Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Real-time analyses van Retinol Vervoer door de membraan receptor van Plasma Retinol bindend eiwit

Published: January 28, 2013 doi: 10.3791/50169
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde techniek om hoogwaardige vitamine A / RBP complex en twee real-time monitoring technieken om studeren vitamine A het vervoer door STRA6, de RBP-receptor te produceren.

Abstract

Vitamine A is essentieel voor het gezichtsvermogen en de groei / differentiatie van bijna alle menselijke organen. Plasma retinol-bindend eiwit (RBP) is het principe en specifieke drager van vitamine A in het bloed. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde techniek te produceren en te zuiveren holo-RBP en twee real-time monitoring technieken om het vervoer van vitamine A door de hoge-affiniteit RBP receptor STRA6 bestuderen. De eerste techniek is het mogelijk om een ​​grote hoeveelheid hoge kwaliteit holo-RBP (100% geladen met retinol) voor vitamine A transport assays. Hoge kwaliteit RBP is essentieel voor functionele testen, omdat verkeerd gevouwen RBP releases vitamine A gemakkelijk en bacteriële besmetting in RBP voorbereiding kan leiden tot artefacten. Real-time monitoring technieken zoals elektrofysiologie zijn kritische bijdragen geleverd tot de studies van membraan transport. De RBP-receptor-gemedieerde retinol vervoer niet is geanalyseerd in real time tot voor kort. De tweede techniek is de hier beschreven real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol release of laden. De derde techniek is real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om cellulaire retinol-bindend eiwit I (CRBP-I). Deze technieken zorgen voor een hoge gevoeligheid en resolutie in het onthullen van RBP receptor vitamine A opname mechanisme.

Introduction

Vitamine A is een organisch molecuul dat essentieel is voor de menselijke overleving en de goede werking van bijna alle menselijke organen. Vitamine A-derivaten (retinoïden) deel te nemen aan diverse biochemische en cellulaire evenementen, waaronder de detectie van licht voor visie 1,2 en de regulatie van genexpressie en eiwit translatie tijdens de embryonale ontwikkeling en in volwassen weefsels 3-6. Hoewel retinol heeft de mogelijkheid om systemisch verspreiden, evolutie bedacht plasma retinol-bindend eiwit, een specifieke dragereiwit voor vitamine A transport in het bloed hoge efficiëntie en specificiteit te bereiken en toxiciteit van willekeurige diffusie 7-10 vermijden. Een hoge affiniteit receptor die bindt aan RBP en neemt vitamine A hypothese is in de jaren 1970 11-13. Ondanks bewijs verzameld in drie decennia op het bestaan ​​van de RBP receptor 14-31 werd de hypothese receptor besproken vele jaren door de existence van een onjuiste definitie van holo-RBP. De correcte definitie van holo-RBP is dat de hoge affiniteit 1:1 complex tussen retinol en RBP. Herhaalde extractie van holo-RBP organisch oplosmiddel moet apo-RBP produceren. Deze definitie wordt gebruikt door bijna alle laboratoria bestuderen RBP 7,9,32-35 of de RBP-receptor 14-31,36-42. De onjuiste bepaling van holo-RBP die werd gebruikt om het bestaan ​​van de RBP receptor weerleggen de acute mengsel van vrije retinol met apo-RBP. Aangezien de functie van de receptor RBP in vitamine A opname van holo-RBP is retinol bevrijden van holo-RBP de RBP receptor zou geen rol spelen in retinol opname als retinol vrij om te beginnen (zoals voorgesteld door de onjuiste bepaling van holo -RBP).

De recente identificatie van RBP receptor als multitransmembrane domein eiwit STRA636 en zijn functie in vitamine A opname van holo-RBP 36-43 sterk pleit tegen de hypothese dat niet RBPhebben een receptor aan vitamine A. Gedetailleerde analyse bleek dat STRA6 9 transmembraandomeinen de N-terminus extracellulair gelegen en C-terminus gelegen intracellulair 40 moet leveren. Gelegen tussen transmembraan 6 en 7 is een essentieel RBP bindend domein 39. STRA6 is gekoppeld aan zowel LRAT en CRBP-I in vitamine A opname van holo-RBP, maar noch LRAT noch CRBP-I is absoluut noodzakelijk voor een betere STRA6 activiteit 41. STRA6's vermogen om retinol vrijkomen katalyseren van holo-RBP is de sleutel tot de vitamine A-opname-activiteit 41. Door te vertrouwen op STRA6 zijn vrij retinol, vitamine A bezorging RBP transporteren vitamine A doelcellen in perifere weefsels met hoge specificiteit en efficiëntie.

De kritische belang van holo-RBP definitie en bereiding wordt geïllustreerd door niet alleen de historische discussie over het bestaan ​​van de RBP receptor, maar ook door drie verbonden recente artikelen op basis van holo-RBP definities diflende van het origineel en correcte definitie 44-46. De eerste papier de holo-RBP definitie die werd gebruikt om het bestaan ​​van de RBP receptor de receptor bestuderen RBP 44 afkeuren. De tweede en derde papers kwam met een derde definitie holo-RBP dat het nog minder waarschijnlijk retinol worden bestudeerd om een goede complex met RBP 45,46 vormen. Deze studies bereid door mengen van drie H-retinol/RBP holo-RBP (zelfs apo-RBP) met 3 H-retinol. Aangezien deze test niet hebben 3 H-retinol/RBP gevormd en verwijderde niet buitensporige vrije 3H-retinol 45,46 is geen test voor 3H-retinol opname van 3 H-retinol/RBP, maar is een vrije 3H-retinol diffusie assay. Eerder is aangetoond dat STRA6 geen cellulaire opname van vrije retinol verbeteren door LRAT 38 of CRBP-I 41. Vrijwel alle retinol is gebonden aan RBP in het bloed en er geen detecteerbare free retinol. Een van de belangrijkste functie van de RBP-receptor is retinol vrijkomen katalyseren van holo-RBP tijdens retinol opname van holo-RBP 41. Als de retinol kunstmatig model of in vrije vorm te beginnen 45,46 wordt het RBP receptor niet nodig. De sterk verschillende resultaten van de vrije diffusie retinol assay ten opzichte van assays gebaseerd op kunnen bereid holo-RBP illustreren dat correcte voorbehandeling van RBP is cruciaal voor de functionele assays.

RBP kan worden gezuiverd uit humaan serum 41, maar is complex en de opbrengst is laag. Een alternatieve benadering is om RBP produceren in E. coli. Omdat E. coli niet de mogelijkheid kunnen zoogdieren uitgescheiden eiwitten vouwen met meer dan een paar disulfidebindingen zoals RBP, is het essentieel om refold RBP en correct gevouwen eiwit te zuiveren. Verkeerd gevouwen eiwitten niet alleen gedragen zich anders uit gecorrigeerde gevouwen RBP in verschillende assays,maar ook tot eiwitaggregatie tijdens opslag. Om dezelfde reden wordt apo-RBP alleen geproduceerd uit hoogwaardig holo-RBP. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van hoge kwaliteit te produceren RBP 100% geladen met retinol door bacteriële expressie, hervouwing, en HPLC zuivering. HPLC zuivering verwijdert niet alleen verkeerd gevouwen RBP, maar ook belangrijke bacteriële besmetting die kan leiden tot ernstige artefacten als RBP wordt gebruikt in signaaltransductie assays. We beschrijven ook twee gevoelige real-time monitoring technieken om retinol vervoer bestuderen door STRA6. Beide technieken zijn afhankelijk van hoge kwaliteit RBP. Vanwege de beperkte ruimte, de klassieke technieken van radioactieve retinoïde-based en HPLC-gebaseerde vitamine A opname testen worden hier niet beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Productie, hervouwing, en HPLC zuivering van Holo-RBP

  1. Transformeren BL-21cells de pET3a vector die het cDNA voor menselijke RBP met 6x His tag aan de N-terminus. Groeien de getransformeerde BL-21 cellen in een shaker bij 37 ° C in 40 ml LB medium met carbenicilline tot OD bij 600 nm bereikt 0.5. RBP eiwitexpressie induceren door toevoeging IPTG tot 1 mM. De bacteriën groeien bij 37 ° C nog eens 5 uur.
  2. RBP geproduceerd in E.coli is vooral aanwezig in onoplosbare inclusielichamen. Om insluitingslichamen, pellet cellen verrijken op 10.000 xg gedurende 20 minuten. Vervolgens ultrasone trillingen de cellen op ijs in 5 ml PBS met proteaseremmers, gevolgd door 2 cycli van invriezen en ontdooien. Pellet beneden de insluitingslichamen bij 20.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en bewaar de pellet op ijs.
  3. Oplossen van het insluitingslichaam pellet door sonicatie in 10 ml 7,5 M guanidine hydrochloride. Voeg een half volume (5 ml) van 25 mM Tris buffer, pH 9,0 en DTT tot een uiteindelijke concentration van 10 mM. Krachtig mengen oplossing op een vortex mixer nacht bij kamertemperatuur volledig verminderen en eiwitten denatureren.
  4. Centrifugeer de eiwitoplossing om onoplosbaar materiaal te verwijderen bij 18.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Na de spin, breng het supernatant naar een nieuwe buis en plaats de buis op ijs.
  5. Bereid vier volumes (60 ml) van hervouwingsbuffer (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cystine, 3,0 mM cysteine, 1 mM EDTA). Ontgas de hervouwingsbuffer. Bereid ook 600 ul 10 mM retinol in ethanol bij weinig rood licht. Hou het in het donker op het ijs. Zowel de hervouwingsbuffer en retinol oplossing moet vers worden bereid.
  6. Koel zowel de eiwitoplossing en het hervouwingsbuffer op ijs gedurende ten minste 30 minuten. Hogere temperaturen vermindert waarschijnlijk de kwaliteit van de opnieuw gevouwen RBP. Voeg 1 ml hervouwingsbuffer druppelsgewijs en 10 pi oplossing retinol beurt terwijl eiwitoplossing wordt krachtig gemengd in een bekerglas op ijs. Herhaal deze stap totdat alle hervouwingsbuffer en retinoltoegevoegd. Blijf roeren de reactie op ijs in het donker gedurende 5 uur.
  7. Spin down de hervouwingsreactie bij 24.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Het is essentieel om de aggregaten te verwijderen direct na de hervouwingsreactie.
  8. Concentreer de bovenstaande vloeistof met Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) tot ongeveer 10 ml. Laat me niet concentreren de gevouwen oplossing meer dan dit niveau. Concentratie teveel leidt tot eiwitaggregatie en verlaagt de uiteindelijke opbrengst en kwaliteit van correct gevouwen RBP. Verdun het geconcentreerde monster met koude PBS tot 100 ml. Het doel van deze stap is om de componenten te verwijderen in het hervouwingsreactie die interfereren met nikkel zuivering.
  9. Draai de oplossing een keer bij 24.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Het is belangrijk verwijderen neerslag. Breng de bovenstaande twee buizen van 50 ml, die elk 1 ml Ni-NTA slurry die is gewassen met PBS. Draai de buizen bij 4 ° C gedurende een uur. Incuberen verdunde oplossing fof 1 uur kunnen de precipitatie van verkeerd gevouwen eiwitten die moeten worden verwijderd.
  10. Spin down de buizen bij 500 xg gedurende 3 minuten. Verwijder voorzichtig supernatant. Alles wat drijvende moeten worden verwijderd. Voeg koud PBS tot 30 ml per buis. Spin opnieuw en verwijder het supernatant. Herhaal dit proces totdat u niets anders dan kralen in de buis.
  11. Breng de Ni-NTA hars naar een lege kolom. Wassen hars met 20 kolomvolumes van 10 mM imidazool, 500 mM NaCl in PBS. Elueren His-RBP in 5 kolomvolumes van 100 mM imidazool in PBS. Kan deze oplossing niet voor langere tijd, en bevriezing vermindert de uiteindelijke opbrengst en kwaliteit. Voor het beste resultaat, RBP onmiddellijk te zuiveren met behulp van HPLC.
  12. Dialyseer His-RBP gezuiverd uit de Ni-NTA hars tegen 25 mM Tris, pH 8,4, en 120 mM NaCl. Een concentrator kan ook worden gebruikt voor bufferuitwisseling. Clear monsters voor HPLC door centrifugeren bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C vlak voor elke run.
  13. Zuiveren holo-RBP op HPLC met een ionuitwisselende kolom AX-300 door een NaCl stapgradiënt (220 mM 12 min, 360 mM 15 min en 1000 mM 15 min) met 25 mM Tris, pH 8,4 als mobiele fase bij 1 ml / min. Zoals NaCl concentratie stijgt, wordt holo-His-RBP losgelaten en apo-RBP en verkeerd gevouwen RBP blijven gebonden aan de kolom (Figuur 1). Als RBP hervouwing niet optimaal gebeurt, verkeerd gevouwen RBP (bijv. verkeerd gevouwen RBP-I in figuur 1) kan het gehele preparaat overheersen.
  14. Herstel de correct gevouwen holo-RBP van de piekfracties bij 360 mM NaCl. Nauwgezet toezien op de elutieprofiel van correct gevouwen en verkeerd gevouwen His-RBP. Bij 1.000 mM NaCl, het grootste deel van verkeerd gevouwen His-RBP moeten worden vrijgegeven.
  15. Fracties die holo-RBP worden samengevoegd, geconcentreerd en gedialyseerd tegen PBS gedurende de nacht bij 4 ° C. Controleer de uiteindelijke opbrengst en kwaliteit (330 nm/280 nm) door spectrofotometer. Correct gevouwen product moet een 330 nm/280 nm-verhouding van iets meer dan 1 (figuur 1).
  16. Om de productiviteit tee apo-RBP, een gelijk volume van het gezuiverde heptaan holo-RBP en meng door het roteren overnacht bij 4 ° C. Centrifugeer bij 16.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C voorzichtig onder waterfase naar een nieuwe buis (vermijden van het neerslag bij de interface). Herhaal dit proces driemaal met een 3 uur incubatie voor elke. Controleer absorptie op een NanoDrop spectrofotometer te zorgen dat de 330 nm piek is gedaald tot het achtergrondniveau.

2. Real-time monitoring van STRA6-gekatalyseerde Retinol Release and Retinol Laden

  1. Blokkeren zwarte 96-well plaat Microfluor-2 (Thermo Scientific) met 200 ul van Blocker Caseïne (Pierce) gedurende de nacht bij 4 ° C om niet-specifieke aanhechting van holo-RBP de plastic voorkomen. Blocker Caseïne geeft de beste blokkerend effect van alle blokkerende oplossingen we getest.
  2. Membranen vers bereid uit cellen die STRA6 of controle cellen gewassen met PBS en geleid door een Hamilton spuit (GastiGHT # 1710) 6 keer om een ​​uniforme suspensie in PBS produceren. We gebruiken meestal membranen afkomstig van 1/100 tot 1/20 van cellen gekweekt op een 100 mm schaal per reactie.
  3. Ze wast de beklede putjes van Microfluor-2 plaat met 200 ul PBS. Koel de plaat op ijs voor toevoeging van membraansuspensie (50 ul per putje).
  4. Real-time monitoring van retinol fluorescentie wordt gemeten met behulp van fluorescentie optiek van de Polarstar Omega (BMG Labtech) met de excitatiefilter 320ex en de emissie filter 460-10. Het programma is ingesteld op de Endpoint leesmodus. De plaat kan ook worden gebruikt om een ​​tijdverloop te meten als de tijdsintervallen niet veranderd. Het signaal van elk tijdstip is het gemiddelde van 10 metingen (orbitaal middeling met een diameter van 2 mm) en de versterking is ingesteld op 1.800. De plaat wordt geschud gedurende 10 sec bij 500 rpm met behulp van dubbele-orbitale schudden vóór elke meting.
  5. Om de retinol afgifte test start, worden de putten te lezen een keer met de Endpoint lezen mode vóór holo-RBP (typisch 1 uM uiteindelijke concentratie) toegevoegd bij 0 minuten. Zodra holo-RBP wordt toegevoegd, wordt de reactie gevolgd continu om 5-10 min gedurende 1-3 uur. De retinol loading assay, all-trans retinol (typisch 1 uM eindconcentratie) beginnen wordt toegevoegd aan de wells bij weinig rood licht. De plaat wordt een keer lezen voordat apo-RBP wordt toegevoegd bij 0 minuten. Zodra apo-RBP wordt toegevoegd, wordt de reactie gevolgd continu om 5-10 min gedurende 1-3 uur.
  6. Nadat alle metingen worden uitgevoerd, download de ruwe data (voorbeeld in Figuur 2) uit de Omega Data-analyse software (BMG Labtech) naar Microsoft Excel voor data-analyse. Elk tijdstip genereert een bestand dat de lezingen van alle experimentele omstandigheden bevat. Bijvoorbeeld, als er 20 tijdstippen consolideren 20 bestanden in een Excel bestand voor gegevensanalyse.
  7. Voor gegevensanalyse worden de fluorescentiesignalen vóór de toevoeging van retinol of holo-RBP min bij 0 beschouwd achtergrondsignalen eend afgetrokken van de uiteindelijke fluorescentiesignalen op alle tijdstippen. Hoewel de achtergrond signalen laag vergeleken met retinol fluorescentie in holo-RBP, aftrekken van de achtergrond elimineert de niet-specifieke invloed van lichtverstrooiing door de membranen en maakt het mogelijk te concentreren op de retinol fluorescentie van holo-RBP of retinol bij 0 min.

3. Real-time monitoring van STRA6-gekatalyseerde Transport van Retinol Van Holo-RBP om CRBP-I

  1. Retinol-EGFP een nieuwe fluorescentieresonantie (FRET) paar dat onlangs is aangetoond 41. STRA6-gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om EGFP-CRBP-I wordt in real-time door het meten van retinol-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I fusieproteïne met 6xHis tag (EGFP-CRBP-I) wordt geproduceerd in zoogdiercellen en gezuiverd op Ni-NTA hars voor het experiment. EGFP-CRBP-I kan worden opgeslagen in PBS met proteaseremmers voor een korte tijd bij 4 ° C. Ook de fusie-eiwit is bevroren -80 ° C in kleine porties.
  2. Voor de reacties Bereid een geblokkeerde Microfluor-2 plaat en membranen zoals hierboven beschreven. Ze wast de beklede putjes van Microfluor-2 plaat met 200 ul PBS vóór de toevoeging van membraansuspensie (50 ul per putje).
  3. Real-time retinol-EGFP FRET wordt gemeten met behulp van Polarstar Omega met de excitatiefilter 320ex en de emissie filters 460-10-en 510-10 met behulp van gelijktijdige duel emissie fluorescentie optiek. Het programma is ingesteld op de Endpoint leesmodus. De plaat kan ook worden gebruikt om een ​​tijdverloop te meten als de tijdsintervallen niet veranderd. Het signaal van elk tijdstip is het gemiddelde van 10 metingen (orbitaal middeling met een diameter van 2 mm) en de versterking is ingesteld op 1.800 per kanaal. De plaat wordt geschud gedurende 10 sec bij 500 rpm met behulp van dubbele-orbitale schudden vóór elke meting.
  4. De reacties, EGFP-CRBP-I (typisch 1 uM eindconcentratie) beginnen wordt toegevoegd aan de wells. De plaat wordt afgelezen opce met behulp van de Endpoint leesmodus voor holo-RBP wordt toegevoegd bij 0 minuten. Zodra holo-RBP is toegevoegd, wordt de reactie continu gecontroleerd door meting elke 5-10 min voor 1-2 uur.
  5. Nadat alle metingen worden uitgevoerd, download de onbewerkte data (voorbeeld in figuur 3) van de Omega Data Analysis software Microsoft Excel voor gegevensanalyse zoals hierboven beschreven.
  6. Retinol-EGFP FRET wordt berekend door de dynamische verandering in de verhouding van de acceptor / donor emissiepieken 47. De vergelijking 41 deze verhouding te berekenen is [(510 -510 t b) / (460 t -460 b)], waarbij 510 t, 510 b, 460 t en 460 vertegenwoordigen b emissie bij 510 nm na initiatie van de reactie ( t = tijdstip) wordt bij 510 nm voor retinol of holo-RBP toegevoegd (b = achtergrond) bij 460 nm na initiatie van de reactie (t = tijdstip) en bij 460 nm voor retinol of holo-RBP toegevoegd (b = achtergrond) respectievelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We stellen hier representatieve resultaten voor holo-RBP productie en zuivering door HPLC (figuur 1), real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol afgifte van holo-RBP en retinol lading in apo-RBP (Figuur 2) en real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om EGFP-CRBP-I (Figuur 3).

Zonder hervouwing, RBP geproduceerd in bacteriën bijna volledig door de aanwezigheid van veel onjuiste disulfide bindingen verkeerd gevouwen. Daarom hervouwen in aanwezigheid van de ligand retinol is van cruciaal belang voor het verkrijgen van goed gevouwen RBP. We vonden dat als de hervouwingsreactie niet correct gebeurt, verkeerd gevouwen RBP soorten (bijv. verkeerd gevouwen RBP-I in figuur 1) kan het gehele preparaat en de opbrengst van hoogwaardige holo-RBP kan zeer laag na HPLC zuivering overheersen. Daarom kan HPLC het probleem niet oplost van slechte hervouwing. Zoals getoond in (figuur 1). Hoewel gedeeltelijk verkeerd gevouwen RBP nog steeds retinol bindt, de retinol / RBP complex is veel minder stabiel, en RBP gemakkelijker los gebonden retinol. Verkeerd gevouwen RBP kan leiden tot onjuiste conclusies uit RBP of vitamine A-gerelateerde experimenten. Een ander verschil tussen correct gevouwen RBP en verkeerd gevouwen RBP dat correct gevouwen holo-RBP jaren stabiel is bij 4 ° C in PBS. Indien deholo-RBP preparaat is RBP vervuiling verkeerd gevouwen, zal onoplosbare materialen ontstaan ​​na een periode van opslag. Onoplosbare materialen kunnen worden waargenomen na de oplossing af te draaien met hoge snelheid bij 4 ° C. Apo-RBP wordt alleen geproduceerd uit hoogwaardig holo-RBP.

Eenmaal gezuiverd hoogwaardige holo-RBP of apo-RBP beschikbaar is, kan het worden gebruikt om STRA6 gekatalyseerde retinol transport bestuderen. Zowel de real-time retinol afgifte test en retinol belasting test hangt af van de controle retinol fluorescentie. Een bron van kunstmatige afname van retinol fluorescentie is de aspecifieke binding van RBP de plastic schaaltje (RBP eenmaal is gebonden aan de plastic wand, niet meer kan worden gemeten in oplossing). We hebben getest vele blokkeren voorwaarden en vond dat Blocker Caseïne (Pierce) is het meest effectief in het verminderen van deze niet-specifieke en receptor-onafhankelijke daling van retinol fluorescentie. Een andere bron van kunstmatige afname van retinol fluorescentie is slechte kwaliteit van de RBP, zoals besprokenhierboven.

STRA6 gekatalyseerde retinol release, retinol laden en retinol transport relatief langzaam gebeurtenissen zoals in de representatieve gegevens in figuren 2 en 3. De reacties zijn relatief langzaam omdat elke RBP enkel bindt een molecuul vitamine A en alle STRA6 gekatalyseerde reacties afhankelijk van zowel RBP binding en dissociatie RBP blijven. Voor STRA6-gekatalyseerde retinol release-reactie om verder te gaan, kan holo-RBP binden na apo-RBP distantieert. Voor STRA6-gekatalyseerde retinol laden reactie om verder te gaan, kan apo-RBP binden na holo-RBP distantieert. Voor de real-time monitoring technieken hier beschreven, vonden we dat het ideale meetfrequentie is een meting elke 5 min of 10 min. Hoewel vaker metingen hogere temporele resolutie, zal de resulterende gegevensbestanden zeer groot zijn omdat elk tijdstip een Excel bestand.

Figuur 1 tent-width = "5.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1.jpg" />
Figuur 1. Zuivering van hervouwen RBP op HPLC met holo-RBP 100% geladen met retinol verkrijgen. Nikkel hars gezuiverd hervouwen RBP wordt op ionuitwisselkolom AX-300 door een NaCl stapgradiënt (220 mM 10 min, 360 mM 15 min en 1000 mM 15 min). De correct gevouwen holo-His-RBP vrijkomt en geëlueerd bij 360 nM NaCl. Absorptiespectra (250 nm-400 nm) van de pieken die overeenkomen met correct gevouwen holo-RBP, verkeerd gevouwen RBP-1, verkeerd gevouwen RBP-2, en verontreinigingen worden ook getoond (eiwitpiek wordt aangegeven door een blauwe verticale lijn en retinol piek aangegeven door rode verticale lijn). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

d/50169/50169fig2.jpg "/>
Figuur 2. Real-time monitoring van STRA6-gekatalyseerde retinol laden in apo-RBP en retinol vrijlating uit de holo-RBP. Deze test speelde een belangrijke rol bij het onthullen wat STRA6 kan op zichzelf doen zonder LRAT of CRBP-IA Een voorbeeld van de ruwe data bestand voor de STRA6-catalzyed retinol laden en retinol versie zoals op de Omega Data-analyse software. Om de retinol release-reactie initiëren, wordt holo-RBP toegevoegd aan STRA6 membraan of controle membraan bij 0 minuten. Om de retinol laden reactie te initiëren, wordt retinol toegevoegd aan STRA6 membraan of controle membraan voorgemengd met apo-RBP op 0 minuten. Fluorescentiemetingen voor 320 nm excitatie en 460 nm emissie blijkt het tijdsverloop van de reacties. Reacties 1-6 beeldscherm retinol vullen van de apo-RBP (1, 3, en 5 STRA6 reactie, 2, 4 en 6 zijn controle reacties). Reacties 7-12 beeldscherm retinol vullen van de apo-RBP (7, 9 en 11 zijn STRA6 reactie, 8, 10, en 12 controlereacties). B. De uiteindelijke berekende signalen voor reacties getoond in A. De linker grafiek werd berekend op basis van reacties 1 tot 6. De rechter grafiek werd berekend op basis van reacties 7 tot 12. De hoogste fluorescentiesignaal is gedefinieerd als 1 in het linker grafiek. De fluorescentie van holo-RBP bij 0 min is gedefinieerd als 1 in de grafiek rechts. Klik hier om groter bedrag bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. Real-time monitoring van STRA6-gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om CRBP-IA Een voorbeeld van de ruwe data bestand dat bewaakt de FRET tussen retinol en EGFP zoals aangegeven op de Omega Data-analyse software. Bij 0 min wordt holo-RBP toegevoegd aan de reacties die STRA6 membraan (reacties 1, 3 en 5) of controle membraan met EGFP-CRBP-I de reacties (reacties 2, 4 en 6) te leiden. Gelijktijdige duel emissiemetingen voor excitatie bij 320 nm bleek de groene trace als de 460-10-emissie tijdsverloop en de blauwe trace als de 510-10-emissie tijdsverloop. B. De uiteindelijke berekende FRET signalen voor reacties getoond in A. De FRET signalen werden berekend volgens de methoden in stap 3.6. Klik hier om groter bedrag bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We delen hier een geoptimaliseerde RBP productieprotocol omdat RBP productie en zuivering procedures zijn cruciaal voor het genereren van correct gevouwen RBP. Gezien de mogelijkheid van verkeerd gevouwen RBP soorten en de aanwezigheid van sporen van bacteriële eiwitten zelfs HPLC gezuiverde bacteriën geproduceerde RBP, is het nuttig om natieve RBP gebruik van serum tot een conclusie met betrekking tot RBP bevestigen. Urine RBP, dat commercieel verkrijgbaar is, is een complex mengsel van vele soorten waaronder RBP apo-RBP en holo-RBP 48,49.

De real-time monitoring technieken hier beschreven zijn gebaseerd op de intrinsieke fluorescentie van retinol. De oorspronkelijke impuls te geven aan deze testen te ontwikkelen was dat we werden beperkt door de informatie die kan worden onthuld door de klassieke radioactieve assays en HPLC-gebaseerde testen. Zo vonden we dat STRA6 weinig vitamine A opname-activiteit door zelf in vitamine A opname testen, maar we kunnen niet gemakkelijk verklaren de lage activiteit van STRA6 aan vitamine A opname zonder LRAT of CRBP-I 41. In retinyl ester gebaseerde testen, is gemakkelijk te begrijpen dat STRA6 op zichzelf niet retinyl ester maken omdat STRA6 geen enzym dat LRAT activiteit. Zelfs in retinol-gebaseerde testen STRA6 nog weinig activiteit zelf. Heeft STRA6 geen vitamine A-opname-activiteit op alle? Als dit niet gebeurt, hoe kan CRBP-I of LRAT versnellen de activiteit? Als dat zo is, waarom het nodig CRBP-I of LRAT? Hoewel radioactief assays en HPLC-gebaseerde testen gaf geen antwoord op deze vragen, redeneerden we dat STRA6 moet de mogelijkheid hebben retinol los te maken van RBP hebben. We redeneerden dat ook een retinol fluorescentie assay zou deze activiteit zien. Retinol fluorescentiemeting heeft het mogelijk gemaakt om de vrije beweging van retinol in vertebrate fotoreceptorcellen studeren na licht bleken van visuele pigmenten in real time 50,51. Hoe kan RBP-receptor-activiteit worden gecontroleerd door het meten van retinol fluorescentie? Het werd ontdekt inbegin 1970 door twee onderzoeksgroepen die retinol drastisch is fluorescentie versterkt wanneer gebonden aan RBP 52,53. We vonden dat STRA6 gekatalyseerde retinol afgifte van holo-RBP een afname in fluorescentie veroorzaakt retinol, terwijl STRA6 gekatalyseerde retinol vullen van de apo-RBP veroorzaakt een toename in fluorescentie retinol. Hoewel radioactieve assays en HPLC-gebaseerde testen zijn uitgebreid gebruikt voor het onderzoeken vitamine A opname had fluorescentie assays niet gebruikt om de RBP receptor activiteit te bestuderen tot voor kort, waarschijnlijk omdat het endogene membranen gebruikt als de bron van de receptor zeer hoge achtergrondfluorescentie en een complex mengsel van retinoïde bindende eiwitten / enzymen dat het moeilijk te interpreteren de bijdrage van elk eiwit. De momenteel beschikbare gevoelige instrumenten zijn ook wat maken deze technieken meer haalbaar. Naast directe fluorescentiemeting de nieuwe retinol-EGFP FRET-paar 41 gekoppeld met gelijktijdige emissie duel opticamaakt het mogelijk retinol transport te bestuderen aan bindingseiwitten retinol in real time en in meerdere reacties tegelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Ondersteund door National Institutes of Health subsidie ​​R01EY018144.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Tags

Biochemie moleculaire biologie genetica celbiologie anatomie fysiologie Oogheelkunde Proteomics eiwitten membraan transport proteïnen vitamine A retinoïde RBP complex membraan transport membraan receptor STRA6 retinol bindend eiwit
Real-time analyses van Retinol Vervoer door de membraan receptor van Plasma Retinol bindend eiwit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H.… More

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter