолом флуоресценции в голо-RBP, вычитания фона исключает неспецифическое влияние рассеяния света мембран и дает возможность сосредоточиться на ретинол флуоресценции голо-RBP или ретинол добавляют при 0 мин.

3. В режиме реального времени мониторинг STRA6 катализируемой транспорта ретинола с Холо-RBP на CRBP-I

  1. Ретинол-EGFP является новой флуоресценции передачи резонанса (FRET) пара, которая недавно была создана 41. STRA6 катализируемой ретинол транспорта от голо-RBP на EGFP-CRBP-I контролируется в режиме реального времени путем измерения ретинол-EGFP FRET. EGFP-CRBP-я слитого белка с 6XHis тегов (EGFP-CRBP-I) образуется в клетках млекопитающих и очищают на Ni-NTA смолы перед экспериментом. EGFP-CRBP-I могут быть сохранены в PBS с ингибиторами протеазы в течение короткого периода времени при 4 ° C. Кроме гибридного белка яс замороженными в -80 ° C в небольших аликвотах.
  2. Перед реакций, подготовить их Microfluor-2 пластины и мембраны, как описано выше. Промойте лунки из Microfluor-2 пластины один раз 200 мкл PBS перед добавлением суспензии мембран (50 мкл на лунку).
  3. В режиме реального времени ретинол-EGFP FRET измеряется с помощью Полярная звезда Omega с возбуждением фильтр 320EX и выбросов фильтрами 460-10 и 510-10, используя одновременно дуэль излучения флуоресценции оптики. Программа установлена ​​в режим чтения Endpoint. Плита режим также может быть использован для измерения времени, конечно, если интервалы времени не изменяется. Сигнал от каждого момента времени является в среднем на 10 измерений (орбитальная усреднения с диаметром 2 мм) и усиление установлено на высоте 1800 на канал. Пластину встряхивают в течение 10 сек при 500 оборотов в минуту использовании двойных орбитальное вращение перед каждым измерением.
  4. Для начала реакции, EGFP-CRBP-I (как правило, 1 мкМ конечной концентрации) добавляют в лунки. Пластина читать дальшесе, используя режим Endpoint чтении до голо-RBP добавляют при 0 мин. Как только голо-RBP добавляют, реакция постоянно контролируется путем измерения каждые 5-10 мин в течение 1-2 часов.
  5. После всех измерений сделано, скачать исходные данные (например, показано на рисунке 3) из программного обеспечения для анализа Omega данных в Microsoft Excel для анализа данных, как описано выше.
  6. Ретинол-EGFP FRET рассчитывается путем динамического изменения в соотношении акцептором / донора выбросов пики 47. Уравнение 41 до рассчитать это соотношение [(510 т -510 б) / (460 т -460 б)], где 510 т, 510 б, 460 т и 460 б представляют выбросы на 510 нм после начала реакции ( T = время точки), при 510 нм до ретинола или голо-RBP добавлена ​​(б = фоне), при 460 нм после начала реакции (Т = момент времени), а при 460 нм до ретинола или голо-RBP добавлен (б = фоне), соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы приведем здесь представитель результатов голо-RBP производства и очистки с помощью ВЭЖХ (рис. 1), в режиме реального времени анализ STRA6 катализируемой ретинол освобождение от голо-RBP и ретинола загрузки в апо-ОДП (рис. 2) и в режиме реального времени анализ STRA6 катализируемой ретинол транспорта от голо-RBP на EGFP-CRBP-I (рис. 3).

Без повторной укладки, RBP производится в бактерии почти полностью неправильно свернутых в связи с наличием многих неправильных дисульфидные связи. Таким образом, складывая в присутствии лиганда ретинол является критически важным в получении хорошо сложенный ОДП. Мы обнаружили, что если рефолдинг реакции не будет сделано правильно, неправильно свернутых RBP видов (например, неправильно свернутых RBP-я в рис. 1) может преобладать целом подготовка и выход высокого качества голо-RBP может быть очень низким после очистки ВЭЖХ. Таким образом, ВЭЖХ не может исправить проблему плохого повторной укладки. Как показано в (рис. 1). Хотя частично неправильно свернутых RBP по-прежнему связывает ретинол, ретинол / RBP комплекса является гораздо менее стабильны, и РСБ более охотно отпускает связаны ретинола. Неправильно свернутых RBP может привести к неправильным выводам из RBP или витамин связанных эксперименты. Еще одно различие между правильно сложить RBP и неправильно свернутых RBP в том, что правильно сложить голо-РСБ является стабильным в течение многих лет при 4 ° С в PBS. Еслиголо-RBP препарат неправильно свернутых RBP загрязнения, нерастворимые материалы будут появляться после периода хранения. Нерастворимых материалов может наблюдаться после летел вниз решения на высокой скорости при 4 ° C. Apo-RBP производится только из высококачественных голо-РСБ.

