Summary
हम जीवित कोशिका वीडियो माइक्रोस्कोपी के लिए विधियों का वर्णन
Protocol
1 सी.. albicans विकास और स्थितियां
- एमिनो एसिड के बिना 6.9 छ खमीर नाइट्रोजन आधार जोड़ने, 1 मिलीग्राम 1 एम NaOH, 10 मिलीलीटर 1% (w / v) adenine hemisulphate नमक और 20 ग्राम तकनीकी अग्रवाल (पहले 11 में विस्तार से वर्णित) द्वारा अनुसूचित जाति Ura अगर प्लेटें तैयार. आसुत एच 2 ओ के साथ मात्रा 900 मिलीलीटर आटोक्लेव, अगर शांत करने की अनुमति है, लेकिन करने के लिए पर्याप्त जमना, और फिर सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत 50 मिलीलीटर बाँझ 40% D-ग्लूकोज और 50 मिलीलीटर बाँझ 4% अनुसूचित जाति Ura ख़ारिज किया हुआ जोड़ नहीं है. मिक्स, पेट्री डिश में डालना और अगर प्लेट छोड़ने के लिए शांत और जमना. 5 डिग्री सेल्सियस है जब तक स्टोर का उपयोग अगर प्लेटें.
- स्ट्रीक सी. albicans एक CAI4 तनाव + ग्लिसरॉल स्टॉक से CIp10 -80 पर संग्रहीत ° SC-Ura अगर थाली पर सी सीरोटाइप.
- 30 पर थाली सेते डिग्री सेल्सियस तक कालोनियों फार्म और 5 पर दुकान डिग्री सेल्सियस
- संस्कृति एक एकल सी. 5 मिलीलीटर SC-Ura मध्यम (के रूप में 1.1, लेकिन तकनीकी अगर बिना नुस्खा) में albicans कॉलोनी और 30 पर रातोंरात सेते हैंडिग्री सेल्सियस, 200 rpm स्थिर चरण सी. उत्पन्न albicans.
2 सी.. albicans Fluorescein आइसोथियोसाइनेट का प्रयोग धुंधला (FITC)
- 10 μl सी. जोड़ें albicans 990 μl पीबीएस (7.4 पीएच) रातोंरात संस्कृति और एक सेल एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग गिनती करते हैं.
- सी. के दृश्य के लिए सहायता phagocytosis assays दौरान albicans, दाग 1 × 10 8 सी. albicans 0.05 एम कार्बोनेट, बिकारबोनिट बफर (9.6 पीएच) में अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल FITC का उपयोग कर.
- अनबाउंड FITC निकालने, सी. धो लो albicans 1 मिलीग्राम 1 x पीबीएस, अपकेंद्रित्र 3000 × छ में 5 मिनट के लिए, 1 मिलीग्राम 1 x पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली हटा दें. 3 बार दोहराएँ.
- 1 में Resuspend गोली × 10 6 कोशिकाओं / 1 x पीबीएस में μl.
3. J774.1 माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन की तैयारी
- 75 सेमी 2 ऊतक में J774.1 मैक्रोफेज रखेंDMEM मध्यम में संस्कृति बोतल 10% के साथ पूरक (v / v) भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 200 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 37 डिग्री सेल्सियस के साथ 5% सीओ 2 में 2 मिमी एल glutamine. प्राथमिक मैक्रोफेज की तैयारी कहीं विस्तार 12, 13 में वर्णित है.
- टिशू कल्चर कुप्पी से J774.1 कोशिकाओं परिमार्जन और एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब स्थानांतरण. 5 मिनट के लिए के लिए एक सेल गोली प्राप्त 600 × छ पर अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म पूरक DMEM मध्यम में निकालें. 2 मिलीलीटर में एक 35 मिमी इमेजिंग कांच आधारित डिश में DMEM मध्यम पूरक एक रुधिरकोशिकामापी और प्लेट 1 × 10 6 J774.1 मैक्रोफेज कोशिकाओं का उपयोग कर की गणना. 37 पर रातोंरात सेते ° सी, 5% सीओ 2.
- इमेजिंग के लिए पहले, के साथ पूरक DMEM मध्यम की जगह 2 मिलीलीटर सीओ 2-स्वतंत्र मध्यम (10 (v / v)% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 200 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 मिमी एल glutamine के साथ) पूरक पूर्व गरम 1 सुक्ष्ममापी LysoTracker लाल DND-99 युक्त.
4. लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी phagocytosis परख
- माइक्रोस्कोप के विकल्प है जो स्थानीय रूप से उपलब्ध है पर निर्भर करती है, लेकिन खुर्दबीन सेटअप करने के लिए एक औंधा चरण, एक पर्यावरण 37 के लिए गरम कक्ष को शामिल करने की आवश्यकता होगी डिग्री सेल्सियस और चुना दाग के लिए / उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर (FITC और TRITC).
- पहले माइक्रोस्कोप हीटर पर प्रयोग करने के लिए और बारी पर्यावरण नियंत्रण कक्ष के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए 37 के लिए गर्म डिग्री सेल्सियस चैम्बर तापमान को स्थिर करने के लिए लिया गया समय अलग माइक्रोस्कोप की व्यवस्था के लिए अलग अलग होंगे.
- माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर पर बारी, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर लोड. मंच खुर्दबीन इमेजिंग डिश माउंट और ध्यान समायोजित J774.1 मैक्रोफेज. प्रेषित प्रकाश और जोखिम बार के प्रतिशत का समायोजन करके TRITC और डीआईसी छवियों की उपस्थिति का अनुकूलन.
- इमेजिंग पकवान निकालें और 3 × 10 6 सी. FITC दाग करने के लिए टी albicansवह पकवान. समय रिकार्ड है कि सी. albicans डिश के लिए जोड़ा गया है. मंच पर पकवान लौटें और यदि आवश्यक FITC छवियों की उपस्थिति का अनुकूलन. एक अंक सूची सेट यदि आवश्यक.
- इमेजिंग शुरू जब सभी बिंदुओं को ध्यान में हैं और चैनलों को अनुकूलित कर रहे हैं. FITC, TRITC और डीआईसी 6 घंटा के लिए हर मिनट छवियों पर कब्जा.
Representative Results
यहाँ हम सी के लिए प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं 6 घंटा वीडियो जीवित कोशिका माइक्रोस्कोपी प्रयोग के दौरान एक murine बृहतभक्षककोशिका सेल J774.1 लाइन द्वारा albicans तेज चित्रा 1 एक प्रतिनिधि वीडियो जीवित कोशिका माइक्रोस्कोपी फिल्म है, सी. phagocytosis दिखा murine J774.1 मैक्रोफेज द्वारा albicans. लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी सी. के लिए सक्षम बनाता है internalization बाहरी Candida दाग की जरूरत के बिना देखे जा albicans हालांकि, इन प्रयोगों के दौरान सी.. albicans पीएच के प्रति संवेदनशील डाई FITC (हरा) का उपयोग करते हुए, जो बृहतभक्षककोशिका फेगोसोम के अम्लीकरण के दौरान quenched है सना हुआ था, और पुष्टि है कि Candida भली भाँति किया गया है (1 चित्रा) की सुविधा. जाता सी. के आगे सहायता दृश्य albicans मैक्रोफेज, लाल फ्लोरोसेंट रंजक LysoTracker DND-99 लाल, जो दाग अम्लीय डिब्बों और फेगोसोम परिपक्वता के एक मार्कर गैर विशिष्ट के रूप में कार्य करता है का उपयोग दाग थे.चित्रा 2 एक जीवित कोशिका वीडियो माइक्रोस्कोपी प्रयोग से अभी भी एक छवि है और सी. की संख्या में भिन्नता दिखाता है albicans व्यक्ति J774.1 मैक्रोफेज के द्वारा किया जाता है. इस प्रयोग में, J774.1 मैक्रोफेज की 82% कम से कम एक सी. घिरा 6 घंटा phagocytosis परख के अंत में albicans सेल. चित्रा 3, भली सी की संख्या में बृहतभक्षककोशिका प्रति albicans कोशिकाओं की सूचना दी है. सी. का मतलब संख्या बृहतभक्षककोशिका प्रति लिया albicans 3.4 है, लेकिन दिलचस्प मैक्रोफेज 16 कवक कोशिकाओं को ग्रहण कर सकते हैं चित्रा 4 एक प्रतिनिधि वीडियो जीवित कोशिका माइक्रोस्कोपी एक बृहतभक्षककोशिका phagocytosing सी. दिखा प्रयोग से अभी भी छवियों के एक दृश्य है. albicans कोशिकाओं, बृहतभक्षककोशिका और अंततः बृहतभक्षककोशिका lysis के साथ हाईफे विकास चित्रा 4 दिखाता कि वीडियो माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं के लक्ष्य के घिराव के बाद की घटनाओं का विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है, यानी डेटा की के लिए उत्पन्न किया जा सकता हैसी. द्वारा मैक्रोफेज के lling albicans hyphae जाता लक्ष्य कोशिकाओं की संख्या morphogenesis के संबंध में, और बृहतभक्षककोशिका कैसे हत्या फेगोसोम परिपक्वता है जो वास्तविक समय में अध्ययन किया जा सकता है से संबंधित है.
1 चित्रा लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी फिल्म सी. phagocytosis दिखा. murine J774.1 मैक्रोफेज द्वारा albicans. मैक्रोफेज लाल फ्लोरोसेंट रंजक LysoTracker DND-99 लाल, और सी का उपयोग दाग रहे हैं albicans FITC (हरा) का उपयोग दाग रहे हैं. मैक्रोफेज और सी. albicans 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटा की अवधि के लिए पूरा सीओ 2 स्वतंत्र मध्यम में सह सुसंस्कृत. छवियाँ 6 घंटा के लिए 1 मिनट के अंतराल पर कब्जा कर लिया गया. मैक्रोफेज सी. के साथ सेल सेल से संपर्क स्थापित करने में देखा जा सकता है albicans, जो तो सी. तेज द्वारा पीछा किया जाता है बृहतभक्षककोशिका phagosomes में albicans. तीर सी. करने के लिए इंगित albicans पूर्व J774.1 मैक्रोफेज द्वारा घिराव. इस वीडियो को भी पता चलता है कि FITC प्रतिदीप्ति quenc हैसी. hed निम्नलिखित घिराव albicans. स्केल बार, 10 सुक्ष्ममापी फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. प्रतिनिधि वीडियो जीवित कोशिका माइक्रोस्कोपी अभी भी व्यक्ति मैक्रोफेज द्वारा engulfed C.albicans की संख्या में छवि दिखाने भिन्नता. मैक्रोफेज (दाग LysoTracker लाल रंग का प्रयोग DND 99) FITC दाग सी. के साथ सह सुसंस्कृत albicans (हरा). सी. की संख्या में भिन्नता है albicans (एक एक तीर के आगे संख्या को इंगित करता है सी. albicans की संख्या घिरा) घिरा हुआ है, और सी में albicans आकारिकी (यानी खमीर छंद हाईफे). स्केल बार, 20 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3 सी. संख्या ग्राफ दिखा. albicans 6 घंटा phagocytosis assays के अंत में J774.1 murine बृहतभक्षककोशिका के अनुसार किया जाता है. डेटा 2 स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं. कुल 100 मैक्रोफेज की प्रत्येक प्रयोग से 3 क्षेत्रों से गिना रहे थे, 600 व्यक्तिगत मैक्रोफेज की कुल दे.
चित्रा 4 एक प्रतिनिधि जीवित कोशिका वीडियो माइक्रोस्कोपी एक बृहतभक्षककोशिका दिखा प्रयोग (एम) और सी. से छवियों की एक श्रृंखला albicans (सी) के लिए पहले और मान्यता (ए, बी) के दौरान, और के दौरान और तेज के बाद (सी, डी) सी.. albicans hyphae (ई, एफ) बृहतभक्षककोशिका है, जो बृहतभक्षककोशिका lysis (G) में परिणाम कर सकते हैं के भीतर हो जाना जारी है. अन्य मैक्रोफेज टूटना और प्रयास जारी सी. निगलना की साइट के लिए भर्ती कर रहे हैं albicans (एच). मैक्रोफेज लाल फ्लोरोसेंट डाई LysoTrac का उपयोग दाग रहे हैंKer लाल DND-99, और सी. albicans FITC (हरा) का उपयोग दाग रहे हैं. ध्यान दें कि FITC धुंधला हो जाना सी. बाद quenched है J774.1 मैक्रोफेज (सी) द्वारा albicans तेज. स्केल बार, 10 सुक्ष्ममापी.
Discussion
बृहतभक्षककोशिका phagocytosis अध्ययन के लिए जीवित कोशिका वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए विधि वर्णित है. वीडियो माइक्रोस्कोपी जानकारी के विश्लेषण के लिए कई अतिरिक्त परतों प्रदान करता है. एक बुनियादी लाभ यह है कि तेज डेटा 6 घंटा प्रेक्षण अवधि के दौरान किसी भी समय बिंदु के लिए एक ही प्रयोग से उत्पन्न किया जा सकता है. अधिक महत्वपूर्ण बात, वर्णित विधि phagocytosis के अलग - अलग चरणों के अंतर के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. हम, उदाहरण के लिए दिखाया गया है, कि सी. के समग्र तेज में परिवर्तन albicans और बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों और प्राथमिक मैक्रोफेज द्वारा ग्लाइकोसिलेशन morphogenesis म्यूटेंट या तो 7 स्थापित है बृहतभक्षककोशिका प्रवास में लक्ष्य सेल सेल के संपर्क में एक बार या निमग्नता की दर कोशिकाओं की दिशा में परिवर्तन का एक परिणाम हो सकता है.
नुकसान के एक नंबर से बचने के लिए जब इन प्रयोगों का आयोजन कर रहे हैं. सबसे पहले, यह बहुत महत्वपूर्ण है प्रयोगात्मक संस भर स्थिर पर्यावरण शर्तों सुनिश्चितdure. यह सबसे अच्छा है कि प्रयोग के शुरू होने से पहले कई घंटे प्रयोगात्मक शर्तों के लिए सेट कर दिया जाता है एक पर्यावरण कक्ष में हासिल की है. वीडियो की गुणवत्ता अत्यधिक परिष्कृत मॉड्यूल है कि अवरक्त लेजर का उपयोग करने के लिए स्वचालित रूप से नमूना z-स्थिति बनाए रखने के यांत्रिक या थर्मल इस प्रकार मैनुअल ध्यान केंद्रित सुधार के लिए नष्ट करने की जरूरत है परिवर्तन की परवाह किए बिना पर निर्भर है.
प्रयोगों की विस्तारित प्रकृति को देखते हुए, यह महत्वपूर्ण है लेजर प्रकाश जोखिम और जुड़े photobleaching और photoconversion प्रभाव है, जो अत्यधिक फ्लोरोसेंट मार्करों, जो कम जोखिम बार की सुविधा को रोजगार के द्वारा कम किया जा सकता है सीमा. FITC धुंधला हो जाना यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल त्वरित और विश्वसनीय है. FITC है एक बहुत ही उज्ज्वल है और स्थिर दाग, कम जोखिम बार की जरूरत है और इस विस्तारित समय चूक फिल्मों के लिए FITC आदर्श बनाता है. हालांकि, हम नियमित रूप से Calcofluor व्हाइट और PKH रंगों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से टैग जीवों सहित अलग लक्ष्य दाग की एक किस्म का उपयोग करें.
इस अध्ययन के दौरान, छवियों 1 मिनट के अंतराल पर एक 6 घंटा phagocytosis परख पर कब्जा कर लिया गया. छवियों के बीच के अंतराल में जांच के अधीन प्रक्रिया के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अंतराल जब ऐसे vesicular की तस्करी के रूप में तेजी से प्रक्रियाओं की जांच कम किया जा सकता है. न्यूनतम समय अंतराल माइक्रोस्कोप और कैमरा विनिर्देशों से सीमित हो जाएगा. वहाँ कुछ को ध्यान में रखना जब समय को एडजस्ट करने के लिए विचार कर रहे हैं. सबसे पहले, फोटो के बीच के अंतराल को कम करने का मतलब कम अंक और imaged किया जा सकता फ़ाइल का आकार काफी बढ़ जाएगा. इसके विपरीत, छवि अंतराल बहुत ज्यादा वृद्धि कर देगा फिल्म निरंतरता खोना.
इस दृष्टिकोण को लागू किया जा सकता हैसिद्धांत रूप में अन्य रोगज़नक़ों का अध्ययन करने के लिए और मेजबान कोशिकाओं मरने की तेज. उदाहरण के लिए, हम हाल ही में पता चला है कि बोन मैरो sialoadhesin चूहों की कमी से व्युत्पन्न मैक्रोफेज बहुत बाध्यकारी और sialylated Campylobacter jejuni 8 phagocytosis कम प्रदर्शन. हालांकि, लक्ष्य आकार व्यवहार्यता के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक है, के रूप में छवि विश्लेषण लक्ष्य सेल आकार में कमी के साथ तेजी से मुश्किल हो जाता है. परिष्कृत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर तेजी से वीडियो माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए आवश्यक है, और यह उपयुक्त जैव सूचना विज्ञान समर्थन के साथ मिलकर किया जाना चाहिए एल्गोरिदम की पीढ़ी के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं और पूरे सेल आबादी 7 के प्रवास अध्ययन की सुविधा. लाइव सेल मिनट दर मिनट माइग्रेशन और व्यक्तिगत बृहतभक्षककोशिका C.albicans बातचीत के विश्लेषण के लिए परिष्कृत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में वीडियो माइक्रोस्कोपी, सी. की जटिलता में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करता है macrophag albicans phagocytosisतों. वहाँ भारी करने के लिए इन तरीकों का विस्तार करने के लिए अन्य रोगज़नक़ों और phagocytes (वृक्ष के समान कोशिकाओं neutrophils) का अध्ययन करने के लिए और अधिक विस्तार में या उपकला और endothelial सेल परतों के रूप में अधिक शारीरिक सतहों पर छवि सेल सेल बातचीत के लिए 3 डी वीडियो माइक्रोस्कोपी विकसित की क्षमता है. इस तकनीक मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन में उपकरणों की अगली पीढ़ी का हिस्सा है और गतिशील प्रक्रियाओं की एक व्यापक रेंज पर विस्तृत स्थानिक और लौकिक जानकारी उत्पन्न करने में मदद करेगा.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है. एनजी गिलाद विज्ञान अनुसंधान के लिए बुनियादी अप्रतिबंधित अनुदान सहायता के एक प्राप्तकर्ता है. ले जल्दी दवा के विकास में जीएसके के लिए एक सलाहकार के रूप में काम करता है.
Acknowledgments
LPE स्कॉटलैंड के एक वरिष्ठ क्लीनिकल फैलो और मुख्य वैज्ञानिक कार्यालय (SCD/03) के समर्थन मानता है. यह काम LPE (089,930) के लिए वेलकम ट्रस्ट परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. NARG एक वेलकम ट्रस्ट कार्यक्रम (080,088) अनुदान और एक उपकरण (075,470) ग्रांट (DeltaVision के लिए), और एक FP7-2007 2013 ग्रांट (स्वास्थ्य F2-2010-२६०३३८ - ALLFUN) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम Aberdeen इमेजिंग सुविधा के विश्वविद्यालय, विशेष केविन मैकेंज़ी में उपयोगी सलाह और समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
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