Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133 doi: 10.3791/50200 Published: March 13, 2013

Summary

توضح هذه المقالة إعداد الأنسجة التي تم الحصول عليها حديثا في سرطان الجلد الثقافات الخلية الأولية، وكيفية إزالة التلوث من الكريات الحمراء والخلايا الليفية من الخلايا السرطانية. وأخيرا، نحن تصف كيفية CD133

Abstract

على الرغم من خيارات العلاج لسرطان الجلد تحسين المتاحة اليوم، المرضى الذين يعانون من سرطان الجلد الخبيث متقدمة لا تزال لديها بسوء التشخيص من أجل البقاء خالية من التقدم والشاملة. ولذلك، والبحث متعدية في حاجة إلى توفير مزيد من الأدلة الجزيئية لتحسين العلاجات المستهدفة لالميلانينية الخبيثة. في الآليات، أنكجنيك الماضية المتعلقة سرطان الجلد وتمت دراسة على نطاق واسع في خطوط الخلايا الراسخة. في الطريق إلى نظم العلاج أكثر تخصيصا على أساس مواصفات جينية الفردية، نقترح استخدام خطوط الخلايا المشتقة من المريض بدلا من خطوط الخلايا عامة. جنبا إلى جنب مع بيانات عالية الجودة السريرية، وخصوصا على المريض المتابعة، فإن هذه الخلايا تكون مفيدة لفهم أفضل للآليات الجزيئية وراء تطور سرطان الجلد.

هنا، ونحن التقرير إنشاء الثقافات سرطان الجلد الأولي من تشريح أنسجة الورم الطازجة. يتضمن هذا الإجراء تنميق وتفكك النسيج إلى خلايا واحدة، وإعادةmoval من التلوث والخلايا الليفية مع كرات الدم الحمراء وكذلك الثقافة الابتدائية والتحقق بصورة موثوق بها من أصل سرطان الجلد الخلايا.

كشفت تقارير حديثة أن الميلانينية، مثل معظم الأورام، الميناء جزء من السكان صغيرة من الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية)، والذي يبدو لتغذية حصرا بدء الورم والتقدم نحو الدولة النقيلي. واحدة من علامات رئيسية لتحديد CSC والعزلة في سرطان الجلد هو CD133. CD133 + لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من سرطان الجلد الثقافات الأولية، وقمنا بتعديل الأمثل لفرز الخلايا المغناطيسي المنشط (MACS) الإجراء من Miltenyi مما أدى إلى نقاء عالية والفرز CD133 + صلاحية الخلايا الجذعية السرطانية وCD133 - السائبة، والتي يمكن زراعتها وتحليلها وظيفيا بعد ذلك.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الميلانينية الخبيثة الجلدية هي نوع أقل شيوعا، ولكن القاتل من سرطان الجلد الأكثر. نتيجة لتزايد، ودرجة عالية من الخباثة والانتشار السريع، الميلانينية تمثل الآن 75٪ من الأورام الخبيثة الجلد الوفيات المرتبطة 1،2. وبالاضافة الى الاستئصال الجراحي للورم الأولية، والعلاج الكيميائي، العلاج الإشعاعي، العلاج المناعي الكيميائي ومجتمعة والعلاج المناعي للسرطان الجلد انتشر هي الاستراتيجيات للدولة من بين الفن للعلاج سرطان الجلد 3،4. ومع ذلك، يتميز سرطان الجلد الخبيث من ضعف الاستجابة لمبحث المعالجة الكيميائية (5-12٪) 5،6، وتلك فقط 50-70٪ من مرضى سرطان الجلد يحمل الجين V600E BRAF فائدة من طفرة جديدة واعدة لعلاج العلاجات المستهدفة مع 7 لvemurafenib تحسين البقاء على قيد الحياة عموما، هناك حاجة إلى فهم أفضل بكثير لآليات تكون الأورام سرطان الجلد.

لدراسة هذه الآليات في الماضي تسويقية راسخة،واستخدمت خطوط الخلايا المتاحة cially. نهج أكثر حداثة لدراسة الأحداث الجزيئية للسرطان والتقدم بدء استخدام الثقافات الأولية المستمدة مباشرة من أنسجة الورم - وهي فوائد متعددة تحمل استراتيجية: وقد قام الباحث السيطرة الكاملة على المريض واختيار الأنسجة. الخلايا عينات أنسجة الورم المكتسبة من اختيار بخبرة، تشبه الورم مع عدم التجانس في جميع ومتابعة البيانات للمريض والأمراض مفصلة متاح للسماح مقارنة خصائص الثقافة مع تلك الورم الأصلي 8.

في المقابل، ويناقش استخدام خطوط الخلايا على النحو المنصوص عليه في الأنظمة ذات الصلة نموذج أبحاث السرطان للجدل. بالفعل في عام 1987 وصف أوسبورن وزملاء الاختلافات البيولوجية بين كبير MCF-7 خطوط الإنسان خلايا سرطان الثدي من مختبرات مختلفة 9. كان هذا عدم الاستقرار الجيني واسعة والاختلاف في التعبير RNA المشترك خلال ثقافة فرعيةnfirmed من Hiorns وآخرون، وقدمت بيانات داعمة لدليل على أن خطوط الخلايا لم تتطور في الثقافة، مما يضعف أهمية مباشرة لمثل هذه الثقافات التي أنشئت كنماذج لسرطان الإنسان 10.

وهناك اعتبار آخر مهم، التي تم تجاهلها إلى حد كبير على مر السنين، هو خطر التلوث أو فرط نمو الخلايا لا علاقة لها مع الثقافات 'كاذبة'، والتي تم تسليط الضوء الأول على عشرين عاما من خلال إظهار أن كانت ملوثة عدد كبير من خطوط الخلايا بواسطة هيلا الخلايا 8،11. لقد حان سوء تفسير البيانات من 'كاذبة' خطوط الخلايا مؤخرا إلى النور في الأدب مرة أخرى. باستخدام مزيج من التنميط الحمض النووي علم الوراثة الخلوية الجزيئية وكشف ماكلويد وآخرون أن الورم من 252 الجديدة المستمدة من خطوط الخلايا البشرية المودعة لدى مجموعة الألمانية الكائنات الدقيقة والثقافات الخلية (DSMZ)، تم العثور على ما يقرب من 18٪ لتكون إختلافات بين الأنواع أو بين الأنواع عبر 12،13-الملوثات.

لتجنب هذه المشاكل، والاستفادة من المزايا المذكورة أعلاه، قررنا إنشاء المنخفضة مرور خطوط الخلايا سرطان الجلد من الانبثاث رفعه حديثا.

فصل الخلايا قوية وتقنيات التحليل يتطلب أن تكون ولدت وحيدة الخلية مع الحد في الوقت نفسه الاستعدادات موت الخلايا وتدمير البروتينات السطحية مميزة. A صك الفوق للالتفكك الآلي من الأنسجة إلى وحيدة الخلية تعليق هو Dissociator gentleMACS المصنعة من قبل Miltenyi. عندما تستخدم بالاقتران مع gentleMACS C أنابيب والحلول الأمثل التفكك، والتفكك فعالة ورقيقة من نسيج الورم في نظام مغلق ويتحقق مع الحفاظ على الحواتم مستضد والحد من فقدان الخلية. الصك يوفر الأمثل، برامج محددة مسبقا لمجموعة متنوعة من تطبيقات محددة وضمانات موحدة من إعداد وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة سرطان الجلد 14.

<ف الطبقة = "jove_content"> كشفت التقارير الأخيرة أن غالبية أورام تؤوي جزء من السكان صغيرة من ما يسمى الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية)، والتي تظهر بشكل حصري للورم والبدء الذاتي تجديد القدرات. أدى تحديد الخلايا الجذعية الخلايا الصباغية التي تنتج في الأدمة من الجلد إلى الفرضية القائلة بأن هذه الخلايا قد يكون منشأ الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) في سرطان الجلد منذ التعرض للإشعاع UVA يستطيع رئيس هذه الخلايا للتحول الخبيث 15. ونتيجة لهذه الآفة الوراثية تكون الخلايا التي تؤوي مجموعة من الورم وخصائص الخلايا الجذعية.

واحدة من علامات الرئيسية المقترحة لتمثيل الخلايا الجذعية السرطانية في حيوانية سرطان الجلد هو CD133 16-20. وأعرب عن CD133 (المعروف أيضا باسم Prominin 1)، وهو عضو في البروتينات السكرية عبر الغشاء pentaspan، في الخلايا الجذعية المكونة للدم، والخلايا البطانية السلف، الخلايا الجذعية العصبية والدبقية 21-23. ويرتبط التعبير عن CD133 معوقد تبين انقسام الخلية غير المتماثلة 24، وحاتمة الغليكوزيلاتي من CD133 أن تكون downregulated على تمايز الخلايا 25. مؤخرا، تم عرض CD133 + خلايا سرطان الجلد أن يكون التجديد الذاتي والقدرة الورم بدء 19،20.

لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية السرطانية CD133 + المفترضة سرطان الجلد، وقمنا بتعديل الأمثل لفرز الخلايا المغناطيسي المنشط (MACS) من نظام التكنولوجيا الحيوية Miltenyi للحصول على السكان وقابلة للحياة عالي التخصيب من CD133 + وCD133 - الخلايا.

الفصل المغناطيسي خلية حبة القائم يسمح لأي اختيار سلبية كما يتضح من ماثيو وآخرون. اختيار 26 أو إيجابية كما نعرض هنا. أثناء اختيار إيجابية هو المسمى مغناطيسيا الخلية المستهدفة خاصة النوع، على سبيل المثال CD133 الخلايا معربا عن، مع، MicroBeads الجسيمات superparamagnetic 50-نانومتر التي هي الأجسام المضادة لمترافق محددة للغاية ضدخاصة مستضد الخلايا السطحية. خلال الفصل، يتم الاحتفاظ الخلايا المسمى مغناطيسيا داخل العمود في المجال المغناطيسي للفاصل، في حين الخلايا غير المسماة تتدفق من خلال. بعد غسل الخطوات، تتم إزالة العمود من المجال المغناطيسي للفاصل، ومزال الخلايا المستهدفة من العمود. وLS أو الأعمدة التي استخدمت خلال MS نتيجة إيجابية في اختيار أجزاء من خلايا وصفت والخالي من الملصقات مع نقاء عالية. من ناحية أخرى، والأعمدة LD، وتستخدم لاختيار سلبية، تؤدي إلى نقاء أقل قليلا من نسبة المسمى. نظرا لكثافة التعبئة من مصفوفة على معدل التدفق في هذه الأعمدة أقل مما أدى إلى ارتفاع خطر الخلايا غير المسماة إلى أن المحاصرين في العمود. ولذلك ينبغي أن تستخدم الأعمدة LD فقط لاستنزاف الصارمة لخلية حيوانية غير المرغوب فيها. لا يمكن أن يؤديها اختيار وضع العلامات الإيجابية التي المغناطيسي المباشر (الضد بالإضافة إلى MicroBeads) أو غير مباشر (مع MicroBeads الحضانة بعد incubatioن مع الأجسام المضادة الأولية). MACS MicroBeads محددة متاحة للاختيار من أنواع الخلايا إيجابية عديدة من الخلايا السرطانية الأولية مثل البروستاتا أو سرطان الجلد 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخطة الشاملة للتجربة بما في ذلك إعداد الخلايا الأولية واحد من أنسجة الورم، وتوصيف للثقافة الخلية الأولية، واستنفاد الخلايا الليفية والفرز المغناطيسي CD133 + خلية من خلايا وCD133 - يظهر خلايا سرطان الجلد في الشكل 1.

1. عينة اكتساب

  1. تحقق من وجود الموافقة الأخلاقية قبل النظر في الخطوات التالية.
  2. إعداد أنبوب 50 مل العقيمة مع PBS تستكمل مع تركيز البنسلين الستربتوميسين-1٪ النهائية وتسليم لعملية جراحية أو الفريق.
  3. تنظيم النقل السريع للأنسجة الورم من عملية جراحية لزراعة الخلايا في المختبر C. ° 4

2. إعداد الميلانوما أساسي واحد من خلايا أنسجة الورم

  1. تنفيذ كافة الخطوات تحت ظروف معقمة.
  2. قبل الإستئصال للورم، ويحتاج المرء لإعداد مزيج التفكك. مطلوب 10 مل لكل مزيج التفكك الأنسجة ز 2-4. ويمكن استخدام هذا المزيج immediately أو تخزينها في 10 مليلتر مأخوذة في -20 ° C لاستخدامها لاحقا.
    1. إعداد محلول يحتوي على 150 ملم كلوريد الصوديوم. خلط باستخدام الدوامة إلى أن الحل واضح. إذا لزم الأمر كلوريد الصوديوم العقيمة، الترشيح باستخدام فلتر حل ميكرون 0.22.
    2. تزن من الدناز I وإعداد محلول يحتوي على 10 ملغ / مل الدناز I في كلوريد الصوديوم 150mM. مزيج من قلب إلى أن الحل واضح.
    3. إعداد محلول يحتوي على 100mg/ml كولاجيناز الرابع في برنامج تلفزيوني. مزيج من قلب إلى أن الحل واضح. ويمكن تخزين مأخوذة من حل كولاجيناز في -20 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
    4. إعداد مزيج التفكك مع تركيز النهائي من 1٪ البنسلين الستربتوميسين،، 1 ملغ / مل IV كولاجيناز و 0.1 ملغ / مل الدناز I في المتوسط ​​263 الكم. خلط باستخدام الدوامة. اختياري: عند استخدام الأنسجة المستمدة من سرطان الجلد الجلد إضافة إلى حل B الامفوتريسين المزيج التفكك إلى تركيز النهائي من 1.5 ميكروغرام / مل الامفوتريسين B.
  3. قبل الدافئة للمساuired كميات من مزيج التفكك، وPBS الكم المتوسطة 263 حتي 37 ° C.
  4. المكان أنسجة الورم على طبق بتري معقمة. نضح حل المفرط من النسيج وإضافة 500 ميكرولتر مزيج التفكك. اللحم المفروم الورم إلى أجزاء صغيرة من 2-4 مم باستخدام الطازجة والمشارط العقيمة.
  5. نقل مفروم 2-4 ز أنسجة الورم في أنبوب C gentleMACS تحتوي على 5 مل مزيج التفكك. شطف طبق بتري مع مزيج إضافية 4،5 مل التفكك وإضافة شظايا الأنسجة المتبقية إلى أنبوب C gentleMACS.
  6. إغلاق أنبوب gentleMACS C ونعلق عليه رأسا على عقب على الكم من Dissociator gentleMACS. تشغيل برنامج gentleMACS "h_tumor_01".
  7. فصل أنبوب C gentleMACS من dissociator واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت التناوب المستمر باستخدام أنبوب MACSmix الدوار على سرعة أعلى المدى (12 دورة في الدقيقة) أو عن طريق تحويل أنبوب يدويا كل 5 دقائق ل resuspend شظايا استقرت الأنسجة .
  8. إرفاق gentleMACS C أنبوب رأسا على عقب على الكم رانه gentleMACS Dissociator وتشغيل البرنامج gentleMACS "h_tumor_02".
  9. فصل أنبوب C gentleMACS من dissociator واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت التناوب المستمر باستخدام أنبوب MACSmix الدوار على سرعة أعلى المدى (12 دورة في الدقيقة) أو عن طريق تحويل أنبوب يدويا كل 5 دقائق ل resuspend شظايا استقرت الأنسجة .
  10. إرفاق gentleMACS C أنبوب رأسا على عقب على الكم من Dissociator gentleMACS وتشغيل البرنامج gentleMACS "h_tumor_03".
  11. فصل أنبوب C gentleMACS من العينة، dissociator إعادة تعليق وتطبيق التعليق الخلية إلى خلية مصفاة ميكرومتر 70 وضعت على أنبوب 50 مل. إذا انسداد الفلتر يحدث، وإثارة التعليق الخلية مع تلميح مرشح معقمة حتى التعليق الكامل من خلال ركض.
  12. شطف مصفاة الخلية مع 5 مل المتوسطة الكم 263.
  13. اختياري: إذا كنت لا تزال شظايا الأنسجة المتبقية في شظايا، فلتر resuspend في المتوسط ​​263 الكم والبذور منهم في ديس خلية ثقافة المناسبةح. احتضان عند 37 درجة شظايا C و 5٪ CO 2.
  14. تجاهل مصفاة الخلية وإغلاق أنبوب 50 مل مع التعليق الخلية هضمها. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 300 XG وتجاهل طاف.
  15. اختياري: إذا الخلية بيليه يظهر الحمراء بسبب وجود كمية عالية من كرات الدم الحمراء إعداد 1X خلايا الدم الحمراء عن طريق تمييع الحل يزيس 1:10 10X حل في الماء المقطر المزدوج، إعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر PBS وإضافة 5 مل 1X خلايا الدم الحمراء يزيس الحل. دوامة 5 ثانية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG وتجاهل طاف.
  16. إعادة تعليق الخلايا السرطانية مع 263 الكم والبذور الخلايا في خلية المناسبة قارورة الثقافة. الخلايا السرطانية في الثقافة 37 ° C و 5٪ CO 2 و الخلايا مرور روتينية عندما تصل إلى نقطة التقاء 80٪.

3. توصيف الثقافة الخلية الأولية واستنفاد الخلايا الليفية

  1. تحليل الأساسي باستخدام زراعة الخلايا ظاهريا على microscoبي.
  2. حصاد كمية صغيرة (0.5x 10 6 خلايا) من زراعة الخلايا الأولية وأداء RT-PCR مع الاشعال للرمي، سرطان الجلد، الخلايا الجذعية، والجينات سدى علامة الخلية. الجينات لتحليل أهم CD90 هي (علامة الخلايا الليفية)، TYR (سرطان الجلد / علامة الخلايا الصباغية)، CD133 (سرطان الخلايا الجذعية علامة)، CD83 (علامة للحصول على الخلايا الجذعية الناضجة) والجينات التدبير المنزلي (مثل HPRT أو GAPDH).
  3. إذا كان التحليل المجهري والتعبير عالية من CD90 خلال RT-PCR كشفت عن وجود تلوث شديد للثقافة سرطان الجلد مع الخلايا الليفية الأولية، تحتاج إلى استنزاف الخلايا الليفية باستخدام MicroBeads مكافحة الخلايا الليفية وأعمدة D من Miltenyi.

4. المغناطيسي الفرز الخلية من CD133 + وCD133 - خلايا سرطان الجلد باستخدام أعمدة LS

  1. إعداد MACS العازلة التي تحتوي على 2 مم EDTA وFCS 5٪ في برنامج تلفزيوني. مزيج من قلب عازلة ومعقمة باستخدام الترشيح، 0،22 ميكرون وحدة تصفية Steritop-GP. البرد عازلة ل4-8 ° Cوديغا قبل الاستخدام.
  2. قبل الدافئة Accutase، PBS الكم والمتوسطة 263 حتي 37 ° C.
  3. غسل الخلايا متموجة 80٪ مع PBS. إضافة كمية مناسبة من Accutase واحتضان الخلايا حتى فصل من سطح الثقافة. جمع الخلايا في أنبوب 50 مل باستخدام الكم 263 متوسطة.
  4. تحديد عدد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي العدد المطلوب من الخلايا (وفقا لبروتوكول Miltenyi ليمكن تحميل أكبر عدد ممكن من 2X الخلايا 9 10 لكل عمود LS. ينبغي تحديد خلية خط الأعداد الأمثل محددة، ويمكن أن يكون أقل من ذلك بكثير.) لمدة 5 دقائق في 300 XG ° C. و 4-8 نضح طاف تماما.
  5. إعادة تعليق بحد أقصى 10 8 خلايا 1X العازلة مع 350 ميكرولتر MACS (للأرقام أعلى الخلية توسيع نطاق جميع العازلة MACS التالية، FCR الكاشف الحظر، وCD133/1-Biotin MicroBeads المضادة للكميات البيوتين وفقا لذلك).
  6. إضافة 100 ميكرولتر الكاشف FCR الحظر.
  7. إضافة 50 ميكرولتر CD133/1-Biotin. تخلط جيدا باستخدام الدوامة واحتضان 4-8 في ° C Fأو 10 دقيقة.
  8. غسل الخلايا بإضافة 10 مل العازلة MACS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG ° C. و 4-8 نضح طاف تماما.
  9. كرر الخطوة غسل (4.8)
  10. إعادة تعليق بيليه الخلية مع 400 ميكرولتر العازلة MACS.
  11. إضافة 100 ميكرولتر مكافحة البيوتين MicroBeads. تخلط جيدا باستخدام الدوامة واحتضان 4-8 في درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  12. وفي الوقت نفسه، تعد الفاصل MACS للمغناطيس. إرفاق QuadroMACS للوقوف فاصل MACS موضوع. إدراج العدد المطلوب من الأعمدة LS مع أجنحة العمود إلى الأمام في المجال المغناطيسي للQuadroMACS. وضع فلتر قبل فصل (مع 30 ميكرومتر شبكة النايلون) في كل عمود وLS أنبوب جمع المناسبة (15 مل أو 50 مل) تحت كل عمود. إعداد تصفية والعمود وذلك بدهن مع 3 مل العازلة MACS. تجاهل التدفق من خلال.
  13. غسل الخلايا بإضافة 10 مل العازلة MACS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG ° C. و 4-8 نضح طاف تماما.
  14. إعادة تعليق الخلايا مع 500 ميكرولترMACS العازلة وتطبيق التعليق على الخلية العمود LS مع تصفية ما قبل الانفصال.
  15. يغسل ثلاث مرات مع 3 مل العازلة MACS لكل عمود. فقط إضافة جديدة عازلة عند الخزان عمود فارغ.
  16. جمع النفايات السائلة مجموع يحتوي على CD133 لا تحمل علامات - جزء الخلية.
  17. تجاهل ما قبل تصفية الفاصل، إزالة عمود من الفاصل ووضعه على أنبوب جمع مناسبة.
  18. 5 تطبيق العازلة MACS مل. طرد فورا من العلامات الخلايا CD133 + عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود.
  19. لزيادة نسبة نقاء السلبية، وتطبيق التعليق على الخلية عمود LS معايرتها الجديدة المدرجة في QuadroMACS. النفايات السائلة تحتوي على CD133 - الكسر.
  20. تجاهل الأعمدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

إعداد الخلايا واحد من الأنسجة الورم

الشكل 2 مثالا على الانبثاث العقدة الليمفاوية مقطوعة لمريض سرطان الجلد في وقت متأخر قبل المرحلة (A) وبعد تفكك الميكانيكية (B) إلى قطع مم 2-4. بعد تفكك الأنزيمية من النسيج والترشيح من خلال شبكة ميكرومتر النايلون 70، كانت الخلايا مكعبات وتجاهل طاف. في هذه الخطوة لاحظنا وجود تلوث عالية مع كرات الدم الحمراء كما يدل على ذلك اللون المحمر من بيليه خلية في الشكل 2C. في وقت لاحق، ونحن المنضب في خلايا الدم الحمراء، مما أدى إلى بيليه خلية من بني فاتح اللون (الشكل 2D). وهذه الخلايا معلق ومثقف مع الكم المتوسطة 263 في 37 ° C و 5٪ CO 2.

توصيف مزارع الخلايا الأولية

للتحقق من صحة ما إذا كانت الخلايا السرطانية تنشأ من وليس من المناطق المحيطة سدى، أجرينا RT-PCRمن melanocyte/melanoma-، الخلايا الليفية، شجيري والجينات الجذعية علامة الخلية. الخلايا الصباغية الكبار بمثابة الخلايا الطبيعية للتحكم TYR وسرطان الخلية الجنينية NCCIT خط والسيطرة الإيجابية للعلامة الخلية الجذعية CD133. كشفت نتائج PCR، كما هو موضح في الشكل 3، أن بعض الخلايا الأولية هي في الواقع من أصل الصباغية (إيجابية لTYR) وسلبية للعلامة من الخلايا الجذعية الناضجة (CD83). وعلاوة على ذلك، تم العثور على سرطان الجلد لخطوط الخلايا CD133 السريع، جين حاسم لانقسام الخلايا غير المتماثلة والجذعية السرطانية المعروفة علامة الخلية. كما تم استخدام HPRT التحميل السيطرة.

في البداية، وثقافة الخلية الأولية الواردة أيضا تلوث عالية مع الخلايا الليفية كما يدل على ذلك ارتفاع CD90 التعبير (الشكل 3 اليسرى، لوحة العلوي).

بعد استنفاد الخلايا الليفية، الخلايا هذه الثقافة الواردة TYR فقط + خلية سرطان الجلدق وليس أكثر من الخلايا الليفية (CD90 -) (الشكل 3 الأيسر، اللوحة السفلى). يمكن تأكيد عدم وجود الخلايا الليفية عن طريق الفحص المجهري brightfield، كما هو موضح في الشكل 4.

المغناطيسية الخلية فرز CD133 + وCD133 - خلايا سرطان الجلد

يمكن فرز خلايا سرطان الجلد الأولية، التي تظهر CD133 التعبير كما أشارت إلى ذلك RT-PCR في CD133 + وCD133 - الخلايا. مع بروتوكول تعديل من أدوات غير المباشرة Microbead CD133، بدرجة نقاء عالية (> 99،75٪) والعائد من CD133 + وCD133-كسور، فضلا عن قابلية عالية على حد سواء الكسور بعد الفرز، ويتحقق. وينبغي دائما فعالية الفرز والنقاء لم يتأكد من تلطيخ immunofluoresence أو تحليل لطخة غربية كما هو موضح في الشكل 5A وB.

الشكل 1 الشكل 1. الخطة الشاملة للتجربة. الابتدائية زراعة الخلايا سرطان الجلد وعزل CD133 + المفترضة الخلايا الجذعية السرطانية يشمل استئصال ورم من التفكك تليها الميكانيكية والأنزيمية للخلايا الورم باستخدام مزيج التفكك مع الدناز I وكولاجيناز الرابع وDissociator gentleMACS. إذا الملوثة للغاية الخلايا السرطانية مع خلايا الدم الحمراء، ويوصى خطوة استنزاف كرات الدم الحمراء. ثم يجب أن الخلايا الأولية مثقف يتسم مجهرية وتحليل RT-PCR للتأكد مما اذا كانت خلايا سرطان الجلد. يمكن إزالة التلوث A عالية مع الخلايا الليفية يتبين من التعبير عن CD90 من استنفاد الخلايا الليفية باستخدام Miltenyi لمكافحة الخلايا الليفية microbeads. وأخيرا، يمكن CD133 + وسرطان الجلد خلايا CD133 تكون مجزأة غير المباشرة باستخدام CD133 الإنسان كيت الصغرى، حبة من Miltenyi. بعد الفرز، ويؤكد النقاء وCD133 + علىويمكن تحليل د CD133-سرطان الجلد الكسور جنبا إلى جنب.

الشكل 2
الشكل 2. إعداد الخلايا واحد من نسيج الورم. A: B عينة من ورم خبيث سرطان الجلد مقطوعة قبل التفكك إلى خلايا واحد:. الانبثاث سرطان الجلد بعد التفكك الميكانيكية للأنسجة الورم إلى أجزاء 2-4 مم باستخدام اثنين من المشارط العقيمة C: بيليه واحد من الخلايا الملوثة للغاية مع خلايا الدم الحمراء D. : بيليه واحد من الخلايا بعد استنفاد كرات الدم الحمراء.

الشكل 3
الشكل 3. تحليل التعبير عن الثقافات الخلية الأولية. RT-PCR تحليل الجينات المتعلقة بإنتاج الميلانين (TYR)، علامة الخلايا الليفية (CD90)، علامة الخلية الجذعية ( وأظهرت CD83) والجينات حاسمة لانقسام الخلايا غير المتماثلة (CD133) أن في البداية، ثقافة الخلية الأولية الواردة CD133 + خلايا سرطان الجلد (TYR +) وليس الخلايا الجذعية (CD83) ولكن كانت ملوثة للغاية مع الخلايا الليفية (CD90 +) (اليسار، لوحة العلوي) . استنفاد الخلايا الليفية التالية الواردة هذه الثقافة الخلية فقط TYR + CD90-سرطان الجلد والخلايا (يسار، اللوحة السفلى). كما تم استخدام HPRT التحميل السيطرة. NCCIT والخلايا الصباغية الكبار شغل منصب مراقبة إيجابية للCD133 وTYR، على التوالي.

الشكل 4
الشكل 4. Micrographs الثقافات الخلية الأولية قبل وبعد استنفاد الخلايا الليفية. A: صورة مجهرية Brightfield ثقافة الخلية الأولية الملوثة للغاية مع الخلايا الليفية B:. Brightfield صورة مجهرية من نفس الابتدائي سرطان الجلد زراعة الخلايا الليفية بعد نضوب.

e_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل 5
الشكل 5. التحقق من MACS عبر تلطيخ المناعي والغربية النشاف. A: micrographs المناعي من خلايا سرطان الجلد 24 ساعة بعد الفرز مع مجموعة غير المباشرة Microbead CD133 من Miltenyi. خلايا المصنف على تغطية زلات وملطخة CD133 / 1 (W6B3C1) الأجسام المضادة تليها الحضانة مع فلور اليكسا 488 الأضداد المضادة للأرنب الماعز الثانوية. فقط في جزء CD133 + لوحظ وجود إشارة محددة على غشاء الخلية كما يتبين من السهام البيضاء (اللوحة اليمنى). لم CD133 خلايا لا وصمة عار لوجود البروتين (اللوحة اليمنى) B: تأكيد نقاء الترتيب بواسطة الغربية الفلورسنت الكمية النشاف. تم الكشف عن إشارة قوية CD133 + في جزء CD133، في حين لوحظ وجود ضعيف جدا CD133 التعبير في اله CD133-السكان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

من أجل إزالة التلوث من كرات الدم الحمراء بيليه الخلايا السرطانية نوصي بشدة باستخدام خلايا الدم الحمراء تحلل من حل Miltenyi. مزايا lysing في الكريات الحمراء خلال الطرد المركزي Ficoll التقليدية التدرج الكثافة هي أنه من أسرع وأبسط. وعلاوة على ذلك، يتم تجنب التلوث مع Ficoll أو خلايا الدم الحمراء وفقدان الخلايا السرطانية. وينبغي عند مراقبة نمو الخلايا الليفية في المزارع الخلوية الأولية إزالتها على الفور لأنها عادة كسا الأرض الخلايا السرطانية عند انتظار طويل جدا.

عندما يكون الترتيب مع تقنية خلايا MACS Miltenyi في نوصي حصاد الخلايا إنزيمي. قد باستخدام مكشطة الخلية تكون ألطف إلى الخلايا والحواتم سطحها، ولكن أيضا إنتاج أجزاء الخلية، التي تربط nonspecifically إلى الأعمدة MACS وتسد الأعمدة. مزايا Accutase بشأن معاملة التربسين / EDTA التقليدية تشمل خفض التوتر الخلية، لياقرع لتحسين السلامة والمخاطر التقليل من إدخال وكلاء العرضي في مزارع الخلايا. إعداد Accutase لا يحتوي على أي بروتينات أو الثدييات المؤتلف البكتيريا 28.

يجب وضع حد أقصى لمنع الأجسام المضادة على سطح الخلية ووضع العلامات غير محددة خلية واحدة تعمل بسرعة، والحفاظ على الخلايا الباردة واستخدام ما قبل المبردة الحلول. يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات الحضانة في 2-8 درجة مئوية، ولكن ليس على الجليد درجات حرارة منخفضة منذ قد تزيد مرات الحضانة. يجب تحديد عدد الخلايا في العمود مثالية لكل خلية ثقافة جديدة. في مختبرنا عملنا مع خطوط الخلايا سرطان الجلد حيث يمكن تطبيق عدد من الخلايا أقصى 4X الخلايا في العمود 7 10 LS. لم أعمدة MS لا تعمل على الإطلاق لهذا نوع من الخلايا. لخلايا كبيرة جدا Miltenyi كما يوفر أعمدة الخلية الكبيرة، التي ينبغي أن تستخدم بدلا من ذلك.

المخزن المؤقت MACS موصى بها من قبل Miltenyi يحتوي على 2 ملم وBSA EDTA 0.5٪ في برنامج تلفزيوني. إذا انخفض على طريقبيليتي من الخلايا بعد الفرز المغناطيسي لوحظ، وهذا يمكن أن يكون نتيجة ل/ وBSA أو EDTA في المخزن المؤقت. يمكن لتحسين قابلية الخلية BSA تحل محلها FCS 5٪، وهو عادة السكوت أفضل من BSA. ويمكن إهماله EDTA في المخزن المؤقت MACS لزيادة قابلية الخلية ولكن سيقلل من نقاء الفرز بنسبة 2-3٪.

يجب التخلص MACS العازلة المستخدمة لتتوازن الأعمدة. فمن غير المستحسن لجمع الخلايا فرزها في موازنة هذا الحل لأنها يمكن أن تدمر خلايا. بدلا من ذلك، يتم جمع الخلايا مصنفة في أنبوب المتوفرة مع ثقافة المتوسط ​​لتحقيق الاستقرار في الخلايا مباشرة بعد الفرز.

لتجنب انسداد الأعمدة من المهم للحصول على تعليق وحيد الخلية قبل الفرز المغناطيسي عن طريق تمرير الخلايا من خلال شبكة ميكرومتر النايلون 30 (= قبل فصل فلاتر). لزيادة نسبة نقاء السلبية، والجولة الثانية من خلال الطازجة، العمود LS معايرتها أو عمود حتى LD(= لاستنفاد الخلايا) ويقترح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgments

أشكر الأستاذ الكتاب M. Dietel وديرك شوماخر لدعم هذا العمل وقراءة نقدية للمخطوطة.

تلقت البحوث التي تؤدي إلى هذه النتائج بدعم من مبادرة مبتكرة التعهد الأدوية المشتركة في إطار اتفاقية المنحة رقم 115234، والموارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) والشركات EFPIA 'في مساهمة عينية. كما أيد هذا العمل من قبل Krebsgesellschaft برلين (BKG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).
زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133<sup&gt; +</sup&gt; خلايا الجذعية السرطانية المزعومين من الميلانوما
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter