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Medicine

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133 doi: 10.3791/50200 Published: March 13, 2013

Summary

Cet article décrit la préparation de tissus mélanome fraîchement obtenu dans des cultures de cellules primaires, et comment supprimer les contaminations des érythrocytes et des fibroblastes à partir des cellules tumorales. Enfin, nous décrivons comment CD133

Abstract

Malgré l'existence de traitements améliorés pour les mélanomes disponibles aujourd'hui, les patients atteints de mélanome malin avancé encore un mauvais pronostic pour la survie sans progression et globale. Par conséquent, la recherche translationnelle doit fournir une preuve supplémentaire moléculaire pour améliorer les thérapies ciblées pour les mélanomes malins. Dans le passé, les mécanismes oncogéniques liés au mélanome ont été largement étudiées dans des lignées cellulaires établies. Sur le chemin de traitements plus personnalisés basés sur les profils génétiques, nous proposons d'utiliser des lignées cellulaires dérivées de patients au lieu de lignées cellulaires génériques. Avec les données cliniques de haute qualité, en particulier sur le suivi des patients, ces cellules seront déterminants afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine la progression du mélanome.

Ici, nous présentons la mise en place des cultures de mélanomes primaires de tissu tumoral frais disséqués. Cette procédure comprend le hachage et la dissociation du tissu dans des cellules individuelles, reDépose des contaminations avec des érythrocytes et des fibroblastes ainsi que la culture primaire et de vérification fiable de l'origine des cellules de mélanome.

De récents rapports ont révélé que les mélanomes, comme la plupart des tumeurs, le port d'une petite sous-population de cellules souches cancéreuses (CSC), qui semblent exclusivement alimenter l'initiation et la progression tumorale vers le stade métastatique. L'un des principaux marqueurs pour l'identification et l'isolement du SCC dans le mélanome est CD133. Pour isoler CD133 + CSC à partir de cultures primaires de mélanome, nous avons modifié et optimisé le tri cellulaire magnétique actif (MACS) procédure de Miltenyi résultant de la pureté de tri haute et la viabilité de CD133 + et CD133 CSC - en vrac, ce qui peut être cultivée et fonctionnellement analysé par la suite.

Introduction

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Mélanomes malins cutanés sont le type le moins fréquent, encore plus mortelle de cancer de la peau. En raison d'une incidence croissante, un haut grade de malignité et d'une diffusion rapide, les mélanomes comptent maintenant pour 75% des tumeurs malignes de la peau liées 1,2 décès. En plus de l'exérèse chirurgicale de la tumeur primitive, chimiothérapie, radiothérapie, immunothérapie et combiné chimio-immunothérapie du mélanome et des métastases sont les stratégies state-of-the-art pour le traitement du mélanome 3,4. Toutefois, le mélanome malin est caractérisée par une faible réponse aux agents chimiothérapeutiques (5-12%) 5,6, et seulement ceux 50-70% de patients atteints de mélanome portant le gène BRAF V600E avantage mutation du gène de promettre de nouvelles thérapies ciblées que le traitement avec vemurafenib 7 Pour améliorer la survie globale, une meilleure compréhension des mécanismes de la tumorigenèse du mélanome est nécessaire.

Pour étudier ces mécanismes dans le passé, bien établi commercialement des lignées cellulaires disponibles ont été utilisés. Des approches plus récentes pour étudier les événements moléculaires de l'initiation et la progression du cancer utilisent des cultures primaires dérivées directement à partir de tissu tumoral - une stratégie avantages multiples paliers: Le chercheur a le plein contrôle du patient et de la sélection des tissus. Les cellules prélevées acquise dans le tissu tumoral sélectionnés par des experts, ressemblent à la tumeur avec tout son hétérogénéité et de suivi des données du patient et une pathologie détaillée est disponible pour permettre aux caractéristiques de la culture à comparer avec ceux de la tumeur d'origine 8.

En revanche, l'utilisation de lignées cellulaires établies comme des systèmes modèles pertinents en recherche sur le cancer est l'objet de controverses. Déjà en 1987, Osborne et ses collègues ont décrit des différences biologiques entre les MCF-7 lignes cellulaires cancéreuses mammaires de différents laboratoires 9. Cette instabilité génomique vaste et la variation de l'expression des ARN au cours de la sous-culture a été confirmed par Hiorns et al. ont fourni des données et de soutien pour preuve que les lignées cellulaires ne évoluera dans la culture, ce qui affaiblit la pertinence directe de ces cultures établies comme des modèles du cancer humain 10.

Une autre considération importante, qui a été largement ignoré au cours des années, est le risque de contamination ou de prolifération de cultures sans rapport avec «fausses» les cellules, ce qui a d'abord été mis en évidence il ya vingt ans, en démontrant qu'un grand nombre de lignées de cellules HeLa ont été contaminés par 8,11 cellules. La mauvaise interprétation des données de «faux» des lignées cellulaires a récemment mis au jour dans la littérature à nouveau. En utilisant une combinaison de profilage de l'ADN et la cytogénétique moléculaire, MacLeod et al. Ont révélé que de 252 nouveaux dérivées de tumeurs des lignées cellulaires humaines déposé à la Collection allemande de microorganismes et de cultures cellulaires (DSMZ), près de 18% ont été jugés intraspécifique ou interspécifique croix -contaminants 12,13.

Pour éviter ces problèmes et de faire usage des avantages mentionnés ci-dessus, nous avons décidé de mettre en place à faible passage des lignées de cellules de mélanome de métastases fraîchement excisées.

Robustes cellulaires technologies de séparation et d'analyse nécessitent unicellulaires préparations destinées à être produite tout en limitant la mort cellulaire et la destruction des protéines de surface caractéristiques. Un instrument de paillasse pour la dissociation automatisée des tissus dans une seule cellule suspensions est le Dissociator gentleMACS fabriqué par Miltenyi. Lorsqu'il est utilisé en combinaison avec gentleMACS C Tubes et optimisé solutions dissociation, une dissociation efficace et doux de tissu tumoral dans un système fermé est obtenu tout en préservant épitopes d'antigènes et de réduire la perte de cellules. L'instrument offre optimisées, programmes pré-établis pour une variété d'applications spécifiques et des garanties de préparation standardisée des suspensions unicellulaires à partir de 14 tissus mélanome.

<p class = "jove_content"> De récents rapports ont révélé que la majorité des tumeurs abritent une petite sous-population de ce qu'on appelle les cellules souches cancéreuses (CSC), qui présentent exclusivement des tumeurs initiation et la capacité d'auto-renouvellement. L'identification des cellules souches des mélanocytes qui produisent dans le derme de la peau conduit à l'hypothèse que ces cellules pourraient être à l'origine des cellules souches cancéreuses (CSC) dans le mélanome depuis l'exposition aux UVA peut amorcer ces cellules pour la transformation maligne 15. Le résultat d'une telle lésion génétique serait cellules qui abritent une combinaison de caractéristiques de la tumeur et les cellules souches.

L'un des marqueurs principaux proposés pour représenter la sous-population des CSC dans le mélanome est CD133 16-20. CD133 (également connu sous le nom prominine 1), un membre de glycoprotéines transmembranaires PENTASPAN, est exprimé dans les cellules souches hématopoïétiques, les cellules progénitrices endothéliales, les cellules souches neuronales et gliales 21-23. L'expression de CD133 est en corrélation avecla division cellulaire asymétrique 24, et l'épitope glycosylé de CD133 a été montré pour être régulée à la baisse sur 25 différenciation cellulaire. Récemment, CD133 + cellules de mélanome ont été montré pour avoir l'auto-renouvellement et la tumeur initiation capacité de 19,20.

Pour étudier la fonction de CD133 + mélanome putatif CSC, nous avons modifié et optimisé le tri cellulaire magnétique actif (MACS) système de Miltenyi Biotech pour obtenir des populations hautement enrichi et viable de CD133 et CD133 + - cellules.

Séparation magnétique de cellules à base de billes permet soit la sélection négative comme le montre Matheu et al. 26 ou la sélection positive comme nous le montrons ici. Lors de la sélection du type positif cellule cible particulière, par exemple des cellules exprimant CD133, est marqué magnétiquement avec des microbilles, des particules superparamagnétiques 50-nm qui sont conjugués à des anticorps très spécifiques contre unparticulier antigène de surface cellulaire. Lors de la séparation, les cellules marquées magnétiquement sont retenus à l'intérieur de la colonne dans le champ magnétique du séparateur, tandis que les cellules non marquées de les traverser. À la suite des étapes de lavage, la colonne est retirée du champ magnétique du séparateur, et les cellules cibles sont éluées de la colonne. Le LS ou colonnes MS utilisé pendant résultat de la sélection positive en fractions de cellules marquées et non marquées avec une grande pureté. D'autre part, les colonnes LD, utilisés pour la sélection négative, conduisent à une pureté légèrement inférieure de la fraction marquée. En raison de la plus dense d'emballage de leur matrice du débit dans ces colonnes est inférieur résultant en un risque plus élevé de cellules non marquées à être piégés dans la colonne. Colonnes LD devrait donc être utilisé que pour l'épuisement sévère d'une sous-population de cellules indésirables. Sélection positive peut être réalisée par marquage magnétique directe (anticorps couplé à des microbilles) ou indirecte (incubation avec des microbilles suivant la incubation avec l'anticorps primaire). Spécifiques microbilles MACS sont disponibles pour la sélection positive de nombreux types cellulaires de cellules tumorales primaires comme la prostate ou de mélanome 27.

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Protocol

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Le schéma global de l'expérience, y compris la préparation des primaires simples cellules du tissu tumoral, la caractérisation de la culture cellulaire primaire, l'épuisement des fibroblastes et le tri magnétique de cellules CD133 + et du CD133 - cellules de mélanome est illustré à la figure 1.

1. Acquisition d'échantillon

  1. Vérifiez l'approbation éthique avant d'envisager les prochaines étapes.
  2. Préparer un tube de 50 ml avec du PBS stérile additionné de 1% de pénicilline-streptomycine concentration finale et le remettra à la chirurgie ou l'équipe.
  3. Organiser le transport rapide de tissu tumoral à partir de la chirurgie de laboratoire de culture cellulaire à 4 ° C.

2. Préparation primaires mélanome simples cellules de tissus tumoraux

  1. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles.
  2. Avant la résection de la tumeur, il faut préparer le mélange de dissociation. 10 ml de dissociation mélange par 4.2 g de tissu est nécessaire. Le mélange peut être utilisé imméTely ou stockés dans aliquotes de 10 ml à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
    1. Préparer une solution contenant 150 mM de chlorure de sodium. Mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution soit limpide. Si nécessaire stérile de chlorure de sodium solution de filtrat en utilisant un filtre de 0,22 um.
    2. Peser la DNase I et de préparer une solution contenant 10 mg / ml de DNase I dans du chlorure de sodium 150 mM. Mélanger en retournant jusqu'à ce que la solution soit limpide.
    3. Préparer une solution contenant 100mg/ml collagénase IV dans du PBS. Mélanger en retournant jusqu'à ce que la solution soit limpide. Des aliquotes de solution de collagénase peut être conservé à -20 ° C pendant plusieurs mois.
    4. Préparer le mélange de dissociation avec une concentration finale de 1% de pénicilline-streptomycine, 1 mg / ml de collagénase IV et 0,1 mg / ml de DNase I dans Quantum 263 à moyen terme. Mélanger à l'aide d'un vortex. En option: lors de l'utilisation des tissus provenant de mélanome cutané ajouter une solution d'amphotéricine B pour la dissociation de mélange une concentration finale de 1,5 pg / ml d'amphotéricine B.
  3. Préchauffer le required quantités de dissociation mélange, PBS et 263 Quantum moyenne à 37 ° C.
  4. Tissu tumoral lieu sur une boîte de Pétri stérile. Aspirer la solution excessive du tissu et ajouter 500 ul mélange de dissociation. Mince tumeur en petits morceaux de 2-4 mm en utilisant fraîches, scalpels stériles.
  5. Transfert 2-4 g hachée tissu tumoral dans un tube gentleMACS C contenant 5 ml de dissociation mélange. Rincer boîte de Pétri avec supplémentaire de 4,5 ml mélange de dissociation et d'ajouter des fragments de tissu restant sur le tube de gentleMACS C.
  6. Fermer gentleMACS C tube et le fixer à l'envers sur le manchon de la Dissociator gentleMACS. Exécutez le programme gentleMACS "h_tumor_01".
  7. Détachez le tube gentleMACS C de la dissociateur et incuber l'échantillon pendant 30 min à 37 ° C sous rotation continue avec le Rotator Tube MACSmix sur la plus grande vitesse d'exécution (12 min) ou en tournant le tube manuellement toutes les 5 minutes pour remettre en suspension les fragments de tissus sont installés .
  8. Fixez gentleMACS C tube renversé sur la douille de til gentleMACS Dissociator et exécutez le programme gentleMACS "h_tumor_02".
  9. Détachez le tube gentleMACS C de la dissociateur et incuber l'échantillon pendant 30 min à 37 ° C sous rotation continue avec le Rotator Tube MACSmix sur la plus grande vitesse d'exécution (12 min) ou en tournant le tube manuellement toutes les 5 minutes pour remettre en suspension les fragments de tissus sont installés .
  10. Fixez gentleMACS C tube renversé sur le manche de la Dissociator gentleMACS et exécutez le programme gentleMACS "h_tumor_03".
  11. Détacher le tube gentleMACS C du dissociateur, remettre en suspension d'échantillon et d'appliquer la suspension de cellules à une crépine 70 um cellule placée sur un tube de 50 ml. Si le colmatage du filtre se produit, mélanger la suspension cellulaire avec un embout stérile filtre jusqu'à ce que la suspension complète traversait.
  12. Rincer la crépine cellule avec 5 ml de milieu Quantum 263.
  13. Facultatif: si vous avez encore des fragments de tissus laissés dans le filtre, les fragments de remettre en suspension dans 263 Quantum moyennes et les graines dans une culture cellulaire appropriée dish. Incuber les fragments à 37 ° C et 5% de CO 2.
  14. Jeter tamis cellulaire et fermer le tube de 50 ml de la suspension cellulaire digéré. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 300 xg et éliminer le surnageant.
  15. Facultatif: si culot cellulaire apparaît en rouge en raison d'une grande quantité de globules rouges préparer 1x Solution lyse des globules rouges par dilution de 1:10 solution 10x dans de l'eau bidistillée, remettre en suspension culot cellulaire dans 500 ul de PBS et ajouter 5 ml 1x lyse de globules rouges Solution. Vortex 5 secondes et incuber à température ambiante pendant 10 min. Centrifuger pendant 5 min à 300 xg et éliminer le surnageant.
  16. Remettre en suspension les cellules tumorales avec Quantum 263 et épépiner les cellules dans le flacon de culture cellulaire appropriée. Cellules tumorales de culture à 37 ° C et 5% de CO 2 et de cellules de passage systématiquement quand ils atteignent 80% de confluence.

3. Caractérisation de la culture cellulaire primaire et l'appauvrissement des fibroblastes

  1. Analyser culture primaire de cellules phénotypiquement l'aide d'un microscope.
  2. Récolter une petite quantité (0,5 x 10 6 cellules) de la culture de cellules primaires et effectuer RT-PCR avec des amorces pour néoplasiques-, le mélanome, les cellules souches-et-gènes marqueurs de cellules du stroma. Les gènes les plus importants à analyser sont CD90 (marqueur des fibroblastes), TYR (mélanome / marqueur mélanocytes), CD133 (marqueur de cellules souches du cancer), CD83 (marqueur des cellules dendritiques matures) et un gène de ménage (par exemple HPRT ou GAPDH).
  3. Si l'analyse microscopique et une expression élevée de CD90 au cours de RT-PCR a révélé une forte contamination de la culture mélanome primaire de fibroblastes, vous avez besoin d'épuiser les fibroblastes en utilisant les microbilles anti-fibroblastes et des colonnes D à partir de Miltenyi.

4. Le tri magnétique de cellules CD133 + et du CD133 - cellules de mélanome utilisation des colonnes LS

  1. Préparer un tampon MACS contenant 2 mM d'EDTA et 5% de FCS dans PBS. Mélanger par inversion et tampon stérile en utilisant un filtrat de 0,22 um Steritop-GP Unité de filtration. Tampon froid à 4-8 ° Cet dégazer avant utilisation.
  2. Préchauffer Accutase, PBS et 263 Quantum moyenne à 37 ° C.
  3. Lavez 80% des cellules confluentes avec du PBS. Ajouter la quantité appropriée de Accutase et incuber jusqu'à ce que les cellules se détachent de la surface de culture. Prélever des cellules dans un tube de 50 ml à l'aide Quantum 263 à moyen terme.
  4. Déterminer le nombre de cellules et centrifuger le nombre requis de cellules (Selon le protocole Miltenyi du nombre maximum de 2x 10 9 cellules peuvent être chargées par la colonne LS. Lignée de cellules spécifiques nombre optimal doit être déterminé et peut être beaucoup plus faible.) Pendant 5 min à 300 xg et 4-8 ° C. Aspirer le surnageant complètement.
  5. Reprendre un maximum de 1x 10 8 cellules avec 350 ul de tampon MACS (pour les numéros de cellulaires plus élevées intensifier tous tampon suivant MACS, réactif FcR blocage, CD133/1-Biotin et anti-Biotine microbilles volumes en conséquence).
  6. Ajouter 100 ul de réactif FcR blocage.
  7. Ajouter 50 ul CD133/1-Biotin. Bien mélanger à l'aide d'un vortex et incuber à 4-8 ° C fou 10 min.
  8. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon MACS et centrifuger pendant 5 min à 300 xg et 4-8 ° C. Aspirer le surnageant complètement.
  9. Répétez étape de lavage (4,8)
  10. Resuspendre culot cellulaire avec 400 ul de tampon MACS.
  11. Ajouter 100 ul anti-Biotine microbilles. Bien mélanger à l'aide d'un vortex et incuber à 4-8 ° C pendant 15 min.
  12. Pendant ce temps, préparer le séparateur MACS pour la séparation magnétique. Fixez QuadroMACS Stand séparateur MACS Multi. Insérer le nombre nécessaire de colonnes LS avec les ailes de colonnes à l'avant dans le champ magnétique de la QuadroMACS. Placez un filtre de pré-séparation (avec 30 mailles de nylon um) dans chaque colonne LS et un tube de collecte approprié (15 ml ou 50 ml) dans chaque colonne. Préparer filtre et la colonne par rinçage avec 3 ml de tampon MACS. Jeter l'éluat.
  13. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon MACS et centrifuger pendant 5 min à 300 xg et 4-8 ° C. Aspirer le surnageant complètement.
  14. Remettre en suspension les cellules avec 500 piMACS tampon et appliquer suspension cellulaire sur la colonne LS avec le filtre de pré-séparation.
  15. Laver trois fois avec 3 ml de tampon MACS par colonne. N'ajoutez nouveau tampon lorsque le réservoir de la colonne est vide.
  16. L'effluent recueilli total contient le CD133 non marqué - fraction cellulaire.
  17. Jeter le filtre de pré-séparation, enlever la colonne du séparateur et le placer sur un tube de collecte approprié.
  18. Appliquer 5 ml de tampon MACS. Rincer immédiatement les cellules marquées CD133 + en poussant fermement le piston dans la colonne.
  19. Pour augmenter la pureté de la fraction négative, appliquer la suspension cellulaire sur une colonne équilibrée LS nouveau inséré dans la QuadroMACS. L'effluent contient le CD133 - fraction.
  20. Jeter colonnes.

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Representative Results

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Préparation de mono-cellules provenant de tissu tumoral

La figure 2 illustre une métastase ganglionnaire résection d'un patient atteint de mélanome stade avancé avant (A) et après (B) dissociation mécanique en 2-4 morceaux mm. Après dissociation enzymatique du tissu et filtration à travers un maillage de 70 um nylon, cellules ont été sédimentées et le surnageant est rejeté. À cette étape, nous avons observé une forte contamination par les globules rouges, comme indiqué par la couleur rougeâtre du culot cellulaire dans la figure 2C. Par la suite, nous avons épuisé les globules rouges, ce qui a entraîné une cellule de la lumière de couleur brun (figure 2D) à granulés. Ces cellules ont été remises en suspension et cultivées avec Quantum 263 milieu à 37 ° C et 5% de CO 2.

Caractérisation des cultures primaires de cellules

Pour vérifier si les cellules proviennent de la tumeur et non pas à partir de stroma environnant, nous avons réalisé une RT-PCRde melanocyte/melanoma-, fibroblastes, dendritique, et les gènes marqueurs des cellules souches. Mélanocytes adultes a servi de contrôle des cellules normales de TYR et le carcinome embryonnaire NCCIT lignée cellulaire comme témoin positif pour le marqueur de cellules souches CD133. Résultats de la PCR, illustré à la figure 3, a révélé que certaines cellules primaires sont en effet d'origine mélanocytaire (positif pour TYR) et sont négatifs pour le marqueur des cellules dendritiques matures (CD83). En outre, les lignées de cellules de mélanome ont été trouvés pour exprimer CD133, un gène indispensable à la division cellulaire asymétrique et un marqueur du cancer connu de cellules souches. HPRT a été utilisé comme contrôle du chargement.

Initialement, la culture de cellules primaires contenait également une forte contamination par les fibroblastes comme indiqué par la forte expression de CD90 (Figure 3 à gauche, en haut).

Après l'épuisement des fibroblastes, cette culture cellulaire contenue seulement TYR + de cellules de mélanomes et pas plus de fibroblastes (CD90 -) (Figure 3 à gauche, panneau inférieur). L'absence de fibroblastes pourrait être confirmé par microscopie en fond clair, comme le montre la figure 4.

Cellule de tri magnétique CD133 + CD133 et - des cellules de mélanome

Cellules de mélanome primaire, qui montrent CD133 expression comme indiqué par RT-PCR peuvent être classés en CD133 + et CD133 - cellules. Avec le protocole modifié de la indirect Kit CD133 microbilles, une pureté élevée (> 99,75%) et le rendement de CD133 + CD133-fractions et, ainsi que d'une viabilité élevée des deux fractions après le tri, est atteint. L'efficacité de tri et de pureté doit toujours être vérifiée par immunofluorescence ou coloration western blot, comme indiqué sur la figure 5A et B.

Figure 1 Figure 1. Schéma d'ensemble de l'expérience. Primaire culture de cellules de mélanome et l'isolement de CD133 + putatifs cellules souches du cancer comprend la résection d'une tumeur suivie par dissociation mécanique et enzymatique des cellules tumorales en utilisant un mélange de dissociation à la DNase I et collagénase IV et la Dissociator gentleMACS. Si les cellules tumorales sont fortement contaminés par des globules rouges, une étape de déplétion érythrocytaire est recommandé. Des cultures de cellules primaires doivent alors être caractérisé par microscopie et analyse RT-PCR pour confirmer si elles sont des cellules de mélanome. Une forte contamination par les fibroblastes indiqué par l'expression de CD90 peut être éliminé par l'épuisement des fibroblastes en utilisant Miltenyi anti-fibroblastes microbilles. Enfin, CD133 + CD133-mélanome et les cellules peuvent être fractionnés en utilisant la indirect CD133 humain Kit Micro-Bead de Miltenyi. Après le tri, la pureté est confirmée et le CD133 + und CD133-mélanome fractions peuvent être analysés côte à côte.

Figure 2
Figure 2. Préparation de mono-cellules provenant de tissu tumoral. A: B Exemple de métastases du mélanome réséqué avant la dissociation dans des cellules individuelles:. Métastases du mélanome après dissociation mécanique du tissu tumoral en 2-4 morceaux mm en utilisant deux scalpels stériles C:. Pellet de cellules individuelles fortement contaminés par des globules rouges D. : Pellet de cellules individuelles après épuisement des érythrocytes.

Figure 3
Figure 3. Analyse de l'expression des cultures de cellules primaires. Analyse RT-PCR des gènes liés à la production de mélanine (TYR), marqueur des fibroblastes (CD90), marqueur des cellules dendritiques ( CD83) et des gènes cruciaux pour la division cellulaire asymétrique (CD133) a montré qu'à l'origine, la culture cellulaire primaire contenue CD133 + cellules de mélanome (TYR +) et pas de cellules dendritiques (CD83-), mais a été fortement contaminés par des fibroblastes (CD90 +) (gauche, panneau supérieur) . L'épuisement des fibroblastes qui suit cette culture cellulaire contenue seulement TYR + et CD90-mélanome cellules (à gauche, en bas). HPRT a été utilisé comme contrôle du chargement. NCCIT et les mélanocytes adultes a servi de témoin positif pour CD133 et TYR, respectivement.

Figure 4
Figure 4. Des micrographies des cultures de cellules primaires avant et après l'épuisement des fibroblastes. A: micrographie Brightfield d'une culture primaire de cellules fortement contaminés par des fibroblastes B:. Brightfield micrographie de la même culture de cellules de mélanome primaire après épuisement des fibroblastes.

e_content "fo: keep-together.within pages =" always "> Figure 5
Figure 5. Vérification de MACS par immunofluorescence et Western blot. A: micrographies immunofluorescence des cellules de mélanome 24 hr après le tri à la indirect CD133 Kit microbilles de Miltenyi. Les cellules ont été ensemencées sur des lamelles et colorées avec CD133 / 1 (W6B3C1) anticorps suivie d'une incubation avec Alexa Fluor 488 de chèvre anti-anticorps de lapin secondaire. Ce n'est que dans la fraction CD133 + un signal spécifique à la membrane cellulaire a été observée, comme indiqué par des flèches blanches (panneau de gauche). CD133-cellules ne tache pas la présence de la protéine (panneau de droite) B:. Confirmation de la pureté de tri par fluorescente quantitative ouest buvard. Une forte CD133 signal n'a été détecté dans la fraction CD133 +, alors qu'une très faible expression de CD133 a été observée chez èmee-CD133 population.

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Discussion

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Afin d'éliminer les contaminations érythrocytaires de la cellule tumorale pellets nous recommandons fortement d'utiliser la solution de lyse des globules rouges à partir de Miltenyi. Les avantages de la lyse des érythrocytes au cours de la centrifugation sur gradient de Ficoll densité traditionnelle est qu'il est plus rapide et plus simple. De plus, les contaminations par Ficoll ou de globules rouges et de la perte des cellules tumorales sont évités. Lorsque vous observez la croissance des fibroblastes dans la culture cellulaire primaire, ils doivent être retirés immédiatement car ils normalement envahir les cellules tumorales lors de l'attente trop longue.

Lors du tri des cellules par la technique de Miltenyi MACS nous recommandons la récolte des cellules par voie enzymatique. L'aide d'un grattoir à cellules pourrait être plus doux pour les cellules et leurs épitopes de surface, mais aussi de produire des fragments de cellules, qui se lient non spécifiquement aux colonnes MACS et obstruer les colonnes. Les avantages de Accutase plus de la traditionnelle trypsine / EDTA traitement comprennent le stress cellulaire réduite, leading à la viabilité améliorée et minimiser les risques d'introduction d'agents adventices dans les cultures cellulaires. La préparation Accutase ne contient pas de protéines de mammifères ou bactériennes recombinantes 28.

Pour éviter plafonnement des anticorps à la surface des cellules et le marquage cellulaire non spécifique il faut travailler vite, garder les cellules froid et utiliser des solutions pré-refroidies. Toutes les étapes d'incubation doivent être effectuées à 2-8 ° C, mais pas sur la glace depuis des températures plus basses peuvent augmenter le temps d'incubation. Le nombre de cellules par colonne idéale doit être déterminée pour chaque culture nouvelle cellule. Dans notre laboratoire, nous avons travaillé avec des lignées de cellules de mélanome où un certain nombre de cellules maximum de 4x 10 7 cellules pourraient être appliquées par colonne LS. Colonnes MS ne fonctionne pas du tout pour ce type de cellule. Pour les cellules de très grandes Miltenyi fournit également des colonnes à grandes cellules, qui doivent être utilisés à la place.

Le tampon MACS recommandé par Miltenyi contient 2 mM d'EDTA et 0,5% de BSA dans du PBS. Si une baisse parbilité des cellules après un tri magnétique est observée, cela pourrait être dû à la BSA et / ou de l'EDTA dans le tampon. Pour améliorer la viabilité des cellules BSA peut être remplacé par 5% de FCS, qui est généralement mieux toléré que le BSA. EDTA dans le tampon MACS peut être omis pour accroître la viabilité de la cellule, mais diminuera la pureté de tri de 2-3%.

Tampon MACS utilisé pour équilibrer les colonnes doivent être mis au rebut. Il n'est pas recommandé de recueillir les cellules triées dans cette solution d'équilibrage car il peut endommager les cellules. Au lieu de cela, les cellules triées doivent être collectés dans un tube fourni avec un milieu de culture pour stabiliser les cellules directement après le tri.

Pour éviter le colmatage des colonnes, il est important d'obtenir une suspension à cellule unique avant le triage magnétique en passant par les cellules à travers une maille de nylon um 30 (= avant sa cessation Filtres). Pour augmenter la pureté de la fraction négative, un deuxième passage une nouvelle colonne LS équilibrée ou même colonne LD(= Pour la déplétion des cellules) est suggérée.

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Disclosures

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Professeur M. Dietel et Dirk Schumacher pour soutenir ce travail et la lecture critique du manuscrit.

Les recherches menant aux présents résultats ont bénéficié du soutien de l'entreprise Initiative médicaments innovants conjoint en vertu de convention de subvention n ° 115234, les ressources qui sont composées de la contribution financière du Programme de l'Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) et les entreprises EFPIA »dans contribution en nature. Ce travail a également été soutenue par le Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

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References

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Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome
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Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

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