После очистки высокого качества голо-RBP или апо-RBP доступна, она может быть использована для изучения STRA6 катализируемой ретинол транспорта. И в режиме реального времени ретинол анализ выпуска и ретинола загрузкой анализа зависит от мониторинга ретинол флуоресценции. Одним из источников искусственное снижение ретинола флуоресценции неспецифического связывания RBP в пластиковую чашку (один раз RBP привязан к пластиковой стене, она больше не может быть измерено в растворе). Мы протестировали много блокирование условиях и обнаружили, что блокирование казеина (Pierce) является наиболее эффективным в снижении этой неспецифической и рецептор-независимым снижение ретинола флуоресценции. Другой источник искусственного снижения ретинол флуоресценции низкого качества RBP, как обсуждалосьвыше.

STRA6 катализируемой ретинол релизе, ретинол погрузки и транспорта ретинола являются относительно медленными событий, как показано на репрезентативных данных на рисунках 2 и 3. Реакции относительно медленно, потому что каждый RBP только связывает одна молекула витамина А и все STRA6-катализируемых реакций зависит как от RBP обязательным и RBP диссоциации, чтобы продолжить. Для STRA6 катализируемой ретинол релизе реакция будет продолжаться, голо-RBP может быть привязан только после того, как апо-RBP диссоциирует. Для STRA6 катализируемой реакции ретинол загрузки продолжится, апо-RBP может быть привязан только после голо-RBP диссоциирует. Для всех мониторинга в реальном времени методы, описанные здесь, мы обнаружили, что идеальная частота измерений одно измерение каждые 5 или 10 мин. Несмотря на более частое измерение может создать высшее временного разрешения, полученные данные файлы будут очень большими, потому что каждый момент времени создает Excel файл.

Рисунок 1 палатки ширина = "5.5in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1.jpg" />
Рисунок 1. Очистка сложил RBP на высокоэффективной жидкостной хроматографии для получения голо-RBP загружены на 100% с ретинолом. Никель смолы очищенный сложил RBP наносят на ионообменную колонку AX-300 от градиента NaCl шагом (220 мм 10 мин, 360 мм, 15 мин и 1.000 мм 15 мин). Правильно сложить голо-His-RBP выпущен и элюировали при 360 нм NaCl. Спектры поглощения (250 нм-400 нм) пиков, соответствующих правильно сложить голо-RBP, неправильно свернутых ОПБ-1, ОПБ неправильно свернутых-2, и загрязнение также показаны (белок пик обозначен синей вертикальной линии и ретинол пик указано красные вертикальные линии). Нажмите, чтобы увеличить показатель .

d/50169/50169fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Режиме реального времени мониторинг STRA6 катализируемой ретинол загрузки в апо-RBP и ретинола освобождение от голо-РСБ. Этот анализ играет важную роль в выявлении STRA6, что может сделать сам, без LRAT или CRBP-IA примере файл исходных данных для STRA6-catalzyed ретинола и ретинол загрузки релиз, как показано на программное обеспечение для анализа данных Omega. Чтобы начать ретинол реакции релизе, голо-RBP добавляют в STRA6 мембраны или мембраны контроль на 0 мин. Чтобы начать загрузку ретинол реакции, ретинол добавляют в STRA6 мембраны или мембраны контроль смешивают с апо-RBP на 0 мин. Измерения флуоресценции на 320 нм и возбуждения 460 нм излучения показало время ход реакции. Реакции от 1 до 6 мониторов ретинол загрузки в апо-RBP (1, 3, и 5 STRA6 реакции; 2, 4, и 6 контрольных реакций). Реакции от 7 до 12 мониторов ретинол загрузки в апо-RBP (7, 9, и 11 STRA6 реакции; 8, 10, и 12 контрольных реакций). B. Окончательный рассчитывается сигналы для реакции показана на А. левый график был рассчитан на основе реакций 1 до 6. Правый график был рассчитан на основе реакции 7 до 12. Самый высокий сигнал флуоресценции определяется как 1 в левой графе. Флуоресценции голо-RBP добавляют при 0 мин определяется как 1 в правой графе. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3
Рисунок 3. Режиме реального времени мониторинг STRA6 катализируемой ретинол транспорта от голо-RBP на CRBP-IA примере файл исходных данных, которая отслеживает FRET между ретинолом и EGFP, как показано на программное обеспечение для анализа данных Omega. При 0 мин, голо-RBP добавляется в реакциях содержащие STRA6 мембраны (реакции 1, 3 и 5), или контроль мембраны с EGFP-CRBP-Я для начала реакции (реакции 2, 4 и 6). Одновременное дуэли измерения выбросов для возбуждения при 320 нм показало, зеленый след, 460-10 выбросов конечно время и синий след, конечно 510-10 времени излучения. В. Окончательный рассчитывается FRET сигналы для реакции показана на А. FRET сигналы были рассчитаны в соответствии с методикой в шаге 3.6. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы разделяем здесь оптимизированный протокол производство ОДП, потому что RBP производства и очистки имеют решающее значение для создания правильно сложить ОДП. Учитывая возможность неправильно свернутых видов ОДП и наличие следовых количеств бактериальных белков даже в ВЭЖХ очищенных бактерий производства RBP, было бы полезно использовать родной RBP из сыворотки крови, чтобы подтвердить вывод, связанные с ОДП. Моча ОДП, которая является коммерчески доступным, представляет собой сложную смесь многих видов ОДП в том числе апо-RBP и голо-ОДП 48,49.

В режиме реального времени мониторинг методов, описанных здесь, основаны на собственной флуоресценции ретинола. Первоначальный импульс для развития этих анализов было то, что мы были ограничены в информации, которая может быть обнаружена только классические радиоактивного анализа и ВЭЖХ на основе анализов. Например, мы обнаружили, что STRA6 имеет мало витамина поглощения деятельность сама по себе витамин А анализы крови поглощать, но мы не можем легко объяснить низкую активность STRA6 в витамин А поглощение без LRAT или CRBP-I 41. В ретинил на основе сложных эфиров анализы, то легко понять, что STRA6 сама по себе не делает ретинол эфир, потому что STRA6 не является ферментом, который имеет LRAT деятельности. Тем не менее, даже в ретинола на основе анализов, STRA6 еще немного деятельность сама по себе. Есть ли у вас STRA6 витамина А поглощение деятельности на всех? Если это не так, как может CRBP-I или LRAT ускорить свою деятельность? Если это так, то почему она нужна CRBP-I или LRAT? Хотя радиоактивного анализа и ВЭЖХ на основе анализов не ответить на эти вопросы, мы рассудили, что STRA6 должны иметь возможность выпустить ретинол от ОДП. Мы также полагали, что анализ ретинол флуоресценции может раскрыть эту деятельность. Ретинол измерения флуоресценции позволило изучать движение свободного ретинола в клетках позвоночных фоторецептора после легкого отбеливания зрительных пигментов в режиме реального времени 50,51. Как RBP активность рецептора быть проверены путем измерения флуоресценции ретинол? Он был обнаружен вначале 1970-х два научно-исследовательских групп, которые ретинола резко усиливается флуоресценция при привязке к ОДП 52,53. Мы обнаружили, что STRA6 катализируемой ретинол освобождение от голо-RBP вызывает снижение ретинола флуоресценции, в то время как STRA6 катализируемой ретинол загрузки в апо-RBP приводит к увеличению ретинол флуоресценции. Хотя радиоактивного анализа и ВЭЖХ на основе анализа широко используются для изучения витамина А поглощение, флуоресценция анализов не были использованы для изучения RBP активности рецептора до недавнего времени, вероятно, потому, что эндогенные мембран, используемых в качестве источника рецепторов обладают очень высокой фоновой флуоресценции и имеют сложную смесь ретиноидов связывающих белков / ферментов, что делает его трудно интерпретировать вклад каждого белка. В настоящее время доступны чувствительные приборы также то, что делает эти методы более реальным. В дополнение к прямым флуоресценции измерение, новый ретинол-EGFP FRET пар 41 в сочетании с одновременным оптики выбросов дуэльпозволяет изучать ретинол транспорта ретинола связывающих белков в реальном времени и в различных реакций одновременно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Поддержка Национального института здоровья грант R01EY018144.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Tags

Биохимия выпуск 71 молекулярной биологии генетики клеточной биологии анатомии физиологии офтальмологии протеомики белки мембранные белки транспорта витамина А ретиноиды RBP комплекса мембранного транспорта мембранные рецепторы STRA6 ретинол связывающий белок
В режиме реального времени Анализы транспорта ретинола на мембранный рецептор плазменных Retinol Binding Protein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H.… More

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter