Patient Afledt Cellekultur og isolering af CD133⁺ Formodede kræftstamceller fra melanom

Summary

I denne artikel beskriver fremstillingen af ​​frisk opnåede melanomavæv i primære cellekulturer, og hvordan du fjerner forureninger af erythrocytter og fibroblaster fra tumorcellerne. Endelig beskriver vi, hvordan CD133⁺ Putative melanom stamceller sorteres fra CD133^- Hovedparten anvendelse af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS).

Abstract

Trods forbedrede behandlinger muligheder for melanom rådighed i dag, stadig patienter med fremskreden malignt melanom har en dårlig prognose for progressionsfri og samlet overlevelse. Derfor translationel forskning skal give yderligere molekylære beviser til at forbedre målrettede behandlinger for maligne melanomer. I fortiden, onkogene mekanismer relateret til melanom blev grundigt undersøgt i etablerede cellelinjer. På vej til mere individualiserede behandlingsplaner baseret på individuelle genetiske profiler, foreslår vi at bruge patient-afledte cellelinjer i stedet for generiske cellelinjer. Sammen med høj kvalitet kliniske data, især på patient opfølgning, vil disse celler være medvirkende til bedre at forstå de molekylære mekanismer bag melanom progression.

Her rapporterer vi etablering af primære melanom kulturer fra dissekeret friske vævsprøver. Denne procedure omfatter hakning og dissociation af vævet i enkelte celler, removal af forureninger med erytrocytter og fibroblaster samt primær kultur og pålidelig kontrol af cellernes melanom oprindelse.

Nylige rapporter viste, at melanomer, ligesom størstedelen af ​​tumorer. Havnen en lille subpopulation af kræft stamceller (specificitetsattestering), der synes at udelukkende brændstof tumor initiering og progression mod metastatisk stadie En af de vigtigste markører for CSC identifikation og isolation i melanom er CD133. For at isolere CD133 ⁺ specificitetsattestering fra primære melanom kulturer, har vi ændret og optimeret Magnetic cellesortering (MACS) procedure fra Miltenyi resulterer i høj sortering renhed og levedygtighed CD133 ⁺ specificitetsattestering og CD133 ^– bulk, som kan dyrkes og funktionelt analyseret derefter.

Introduction

Kutane maligne melanomer er den mindst udbredte, men mest dødbringende form for hudkræft. På grund af en stigende forekomst, en høj grad af malignitet og en hurtig formidling, melanomer nu tegner sig for 75% af maligne hudtumorer dødsfald ^1,2. Udover kirurgisk excision af den primære tumor, kemoterapi, strålebehandling, immunterapi og kombineret kemo-og immunterapi af metastaseret melanom er state-of-the-art strategier for melanom behandling ^3,4. Imidlertid er malignt melanom karakteriseret ved en dårlig respons på kemoterapi (5-12%) ^5,6, og kun de 50-70% af melanompatienter bærer BRAF V600E genmutation gavn af lovende nye målrettede behandlinger som behandling med vemurafenib ⁷ Til forbedre den samlede overlevelse, er en langt bedre forståelse af mekanismerne bag melanom tumorigenese nødvendig.

For at studere disse mekanismer tidligere, veletablerede kommerciellecielt tilgængelige cellelinier blev anvendt. Nyere metoder til at studere de molekylære begivenheder i kræft initiering og progression udnytte primære kulturer afledt direkte fra tumorvæv – en strategi bærer mangfoldige fordele: Forskeren har fuld kontrol over patient og væv udvælgelse. I stikprøven celler opnået fra sagkyndigt valgt tumorvæv, ligner tumoren med alle dets heterogenitet og opfølgningsdata af patientens behov og en detaljeret patologi er tilgængelig til at tillade karakteristika af kulturen, der skal sammenlignes med den oprindelige tumor ^8.

I modsætning hertil er anvendelsen af ​​etablerede cellelinjer som relevante modelsystemer i kræftforskning diskuteret kontroversielt. Allerede i 1987 Osborne og kolleger beskrevne signifikante biologiske forskelle mellem MCF-7 humane brystcancercellelinjer fra forskellige laboratorier ^9. Denne omfattende genomisk ustabilitet og variation i RNA-ekspression i løbet af subkultur var confirmed ved Hiorns et al. og forudsat understøttende data for dokumentation for, at cellelinier ikke udvikler sig i kulturen og dermed svække den direkte relevans af sådanne etablerede kulturer som modeller for humane cancer ^10.

En anden vigtig overvejelse, som er stort set blevet ignoreret i årenes løb, er risikoen for forurening eller tilgroning af kulturer med uafhængige "falske" celler, som først fremhævede over tyve år siden ved at demonstrere, at en lang række cellelinier blev inficeret med HeLa celler ^8,11. Fejlfortolkning af data fra "falske" cellelinjer er for nylig kommet frem i litteraturen igen. Under anvendelse af en kombination af DNA-profilering og molekylær cytogenetik, afslørede MacLeod et al. Den for 252 nye tumorafledte humane cellelinjer deponeret hos den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ), næsten 18% blev fundet at være intraspecies eller interspecies cross -kontaminanter ^12,13.

For at undgå disse problemer og at gøre brug af de fordele, der er nævnt ovenfor, besluttede vi at etablere lav-passage melanomcellelinjer fra frisk udtaget metastaser.

Robuste celleadskillende og analyse teknologier kræver encellede forberedelser, der skal genereres samtidig begrænser celledød og ødelæggelse af karakteristiske overfladeproteiner. En benchtop instrument til automatiseret dissociation af væv i single-cellesuspensioner er gentleMACS Dissociator fremstillet af Miltenyi. Ved anvendelse i kombination med gentleMACS C Tubes og optimeret dissociation opløsninger, en effektiv og skånsom dissociering af tumorvæv i et lukket system opnås samtidig bevare antigen-epitoper og reducere celletab. Instrumentet tilbyder optimerede, forudindstillede programmer til en række specifikke applikationer og garantier standardiseret udarbejdelse af enkelt-cellesuspensioner fra melanomavæv ^14.

<p class = "jove_content"> Nylige rapporter viste, at størstedelen af ​​tumorer huser en lille subpopulation af såkaldte cancer stamceller (specificitetsattestering), som udelukkende udviser tumorfremkaldende og selvfornyende kapacitet. Identifikationen af melanocyt-producerende stamceller i dermis af huden førte til den hypotese, at disse celler kan være oprindelsen af cancer stamceller (specificitetsattestering) i melanom, da eksponering for UVA-stråling kan prime disse celler for malign transformation ^15. Resultatet af en sådan genetisk læsion vil være celler, der huser en kombination af tumor og stamceller egenskaber.

En af de vigtigste markører foreslået at repræsentere subpopulation af specificitetsattestering i melanom er CD133 ^16-20. CD133 (også kendt som Prominin 1), et medlem af pentaspan transmembrane glycoproteiner, der er udtrykt i hæmatopoietiske stamceller, endoteliale stamceller, neuronale og gliale stamceller ^21-23. Ekspression af CD133 er korreleret medasymmetrisk celledeling ^24, og den glycosylerede epitop af CD133 blev vist at være nedreguleret ved celledifferentiering ^25. For nylig blev CD133 ⁺ melanomceller vist at have selvfornyelse og tumor-initiering kapacitet ^19,20.

At studere funktionen af CD133 ⁺ putative melanom specificitetsattestering har vi modificeret og optimeret Magnetic cellesortering (MACS) system fra Miltenyi Biotech at opnå meget beriget og levedygtige populationer af CD133 ⁺ og CD133 ^– celler.

Magnetisk perle-baseret celleseparation tillader enten negativ selektion som vist ved MATHEU et al. ²⁶ eller positiv selektion som vi viser her. Under positiv selektion den særlige målcelletype, f.eks CD133 udtrykkende celler, er magnetisk mærket med mikroperler, 50 nm superparamagnetiske partikler, der er konjugeret til meget specifikke antistoffer mod etsærligt celleoverfladeantigen. Under adskillelsen er de magnetisk mærkede celler tilbageholdes i kolonnen i det magnetiske felt af separatoren, mens umærkede celler strømme igennem. Efter vasketrin, søjlen fjernes fra det magnetiske felt af separatoren, og målcellerne elueres fra søjlen. LS eller MS kolonner anvendes under positiv selektion resulterer i fraktioner af mærkede og umærkede celler med høj renhed. På den anden side,. LD søjler, der anvendes til negativ selektion, resulterer i en lidt lavere renhed af det mærkede fraktion På grund af den tættere pakning af deres matrix strømningshastigheden i disse kolonner er lavere resulterende i en øget risiko for umærkede celler, der skal fanges i kolonnen. LD kolonner bør derfor kun anvendes til stringent udtømning af en uønsket cellesubpopulation. Positiv selektion kan udføres ved direkte (antistof koblet til mikrokugler) eller indirekte magnetiske mærkning (inkubation med mikrokugler efter incubation med det primære antistof). Specifikke MACS-mikroperler er tilgængelige til positiv selektion af talrige celletyper af primære tumorceller såsom prostatahypertrofi eller melanoma ^27.

Protocol

Den generelle opbygning af forsøget, herunder fremstillingen af primære single-celler fra tumorvæv, karakterisering af den primære cellekultur, fibroblast udtømning og magnetisk cellesortering af CD133 + og CD133 – melanomceller er vist i figur 1.. 1. Prøveindsamling Check for etisk godkendelse, før man overvejer de næste skridt. Forbered en 50 ml rør med steril PBS suppleret med 1% penicillin-streptomycin endelig koncentra…

Representative Results

Fremstilling af enkelt-celler fra tumorvæv Figur 2 eksemplificerer en resekteret lymfeknude metastase af en sen fase melanom patient før (A) og efter (B) mekanisk dissociering i 2-4 mm stykker. Efter enzymatisk dissociering af væv og filtrering gennem en 70 um nylon mesh, blev cellerne pelleteret og supernatanten kasseres. I dette trin vi observeret en stærk forurening med erythrocytter som angivet ved den rødlige farve af cellepelleten i figur 2C. Efterf?…

Discussion

For at fjerne erythrocyt forureninger fra tumor cellepellet vi stærkt anbefale at bruge den røde blodlegemer lyseopløsning fra Miltenyi. Fordelene ved lysering af erythrocytterne via det traditionelle Ficoll densitetsgradientcentrifugering er, at den er hurtigere og enklere. Endvidere er kontaminering med Ficoll eller røde blodlegemer og tab af tumorceller undgås. Når du observere væksten af ​​fibroblaster i den primære cellekultur de bør fjernes straks, da de normalt overgrow tumorcellerne når man venter …

Materials

			Reagent
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water	Sigma-Aldrich, Inc.	A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads	Miltenyi Biotec GmbH	130-050-601
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-395
Collagenase IV	Sigma-Aldrich, Inc.	C5138
DNase I	Applichem GmbH	A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg	PAA Laboratories GmbH	H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich, Inc.	E-7889
FBS Superior	Biochrom	S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-895	Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x)	Invitrogen GmbH	15140-122
Quantum 263	PAA Laboratories GmbH	U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec GmbH	130-094-183
			Equipment
Cell strainer (70 μm)	BD Biosciences	352350
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-237
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-235
MACS Separator Multi Stand	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-401
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-753
Natriumchloride	Merck KGaA	567440-1KG
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES)	Carl Roth GmbH & Co. KG	P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml	Miltenyi Biotec GmbH	SCGPS05RE