Denne artikkelen beskriver fremstilling av nystekte oppnådd melanom vevet inn primære cellekulturer, og hvordan å fjerne forurensninger av erytrocytter og fibroblaster fra kreftceller. Til slutt beskriver vi hvordan CD133<sup> +</sup> Antatte melanom stamceller er sortert fra CD133<sup> -</sup> Bulk hjelp Magnetic Aktivert Cell Sortering (MACS).
Til tross for bedre behandlinger alternativer for melanom tilgjengelig i dag, pasienter med avansert malignt melanom har fortsatt en dårlig prognose for progresjonsfri og total overlevelse. Derfor må translasjonsforskning å gi ytterligere molekylære bevis for å forbedre målrettet terapi for maligne melanomer. I det siste, onkogene mekanismer knyttet til melanom ble grundig studert i etablerte cellelinjer. På vei til mer personlige behandlingsregimer basert på individuelle genetiske profiler, foreslår vi å bruke pasient-deriverte cellelinjer i stedet for generiske cellelinjer. Sammen med høy kvalitet kliniske data, spesielt på oppfølging av pasientene, vil disse cellene være medvirkende til bedre å forstå de molekylære mekanismene bak melanom progresjon.
Her rapporterer vi etablering av primære melanom kulturer fra dissekert fersk svulstvev. Denne fremgangsmåten inneholder male og dissosiasjon av vevet inn enkeltceller, reFjerning av forurensninger med erytrocytter og fibroblaster samt primær kultur og pålitelig verifisering av cellenes melanom opprinnelse.
Nylige rapporter viste at melanomer, som de fleste svulster, havn en liten undergruppe av kreft stamceller (CSCS), som synes å utelukkende drivstoff startfasen og progresjon mot metastatisk staten. En av de viktigste markører for CSC identifisering og isolering i melanom er CD133. Å isolere CD133 + CSCS fra primære melanom kulturer, har vi endret og optimalisert Magnetic-Activated Cell Sortering (MACS) prosedyren fra Miltenyi resulterer i høy sortering renhet og levedyktigheten til CD133 + CSCS og CD133 – bulk, som kan dyrkes og funksjonelt analysert etterpå.
Kutane maligne melanomer er den minst vanlige, men mest dødelige typen hudkreft. På grunn av en økende forekomst, en høy grad av malignitet og en rask formidling, melanomer nå står for 75% av maligne hudsvulster dødsfall 1,2. Foruten kirurgisk excision av primærtumor, kjemoterapi, strålebehandling, immunterapi og kombinert kjemo-og immunterapi av metastasized melanom er state-of-the-art strategier for melanom behandling 3,4. Imidlertid er malignt melanom preget av en dårlig respons på kjemoterapeutika (5-12%) 5,6, og bare de 50-70% av melanom pasienter bærer BRAF V600E genmutasjon nytte lovende nye målrettede terapier som behandling med vemurafenib 7 Slik forbedre total overlevelse, er en mye bedre forståelse av mekanismene for melanom tumorigenesis nødvendig.
Å studere disse mekanismene i det siste, veletablerte kommersiellesielt tilgjengelige cellelinjer ble brukt. Nyere tilnærminger til å studere molekylære hendelser av kreft initiering og progresjon utnytte primærkulturer avledet direkte fra svulstvev – en strategi bærende manifold fordeler: Forskeren har full kontroll over pasienten og vev utvalg. De undersøkte celler fått fra fagmessig valgt svulstvev, ligner svulsten med all heterogenitet sin og oppfølging for pasienten og en detaljert patologi er tilgjengelig for å tillate egenskapene til kultur å bli sammenlignet med dem av den opprinnelige svulsten 8.
I kontrast, er bruken av etablerte cellelinjer som relevante modellsystemer i kreftforskning diskutert kontroversielt. Allerede i 1987 Osborne og kollegene beskrevet betydelige biologiske forskjeller mellom MCF-7 menneskelige brystkreft cellelinjer fra ulike laboratorier 9. Denne omfattende genomisk ustabilitet og variasjon i RNA uttrykk under subkultur var confirmed av Hiorns et al. og ga støttende data for bevis for at cellelinjer gjør utvikles i kultur, og dermed svekke den direkte relevansen av slike etablerte kulturer som modeller av menneskelig kreft 10.
En annen viktig faktor som i stor grad har blitt ignorert gjennom årene, er risikoen for forurensning eller overvekst av kulturer med urelaterte "falske" celler, som først ble markerte over tjue år siden ved å demonstrere at et stort antall av cellelinjer ble forurenset av HeLa celler 8,11. Feiltolkning av data fra "falske" cellelinjer har nylig kommet frem i lyset i litteraturen igjen. Ved hjelp av en kombinasjon av DNA-profilering og molekylære cytogenetikk avslørte MacLeod et al. At av 252 nye tumor-avledede humane cellelinjer deponert ved den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ), nesten 18% ble funnet å være intraspecies eller interspecies kryss -forurensninger 12,13.
For å unngå disse problemene og for å gjøre bruk av fordelene nevnt ovenfor, har vi besluttet å etablere lav passasje melanom cellelinjer fra ferske skåret metastaser.
Robust cellen separasjon og analyse teknologier krever encellede forberedelser som skal genereres samtidig begrense celle død og ødeleggelse av karakteristiske overflateproteiner. En Borstemmaskin instrument for automatisert dissosiasjon av vev i encellede suspensjoner er gentleMACS Dissociator produsert av Miltenyi. Når den brukes i kombinasjon med gentleMACS C Rør og optimalisert dissosiasjon løsninger, en effektiv og skånsom dissosiasjon av svulstvev i et lukket system oppnås samtidig bevare antigen epitoper og redusere celletap. Instrumentet tilbyr optimalisert, forhåndsinnstilte programmer for en rekke spesifikke applikasjoner og garantier standardisert forberedelse av encellede suspensjoner fra melanom vev 14.
<p class = "jove_content"> Nye rapporter viste at flertallet av svulster havn en liten undergruppe av såkalte kreft stamceller (CSCS), som utelukkende utviser tumor-initiere og selv-fornyende kapasitet. Identifiseringen av melanocyte-produserende stamceller i dermis i huden ført til den hypotese at disse cellene kan være opprinnelsen til kreft stamceller (CSCS) i melanom siden eksponering for UVA-stråling kan prime disse cellene for malign transformasjon 15. Resultatet av en slik en genetisk lesjon ville være celler som er bærere av en kombinasjon av svulst og stamcelleegenskaper.En av de viktigste markørene kan sies å representere en undergruppe CSCS i melanom er CD133 16-20. CD133 (også kjent som Prominin 1), et medlem av pentaspan transmembrane glykoproteiner, er uttrykt i hematopoetiske stamceller, endotelceller progenitorceller, neuronal og glial stamceller 21-23. Uttrykk for CD133 er korrelert medasymmetrisk celledeling 24, og den glykosylerte epitop av CD133 ble vist å være downregulated upon celledifferensiering 25. Nylig ble CD133 + melanomceller vist seg å ha selvfornyelse og tumor-innvielse kapasitet 19,20.
Å studere funksjonen til CD133 + antatte melanom CSCS, har vi endret og optimalisert Magnetic-Activated Cell Sortering (MACS) system fra Miltenyi Biotech å få høyanriket og levedyktige bestander av CD133 + og CD133 – celler.
Magnetisk perle-baserte celleseparasjon tillater enten negativ seleksjon som vist ved Matheu m.fl.. 26 eller positiv utvelgelse som vi viser her. Under positiv utvelgelse bestemt målcellen attraksjon, CD133 f.eks uttrykkende celler, er magnetisk merket med mikroperler, 50-nm superparamagnetiske partikler som er konjugert til høyst spesifikke antistoffer mot etbestemt celleoverflateantigen. Under separasjonen, er magnetisk merkede celler beholdes i kolonnen i det magnetiske feltet av separatoren, mens umerkede celler strømme gjennom. Etter vasketrinnene, er kolonnen fjernet fra magnetfelt av separatoren, og målcellene elueres fra kolonnen. LS eller MS kolonner brukes under positiv utvelgelse resultat i fraksjoner av merkede og umerkede celler med høy renhet. På den annen side, LD kolonner, som brukes for negativ seleksjon, resultere i en litt lavere renhet av den merkede fraksjonen. Grunnet tettere pakking av matrise deres strømningshastigheten i disse kolonnene er lavere resulterende i en høyere risiko for umerkede celler å være fanget i kolonnen. LD kolonner bør derfor bare brukes for strenge uttømming av en uønsket celle undergruppe. Positiv utvelgelse kan utføres ved direkte (antistoff koplet til mikroperler) eller indirekte magnetisk merking (inkubasjon med mikroperler etter incubation med det primære antistoff). Spesifikke MACS mikroperler er tilgjengelig for positiv utvelgelse av tallrike celletyper primære tumorceller som prostata-eller melanom 27.
For å fjerne erytrocytt forurensing fra svulsten cellepelleten vi anbefale å bruke det røde blodlegemer lysis løsning fra Miltenyi. Fordelene med lysering erytrocyttene over den tradisjonelle Ficoll tetthetsgradient sentrifugering er at det er raskere og enklere. Videre er forurensninger med Ficoll eller røde blodceller og tap av tumorceller unngås. Når du observerer veksten av fibroblaster i den primære cellekulturer de bør fjernes umiddelbart siden de normalt overgrow kreftceller når venter for lenge.
<p…The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker professor M. Dietel og Dirk Schumacher for å støtte dette arbeidet og kritisk lesing manuskriptet.
Forskningen fører til disse resultatene har fått støtte fra Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking henhold tilskuddsavtalen n ° 115234, ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA selskapenes i tingsinnskudd. Dette arbeidet ble også støttet av Berliner Krebsgesellschaft (BKG).
Reagent | |||
Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
Equipment | |||
Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |