Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Published: January 28, 2013 doi: 10.3791/50169
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Hier beschreiben wir eine optimierte Technik zur hochwertigen Vitamin A / RBP komplex und zwei Echtzeit-Monitoring-Techniken zu studieren Vitamin-A-Transport durch Stra6 die RBP-Rezeptor produzieren.

Abstract

Vitamin A ist für das Sehen wichtig und das Wachstum / Differenzierung von fast allen menschlichen Organen. Plasma Retinol bindendes Protein (RBP) ist das Prinzip und spezielle Träger von Vitamin A im Blut. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Holo-RBP und zwei Echtzeitüberwachung Techniken, um den Transport von Vitamin A durch den hochaffinen Rezeptor RBP Stra6 studieren. Die erste Technik ist es möglich, eine große Menge an qualitativ hochwertigen Holo-RBP (100% mit Retinol-loaded) für Vitamin A Transport-Assays zu erzeugen. Hochwertige RBP ist essentiell für funktionelle Assays, weil fehlgefaltete RBP Versionen Vitamin A leicht und bakterielle Kontamination in RBP Vorbereitung kann Artefakte verursachen. Echtzeit-Überwachung Techniken wie Elektrophysiologie wurden kritische Beiträge zu den Untersuchungen von Membran-Transport gemacht. Die RBP rezeptorvermittelte Retinol Transport nicht in Echtzeit bis vor kurzem wurden analysiert. Der zweite hier beschriebene Technik ist der Grundl-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Freisetzung oder loading. Die dritte Technik ist die Echtzeit-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP, um zelluläre Retinol bindendes Protein I (CRBP-I). Diese Techniken bieten eine hohe Empfindlichkeit und Auflösung bei der Aufdeckung RBP Rezeptors Vitamin A-Aufnahme-Mechanismus.

Introduction

Vitamin A ist ein organisches Molekül, das essentiell für das Überleben der Menschheit und das reibungslose Funktionieren fast aller menschlichen Organen. Vitamin A-Derivate (Retinoide) in verschiedenen biochemischen und zellulären Ereignisse, einschließlich der Erfassung von Licht zum Sehen 1,2 und der Regulation der Genexpression und Proteintranslation während der Embryonalentwicklung und in adulten Geweben 3-6 teilzunehmen. Obwohl Retinol hat die Fähigkeit, systemisch diffundieren, kam Evolution mit Plasma Retinol bindendes Protein, ein spezifischer Trägerprotein für Vitamin A im Blut eine hohe Effizienz und Spezifität zu erreichen und Toxizität mit zufälligen Diffusion 7-10 einhergehen, zu vermeiden. Ein Rezeptor mit hoher Affinität, die RBP bindet und nimmt Vitamin A wurde in den 1970er Jahren 11-13 vermutet. Trotz Beweise in drei Jahrzehnten von der Existenz des RBP-Rezeptor 14-31 angesammelt, wurde der Rezeptor-Hypothese seit vielen Jahren aufgrund der existenc diskutierte einer falschen Definition von Holo-RBP. Die korrekte Definition von Holo-RBP ist, dass es die hohe Affinität 1:1-Komplex aus Retinol und RBP ist. Wiederholte Extraktion von Holo-RBP durch organische Lösungsmittel ist notwendig, um apo-RBP produzieren. Diese Definition wird von fast allen Labors studieren RBP 7,9,32-35 oder die RBP-Rezeptor 14-31,36-42 verwendet. Die falsche Definition von Holo-RBP, die verwendet werden, um die Existenz der RBP-Rezeptor zu widerlegen wurde, ist die akute Mischung aus freien Retinol mit apo-RBP. Da die Funktion des Rezeptors in RBP Vitamin A Aufnahme von Holo-RBP ist Retinol von Holo-RBP freisetzen würde die RBP-Rezeptor keine Rolle spielen, wenn Retinol Aufnahme Retinol frei zu beginnen (wie durch die falsche Definition von Holo vorgeschlagen -RBP).

Die jüngste Identifizierung von RBP Rezeptors als multitransmembrane Domain Protein namens STRA636 und seine Funktion in Vitamin A-Aufnahme von Holo-RBP 36-43 dringend spricht gegen die Hypothese, dass RBP nichtbenötigen einen Rezeptor an Vitamin A. Detaillierte Analysen zeigten, dass Stra6 9 Transmembrandomänen mit dem N-Terminus extrazellulär lokalisiert und C-Terminus lokalisiert intrazellulär 40 weist liefern. Das zwischen Transmembran 6 und 7 ist ein wesentlicher RBP Bindungsdomäne 39. Stra6 ist sowohl LRAT und CRBP-I in Vitamin A-Aufnahme von Holo-RBP verbunden, aber weder LRAT noch CRBP-I ist absolut für eine verbesserte Stra6 Aktivität 41 erforderlich. Stra6 Fähigkeit zu Retinol Release von Holo-RBP katalysieren ist der Schlüssel zu ihrer Vitamin-A-Aufnahme-Aktivität 41. Durch das Abstützen auf Stra6 seiner Retinol freisetzen kann Vitamin A Lieferung durch RBP transportieren Vitamin A, um Zellen in den peripheren Geweben mit hoher Spezifität und Effizienz zielen.

Die kritische Bedeutung des Holo-RBP Definition und Vorbereitung wird nicht nur durch die historische Debatte über die Existenz der RBP-Rezeptor dargestellt, sondern auch durch drei verwandten letzten Papiere auf Holo-RBP Definitionen dif Basisschiedenen von der ursprünglichen und korrekte Definition 44-46. Das erste Papier verwendet den Holo-RBP-Definition, die verwendet werden, um die Existenz der RBP-Rezeptor zur Untersuchung der RBP-Rezeptor 44 missbilligen wurde. Die zweite und dritte Papieren kam mit einer dritten Definition von Holo-RBP daß sie noch weniger wahrscheinlich Retinol untersucht werden, um eine ordnungsgemäße Anlage mit RBP 45,46 bilden. Diese Studien vorbereitet 3 H-retinol/RBP durch Mischen Holo-RBP (auch nicht apo-RBP) mit 3 H-Retinol. Da dieser Test nicht über 3 H-retinol/RBP gebildet und entfernte nicht übermäßigen freien 3 H-Retinol 45,46, es ist nicht ein Assay für 3 H-Aufnahme aus Retinol 3 H-retinol/RBP, sondern eine freie 3 H-Retinol Diffusionsassay. Es wurde zuvor daß Stra6 verbessert nicht zelluläre Aufnahme von Retinol frei von LRAT 38 oder CRBP-I 41 gezeigt. Praktisch alle Retinol zwangsläufig im Blut RBP und es keinen nachweisbaren free Retinol. Eine Hauptfunktion des RBP Rezeptor zu Retinol Release von Holo-RBP katalysieren während Retinol-Aufnahme von Holo-RBP 41. Wenn das Retinol künstlich freigesetzt wird oder in der freien Form mit 45,46 beginnen, wird die RBP-Rezeptor nicht erforderlich. Die drastisch unterschiedliche Ergebnisse aus der freien Retinol Diffusionsassay erhalten, um Tests auf richtig vorbereiteten Holo-RBP zeigen, dass die richtige Zubereitung von RBP Basis gegenüber ist entscheidend für seine funktionellen Assays.

RBP kann aus menschlichem Serum 41 gereinigt werden, aber das Verfahren ist aufwendig, und die Ausbeute ist gering. Ein alternativer Ansatz ist die RBP in E. produzieren coli. Weil E. coli nicht in der Lage, richtig zu falten Säuger sezernierten Proteinen mit mehr als einem Paar von Disulfidbindungen wie RBP, ist es wesentlich, refold Rbp und reinigen das korrekt gefaltete Protein. Falsch gefaltete Proteine ​​nicht nur anders korrigiert gefalteten RBP in verschiedenen Tests verhalten,aber auch dazu führen, Proteinaggregation während der Lagerung. Aus dem gleichen Grund wird apo-RBP nur aus hochwertigem Holo-RBP hergestellt. Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll zur Herstellung von hochwertigen RBP 100% mit Retinol durch bakterielle Expression, Rückfaltung und HPLC-Reinigung geladen. HPLC-Reinigung entfernt nicht nur falsch gefaltete RBP aber auch erhebliche bakterielle Kontamination, die schwere Artefakte verursachen kann, wenn RBP in der Signaltransduktion Assays verwendet wird. Wir beschreiben auch zwei empfindliche Echtzeit-Monitoring-Techniken zu Retinol Transport per Stra6 studieren. Beide Techniken sind abhängig von hoher Qualität RBP. Aus Platzgründen werden die klassischen Techniken der radioaktiven Retinoid-basierten und HPLC-basierte Vitamin-A-Aufnahme-Assays werden hier nicht beschrieben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ein. Produktion, Rückfaltung und HPLC Aufreinigung von Holo-RBP

  1. Transformieren BL-21cells mit dem pET3a Vektor beherbergen die cDNA für humanes RBP mit 6x His-Tag am N-Terminus. Wachsen die transformierten BL-21-Zellen in einem Schüttler bei 37 ° C in 40 ml LB-Medium mit Carbenicillin bis OD bei 600 nm erreicht, 0.5. Induzieren RBP Proteinexpression durch Zugabe von IPTG bis 1 mM. Wachsen die Bakterien bei 37 ° C weitere 5 Stunden.
  2. RBP in E.coli produziert wird meist in unlöslichen Einschlusskörpern. Um Einschlusskörper, Pellet-Zellen bei 10.000 × g für 20 min anzureichern. Dann beschallen die Zellen auf Eis in 5 ml PBS mit Protease-Inhibitoren, durch zwei Zyklen von Gefrieren und Auftauen, gefolgt. Pellet nach unten die Einschlusskörper bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und halten Sie die Pellets auf Eis.
  3. Solubilisierung des inclusion body Pellet durch Beschallung in 10 ml 7,5 M Guanidinhydrochlorid. Hinzufügen eines Hälfte des Volumens (5 ml) von 25 mM Tris-Puffer, pH 9,0 und DTT zu einer endgültigen concentration von 10 mM. Kräftig mischen Lösung auf einem Vortex-Mischer über Nacht bei Raumtemperatur vollständig zu reduzieren und zu denaturieren Proteine.
  4. Zentrifugieren der Proteinlösung, um unlösliches Material zu entfernen bei 18.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Nach dem Spin, den Überstand in ein neues Röhrchen und das Reagenzglas auf Eis.
  5. Planen vier Volumina (60 ml) von Rückfaltungspuffer (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM Cystin, 3,0 mM Cystein, 1 mM EDTA). Entgasen Rückfaltungspuffer. Bereiten auch 600 ul 10 mM Retinol in Ethanol unter dim rotes Licht. Halten Sie es im Dunkeln auf Eis. Sowohl die Rückfaltungspuffer und Retinol-Lösung müssen frisch zubereitet.
  6. Abkühlen sowohl die Proteinlösung und die Rückfaltungspuffer auf Eis für mindestens 30 min. Höhere Temperaturen wahrscheinlich reduziert die Qualität der rückgefaltet RBP. 1 ml Rückfaltungspuffer zugetropft und 10 ul Retinol Lösung wiederum während Proteinlösung wird kräftig in einem Becherglas auf Eis gemischt. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Rückfaltungspuffer und Retinolzugegeben. Halten Rühren der Reaktionsflüssigkeit auf Eis im Dunkeln für 5 Stunden.
  7. Abzentrifugieren der Neufaltungsreaktion bei 24.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Es ist wesentlich, um die Aggregate direkt nach dem Neufaltungsreaktion entfernen.
  8. Konzentrieren die überstehende Lösung mittels Amicon Ultra 15 Konzentrator (MWCO 10 K) bis etwa 10 ml beträgt. Nicht konzentrieren die rückgefaltet Lösung mehr als dieser Ebene. Konzentrieren zu viel wird, um Proteinaggregation führen und senkt die endgültige Ausbeute und Qualität des korrekt gefalteten RBP. Verdünnen der konzentrierten Probe mit kaltem PBS auf 100 ml. Der Zweck dieses Schrittes ist es, die Komponenten in dem Neufaltungsreaktion, die mit Nickel stören Reinigung entfernen.
  9. Drehe den Lösung noch einmal bei 24.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Es ist wichtig, einen Niederschlag zu entfernen. Den Überstand in zwei 50 ml Röhrchen, die jeweils 1 ml Ni-NTA Gülle, die mit PBS gewaschen wurde. Drehen werden die Röhrchen bei 4 ° C für eine Stunde. Inkubation verdünnte Lösung foder 1 h kann das Ausfällen von fehlgefalteten Proteinen, die entfernt werden müssen.
  10. Spin down die Röhrchen bei 500 xg für 3 min. Überstand entfernen vorsichtig. Alles floating entfernt werden sollte. Kaltes PBS auf 30 ml für jede Röhre. Spin wieder und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie nichts Beads im Röhrchen zu sehen.
  11. Übertragen der Ni-NTA-Harz in einen leeren Spalte. Waschen Harz mit 20 Säulenvolumina 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl in PBS. Eluieren His-RBP in 5 Säulenvolumen 100 mM Imidazol in PBS. Nicht speichern diese Lösung über einen längeren Zeitraum, und Einfrieren verringert die endgültige Ausbeute und Qualität. Für das beste Ergebnis, reinigen RBP mittels HPLC sofort.
  12. Dialysieren His-RBP von der Ni-NTA-Harz gegen 25 mM Tris, pH 8,4, und 120 mM NaCl gereinigt. Ein Konzentrator kann auch für Puffer-Wechsels benutzt. Klare Proben für die HPLC durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C direkt vor jedem Durchlauf.
  13. Entschlacken Holo-RBP auf HPLC unter Verwendung einer Ionen-Austauschkolonne AX-300 durch einen NaCl-Stufengradienten (220 mM 12 min, 360 mM 15 min und 1000 mM 15 min) unter Verwendung von 25 mM Tris, pH 8,4 als mobile Phase mit 1 ml / min. Als NaCl-Konzentration ansteigt, wird Holo-His-RBP während apo-RBP freigegeben und fehlgefaltete RBP bleiben an die Säule gebunden (Abbildung 1). Wenn RBP Rückfaltung nicht getan ist optimal, fehlgefaltete RBP (zB fehlgefaltete RBP-I in Abbildung 1) kann die ganze Vorbereitung überwiegen.
  14. Wiederherstellen der korrekt gefalteten Holo-RBP aus den Peak-Fraktionen bei 360 mM NaCl. Sorgfältig überwachen das Elutionsprofil von korrekt gefalteten und fehlgefaltete His-RBP. Bei 1.000 mM NaCl, fehlgefaltete meisten His-RBP freigelassen werden sollten.
  15. Fraktionen, die Holo-RBP werden vereinigt, eingeengt, und gegen PBS über Nacht bei 4 ° C. Überprüfen Sie die endgültige Ausbeute und Qualität (330 nm/280 nm) durch Spektralphotometer. Korrekt gefalteten Produkt sollte eine 330 nm/280 nm Verhältnis etwas höher als 1 (Abbildung 1).
  16. Um die Produktivität zue apo-RBP, fügen Sie ein gleiches Volumen Heptan zu den gereinigten Holo-RBP und vorsichtig mischen durch Drehen über Nacht bei 4 ° C. Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min bei 4 ° C und vorsichtig übertragen die untere wäßrige Phase in ein neues Röhrchen (Vermeidung des Niederschlages an der Grenzfläche). Den Vorgang wiederholen, dreimal mit einer 3-stündigen Inkubation für jede. Überprüfen Absorption auf einer Nanodrop Spektralphotometer sicherstellen, dass die 330 nm Peak hat in den Hintergrund Ebene verringert.

2. Echtzeit-Überwachung der Stra6-katalysierten Retinol Release and Retinol Loading

  1. Blockieren eines schwarzen 96-Well-Microfluor-2 Platte (Thermo Scientific) mit 200 ul Blocker Casein (Pierce) über Nacht bei 4 ° C, um unspezifische Anhaften von Holo-RBP auf den Kunststoff zu vermeiden. Blocker Casein bietet die beste Sperrwirkung der alle Sperren Lösungen, die wir getestet.
  2. Membranen frisch aus Zellen, die Stra6 oder Kontrolle Zellen hergestellt werden gewaschen mit PBS und durch eine Hamilton-Spritze (Gasti übergebenght # 1710) 6 mal, um eine gleichmäßige Suspension in PBS erzeugen. Wir verwenden typischerweise Membranen von 1/100 bis 1/20 der Zellen auf einer 100 mm Schale pro Reaktion gezüchtet abgeleitet.
  3. Waschen Sie die beschichteten Wells der Microfluor-2 Platte einmal mit 200 ul PBS. Man kühlt die Platte auf Eis vor Zugabe Membransuspension (50 ul pro Vertiefung).
  4. Echtzeit-Überwachung von Retinol Fluoreszenz gemessen mittels Fluoreszenz Optik des POLARstar Omega (BMG Labtech) mit dem Anregungsfilter 320EX und dem Emissionsfilter 460-10. Das Programm wird auf dem Endpoint-Lesemodus eingestellt. Die Tafel-Modus kann auch verwendet werden, um einen zeitlichen Verlauf gemessen werden, wenn die Zeitintervalle nicht variiert. Das Signal von jedem Zeitpunkt ist der Durchschnitt von 10 Messungen (Orbital Mittelung mit einem Durchmesser von 2 mm) und die Verstärkung bei 1800 gesetzt. Die Platte wird für 10 sec bei 500 UpM mit doppelseitigem orbitalen Schütteln vor jeder Messung geschüttelt.
  5. Um die Retinol-Release-Assay zu starten, werden die Vertiefungen einmal mit dem Endpoint Lesen m lesenode vor Holo-RBP (typischerweise 1 pM Endkonzentration) bei 0 min zugegeben. Sobald Holo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich alle 5-10 min für 1-3 Stunden überwacht. Um das Retinol Belastung Assay, all-trans-Retinol (typischerweise 1 uM Endkonzentration) gestartet wird den Brunnen unter dim rotes Licht aufgenommen. Die Platte wird einmal vor apo-RBP bei 0 min zugegeben wird gelesen. Sobald apo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich alle 5-10 min für 1-3 Stunden überwacht.
  6. Nachdem alle Messungen durchgeführt werden, laden Sie die Rohdaten (Beispiel in Abbildung 2 gezeigt) aus dem Omega Data Analysis Software (BMG Labtech) in Microsoft Excel für die Datenanalyse. Jeder Zeitpunkt erzeugt eine Datei, die die Messwerte aller experimentellen Bedingungen enthält. Zum Beispiel, wenn es 20 Zeitpunkte sind, zu festigen 20 Dateien in eine Excel-Datei für die Datenanalyse.
  7. Zur Datenanalyse, werden die Fluoreszenzsignale vor der Zugabe von Retinol oder Holo-RBP bei 0 min als ein Hintergrundsignaled subtrahiert von den endgültigen Fluoreszenzsignale zu allen Zeitpunkten. Obwohl die Hintergrundsignale niedrig zu Retinol Fluoreszenz in Holo-RBP verglichen werden, Subtrahieren der Hintergrund eliminiert den Einfluss der unspezifischen Lichtstreuung durch die Membranen und macht es möglich, auf der Fluoreszenz von Retinol Holo-RBP oder Retinol hinzugefügt bei 0 min konzentrieren.

3. Echtzeit-Überwachung der Stra6-katalysierten Transport von Retinol Von Holo-RBP um CRBP-I

  1. Retinol-EGFP ist eine neue Fluoreszenz-Resonanz-Transfer (FRET)-Paar, das vor kurzem 41 gegründet. Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP an EGFP-CRBP-I wird in Echtzeit durch Messung Retinol-EGFP überwacht FRET. EGFP-CRBP-I-Fusionsprotein mit 6 × His-Tag (EGFP-CRBP-I) in Säugetierzellen hergestellt und wird auf Ni-NTA-Harz vor dem Experiment gereinigt. EGFP-CRBP-I kann in PBS mit Proteaseinhibitoren für eine kurze Zeit bei 4 ° C gelagert Alternativ kann das Fusionsprotein is in 80 ° C in kleinen Aliquots eingefroren.
  2. Vor den Reaktionen, bereiten eine blockierte Microfluor-2 Platte und Membranen wie oben beschrieben. Waschen der beschichteten Wells der Platte Microfluor-2 einmal mit 200 ul PBS vor der Zugabe von Membransuspension (50 ul pro Vertiefung).
  3. Real-time Retinol-EGFP FRET gemessen mit POLARstar Omega mit dem Anregungsfilter 320EX und den Emissionsfilter 460-10 und 510-10 mit gleichzeitiger Duell Emissionsfluoreszenz Optik. Das Programm wird auf dem Endpoint-Lesemodus eingestellt. Die Tafel-Modus kann auch verwendet werden, um einen zeitlichen Verlauf gemessen werden, wenn die Zeitintervalle nicht variiert. Das Signal von jedem Zeitpunkt ist der Durchschnitt von 10 Messungen (Orbital Mittelung mit einem Durchmesser von 2 mm) und die Verstärkung bei 1800 pro Kanal. Die Platte wird für 10 sec bei 500 UpM mit doppelseitigem orbitalen Schütteln vor jeder Messung geschüttelt.
  4. Die Reaktionen, EGFP-CRBP-I (typischerweise 1 pM Endkonzentration) gestartet wird zu den Vertiefungen zugegeben. Die Platte wird auf Lesence mit dem Endpoint-Lesemodus, bevor Holo-RBP wird bei 0 min zugegeben. Sobald Holo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich durch Messung überwacht jeden 5-10 min für 1-2 Stunden.
  5. Nachdem alle Messungen durchgeführt werden, laden Sie die Rohdaten (Beispiel in Abbildung 3 dargestellt) aus der Omega Data Analysis Software an Microsoft Excel zur Datenanalyse wie oben beschrieben.
  6. Retinol-EGFP FRET wird durch die dynamische Änderung im Verhältnis der Akzeptor / Donor Emissionspeaks 47 berechnet. Die Gleichung 41, um dieses Verhältnis zu berechnen ist [(510 -510 t b) / (-460 460 t b)], worin T 510, 510 b, 460 t und 460 b repräsentieren Emissionen bei 510 nm nach der Initiierung der Reaktion ( t = Zeitpunkt), wird bei 510 nm vor Retinol oder Holo-RBP zugegeben (b = Hintergrund), bei 460 nm nach der Initiierung der Reaktion (t = Zeitpunkt), und bei 460 nm vor Retinol oder Holo-RBP angefügt (b = Hintergrund), jeweils.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wir stellen Ihnen hier repräsentative Ergebnisse für Holo-RBP Produktion und Reinigung durch HPLC (Abbildung 1), Echtzeit-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Release von Holo-RBP und Retinol Laden in apo-RBP (Abbildung 2) und Echtzeit-Analyse Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP an EGFP-CRBP-I (Abbildung 3).

Ohne Rückfaltung, hergestellt RBP in Bakterien fast vollständig fehlgefaltete aufgrund der Anwesenheit von vielen falschen Disulfidbindungen. Daher Rückfaltungsstufe in Gegenwart des Liganden Retinol ist von entscheidender Bedeutung bei der Erlangung gut gefaltete RBP. Wir fanden, dass, wenn die Neufaltungsreaktion nicht korrekt ausgeführt wird, fehlgefaltete RBP Spezies (zB fehlgefaltete RBP-I in Figur 1) kann die gesamte Vorbereitung und die Ausbeute an hochwertigen Holo-RBP sehr niedrig sein kann nach HPLC-Reinigung überwiegen. Daher kann HPLC nicht beheben das Problem der schlechten Rückfaltung. Wie in gezeigt, (Abb. 1) ist. Obwohl teilweise fehlgefaltete RBP noch bindet Retinol, ist das Retinol / RBP komplexe viel weniger stabil und RBP leichter löst gebunden Retinol. Fehlgefaltete RBP kann zu falschen Schlussfolgerungen aus RBP oder Vitamin A-ähnlichen Experimenten führen. Ein weiterer Unterschied zwischen korrekt gefalteten RBP und fehlgefaltete RBP ist, dass korrekt gefalteten Holo-RBP ist seit Jahren stabil bei 4 ° C in PBS. Wenn derHolo-RBP Zubereitung wurde RBP Kontamination fehlgefaltete werden unlösliche Materialien nach einer Zeit der Lagerung entstehen. Unlösliche Materialien kann nach Stillstand der Lösung bei hoher Geschwindigkeit bei 4 ° C beobachtet werden Apo-RBP wird nur aus hochwertigen Holo-RBP produziert.

Einmal gereinigt hochwertige Holo-RBP oder Apo-RBP verfügbar ist, kann es verwendet werden, um Stra6-katalysierten Retinol Verkehrsmittel zu studieren. Sowohl die Echtzeit-Retinol und Retinol Freisetzungsassay Beladung Assay zur Überwachung Retinol Fluoreszenz ab. Eine Quelle von künstlichem Rückgang von Retinol Fluoreszenz ist die unspezifische Bindung an die RBP Plastikschale (einmal RBP zum Kunststoffwand gebunden ist, kann es nicht mehr in Lösung gemessen werden). Wir haben viele blockieren Bedingungen getestet und festgestellt, dass Blocker Casein (Pierce) am effektivsten bei der Verringerung dieses unspezifische und Rezeptor-unabhängige Rückgang von Retinol Fluoreszenz ist. Eine weitere Quelle der künstlichen Rückgang von Retinol Fluoreszenz ist schlechte Qualität des RBP, wie diskutiertoben.

Stra6 Retinol-katalysierten Freisetzung, Retinol und Retinol Beladung Transport sind relativ langsam Ereignisse, wie in den darstellenden Daten in den 2 und 3 gezeigt. Die Umsetzungen sind relativ langsam, da jede RBP bindet nur ein Molekül Vitamin A und alle Stra6 Reaktionen hängen sowohl RBP Bindung und Dissoziation RBP um fortzufahren. Für Stra6-katalysierten Retinol Freisetzungsreaktion fortsetzen, kann Holo-RBP erst nach apo-RBP distanziert binden. Für Stra6-katalysierten Retinol Belastung Reaktion auf fortfahren, können apo-RBP erst nach Holo-RBP distanziert binden. Für alle Echtzeit-Überwachung hier beschriebenen Techniken, fanden wir, dass die ideale Frequenz von Messung eine Messung alle 5 min bzw. 10 min beträgt. Obwohl häufigere Messungen höhere zeitliche Auflösung erzeugen kann, werden die resultierenden Dateien sehr groß sein, weil jeder Zeitpunkt erstellt eine Excel-Datei.

Abbildung 1 Zelt-width = "5.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1.jpg" />
Abbildung 1. Reinigung von rückgefaltet RBP auf HPLC Holo-RBP 100% mit Retinol beladen erhalten. Nickel-Harz-gereinigt rückgefalteten RBP um Ionenaustauschersäule AX-300 wird von einem NaCl-Stufengradienten (220 mM 10 min, 360 mM 15 min und 1000 mM 15 min) aufgetragen. Die korrekt gefalteten Holo-His-RBP wird freigegeben und eluiert bei 360 nM NaCl. Absorptionsspektren (250 nm-400 nm) der Peaks entspricht, korrekt gefalteten Holo-RBP, fehlgefaltete RBP-1, fehlgefaltete RBP-2, und Verunreinigung sind ebenfalls gezeigt (Proteinpeak wird von einem blauen vertikale Linie angedeutet und Retinol Peak angezeigt wird durch senkrechte rote Linie). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

d/50169/50169fig2.jpg "/>
Abbildung 2. Echtzeit-Überwachung der Stra6-katalysierten Retinol Laden in apo-RBP und Retinol Release von Holo-RBP. Dieser Assay spielte eine wichtige Rolle bei der Aufdeckung, was Stra6 können sich ohne LRAT oder CRBP-IA Ein Beispiel für die Rohdaten-Datei für den Stra6-catalzyed Retinol Laden und Retinol Release wie auf dem Omega Data Analysis Software angezeigt zu tun. Um das Retinol Freisetzungsreaktion einzuleiten, wird Holo-RBP um Stra6 Membran oder Kontrolle Membran bei 0 min aufgenommen. Um das Retinol Belastung Reaktion auszulösen, wird Retinol zu Stra6 Membran oder Kontrolle Membran mit apo-RBP bei 0 min vorgemischt aufgenommen. Fluoreszenzmessungen für 320 nm Anregung und 460 nm Emission offenbart den zeitlichen Verlauf der Reaktionen. Reaktionen 1-6 Monitor Retinol Verladung in apo-RBP (1, 3 und 5 sind Stra6 Reaktion; 2, 4 und 6 sind Kontrollreaktionen). Reaktionen 7-12 Monitor Retinol Verladung in apo-RBP (7, 9 und 11 sind Stra6 Reaktion; 8, 10, und 12 sind Kontrollreaktionen). B. Die letzten berechneten Signale für Reaktionen in A gezeigt Die linke Grafik wurde basierend auf Reaktionen 1 bis 6 berechnet. Die rechte Grafik wurde basierend auf Reaktionen von 7 bis 12 berechnet. Die höchste Fluoreszenzsignal ist als 1 im linken Diagramm definiert. Die Fluoreszenz von Holo-RBP aufgenommen bei 0 min als 1 ist in der rechten Grafik definiert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3
Abbildung 3. Echtzeit-Überwachung der Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP um CRBP-IA Ein Beispiel für die Rohdaten-Datei, die FRET zwischen Retinol und EGFP wie auf dem Omega Data Analysis Software gezeigt überwacht. Bei 0 min wird Holo-RBP den Reaktionen enthaltenden Stra6 Membran (Reaktionen 1, 3 und 5) oder Steuermembran mit zugesetztem EGFP-CRBP-I zur Initiierung der Reaktionen (Reaktionen 2, 4 und 6). Gleichzeitige Duell Emissionsmessungen zur Anregung bei 320 nm zeigte die grüne Kurve als 460-10 Emission zeitlichen Verlauf und die blaue Kurve als 510-10 Emission zeitlichen Verlauf. B. Der letzte berechnete FRET-Signale für Reaktionen in A gezeigt Das FRET-Signale gemäß den in Schritt 3.6 wurden berechnet. Hier eine größere Zahl anzuzeigen .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wir teilen hier eine optimierte RBP Produktion Protokoll, weil RBP Produktion und Reinigung Verfahren kritisch zu generieren korrekt gefaltet RBP sind. Angesichts der Möglichkeit von falsch gefalteten Spezies RBP und das Vorhandensein von Spurenmengen von bakteriellen Proteinen, auch bei HPLC gereinigten RBP bakteriell gebildete, ist es hilfreich zu nativem RBP aus Serum zu verwenden, um eine Aussage bezüglich RBP bestätigen. Urin RBP, welches kommerziell erhältlich ist, ist ein komplexes Gemisch von vielen Arten von RBP einschließlich Apo-und Holo-RBP RBP 48,49.

Die Echtzeit-Überwachung hier beschriebenen Techniken basieren auf der intrinsischen Fluoreszenz von Retinol basiert. Der ursprüngliche Impuls, diese Assays zu entwickeln war, dass wir durch die Informationen, die von den klassischen radioaktiven Assays und HPLC-basierte Assays offenbaren kann begrenzt waren. Zum Beispiel fanden wir, dass Stra6 wenig Vitamin hat eine Aufnahme-Aktivität von selbst in Vitamin-A-Aufnahme-Assays, aber wir können nicht einfach erklären die geringe Aktivität der STRA6 in Vitamin A-Aufnahme ohne LRAT oder CRBP-I 41. In Retinylester-basierten Assays, ist es leicht zu verstehen, dass Stra6 alleine nicht zu machen, weil Stra6 Retinylester ist ein Enzym, das LRAT Aktivität aufweist. Aber auch in Retinol-basierten Assays, Stra6 noch wenig Aktivität von selbst aus. Hat Stra6 irgendwelche Vitamin-A-Aufnahme-Aktivität überhaupt? Wenn dies nicht der Fall, wie kann CRBP-I oder LRAT beschleunigen ihre Tätigkeit? Wenn dies der Fall ist, warum es brauchen CRBP-I oder LRAT? Obwohl radioaktive Assays und HPLC-basierte Assays nicht beantwortet haben diese Fragen, begründete wir, dass Stra6 sollte die Fähigkeit, Retinol aus RBP lösen haben. Wir haben auch argumentiert, dass ein Retinol Fluoreszenzassay könnte diese Tätigkeit offenbaren. Retinol Fluoreszenzmessung wurde es möglich, die Bewegung des freien Retinol in Vertebraten Photorezeptorzellen nachdem Licht Bleichen von Sehpigmente in Echtzeit 50,51 studieren. Wie kann RBP-Rezeptor-Aktivität durch Messung Retinol Fluoreszenz überwacht werden? Es wurde entdeckt,Anfang der 1970er Jahre von zwei Arbeitsgruppen, dass Retinol hat sich dramatisch verbessert Fluoreszenz, wenn die RBP 52,53 gebunden. Wir fanden, dass Stra6 Retinol-katalysierten Freisetzung von Holo-RBP eine Abnahme der Fluoreszenz bewirkt, Retinol, während Stra6 Retinol-katalysierten Verladung in apo-RBP bewirkt eine Erhöhung Retinol Fluoreszenz. Obwohl radioaktiven Assays und HPLC-basierten Assays wurden ausgiebig zu studieren Vitamin-A-Aufnahme verwendet, hatte Fluoreszenzassays nicht verwendet worden, um die RBP Rezeptoraktivität bis vor kurzem studieren, wahrscheinlich weil die endogene Membranen als Quelle des Rezeptors verwendet sehr hohe Hintergrundfluoreszenz haben und ein komplexes Gemisch aus Retinoid Bindungsproteine ​​/ Enzyme, die es schwierig, den Beitrag jedes Protein interpretieren lässt. Die derzeit verfügbaren empfindliche Instrumente sind auch was machen diese Techniken mehr machbar. Neben Fluoreszenzmessung lenken, FRET die neue Retinol-EGFP Paar 41 gekoppelt mit gleichzeitiger Duell Emissions-Optikmacht es möglich, Retinol Transport studieren Bindungsproteine ​​in Echtzeit und in mehreren Reaktionen gleichzeitig Retinol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Unterstützt von den National Institutes of Health Gewährung R01EY018144.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Tags

Biochemie Molekularbiologie Genetik Zellbiologie Anatomie Physiologie Augenheilkunde Proteomics Proteine Membrane Transport Proteine Vitamin A Retinoid RBP komplex Membrantransport Membran-Rezeptor Stra6 Retinol bindendes Protein
Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H.… More

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter