Pasient avledet celle Kultur og Isolering av CD133⁺ Antatte kreft stamceller fra melanom

Summary

Denne artikkelen beskriver fremstilling av nystekte oppnådd melanom vevet inn primære cellekulturer, og hvordan å fjerne forurensninger av erytrocytter og fibroblaster fra kreftceller. Til slutt beskriver vi hvordan CD133⁺ Antatte melanom stamceller er sortert fra CD133^- Bulk hjelp Magnetic Aktivert Cell Sortering (MACS).

Abstract

Til tross for bedre behandlinger alternativer for melanom tilgjengelig i dag, pasienter med avansert malignt melanom har fortsatt en dårlig prognose for progresjonsfri og total overlevelse. Derfor må translasjonsforskning å gi ytterligere molekylære bevis for å forbedre målrettet terapi for maligne melanomer. I det siste, onkogene mekanismer knyttet til melanom ble grundig studert i etablerte cellelinjer. På vei til mer personlige behandlingsregimer basert på individuelle genetiske profiler, foreslår vi å bruke pasient-deriverte cellelinjer i stedet for generiske cellelinjer. Sammen med høy kvalitet kliniske data, spesielt på oppfølging av pasientene, vil disse cellene være medvirkende til bedre å forstå de molekylære mekanismene bak melanom progresjon.

Her rapporterer vi etablering av primære melanom kulturer fra dissekert fersk svulstvev. Denne fremgangsmåten inneholder male og dissosiasjon av vevet inn enkeltceller, reFjerning av forurensninger med erytrocytter og fibroblaster samt primær kultur og pålitelig verifisering av cellenes melanom opprinnelse.

Nylige rapporter viste at melanomer, som de fleste svulster, havn en liten undergruppe av kreft stamceller (CSCS), som synes å utelukkende drivstoff startfasen og progresjon mot metastatisk staten. En av de viktigste markører for CSC identifisering og isolering i melanom er CD133. Å isolere CD133 ⁺ CSCS fra primære melanom kulturer, har vi endret og optimalisert Magnetic-Activated Cell Sortering (MACS) prosedyren fra Miltenyi resulterer i høy sortering renhet og levedyktigheten til CD133 ⁺ CSCS og CD133 ^– bulk, som kan dyrkes og funksjonelt analysert etterpå.

Introduction

Kutane maligne melanomer er den minst vanlige, men mest dødelige typen hudkreft. På grunn av en økende forekomst, en høy grad av malignitet og en rask formidling, melanomer nå står for 75% av maligne hudsvulster dødsfall ^1,2. Foruten kirurgisk excision av primærtumor, kjemoterapi, strålebehandling, immunterapi og kombinert kjemo-og immunterapi av metastasized melanom er state-of-the-art strategier for melanom behandling ^3,4. Imidlertid er malignt melanom preget av en dårlig respons på kjemoterapeutika (5-12%) ^5,6, og bare de 50-70% av melanom pasienter bærer BRAF V600E genmutasjon nytte lovende nye målrettede terapier som behandling med vemurafenib ⁷ Slik forbedre total overlevelse, er en mye bedre forståelse av mekanismene for melanom tumorigenesis nødvendig.

Å studere disse mekanismene i det siste, veletablerte kommersiellesielt tilgjengelige cellelinjer ble brukt. Nyere tilnærminger til å studere molekylære hendelser av kreft initiering og progresjon utnytte primærkulturer avledet direkte fra svulstvev – en strategi bærende manifold fordeler: Forskeren har full kontroll over pasienten og vev utvalg. De undersøkte celler fått fra fagmessig valgt svulstvev, ligner svulsten med all heterogenitet sin og oppfølging for pasienten og en detaljert patologi er tilgjengelig for å tillate egenskapene til kultur å bli sammenlignet med dem av den opprinnelige svulsten ^8.

I kontrast, er bruken av etablerte cellelinjer som relevante modellsystemer i kreftforskning diskutert kontroversielt. Allerede i 1987 Osborne og kollegene beskrevet betydelige biologiske forskjeller mellom MCF-7 menneskelige brystkreft cellelinjer fra ulike laboratorier ^9. Denne omfattende genomisk ustabilitet og variasjon i RNA uttrykk under subkultur var confirmed av Hiorns et al. og ga støttende data for bevis for at cellelinjer gjør utvikles i kultur, og dermed svekke den direkte relevansen av slike etablerte kulturer som modeller av menneskelig kreft ^10.

En annen viktig faktor som i stor grad har blitt ignorert gjennom årene, er risikoen for forurensning eller overvekst av kulturer med urelaterte "falske" celler, som først ble markerte over tjue år siden ved å demonstrere at et stort antall av cellelinjer ble forurenset av HeLa celler ^8,11. Feiltolkning av data fra "falske" cellelinjer har nylig kommet frem i lyset i litteraturen igjen. Ved hjelp av en kombinasjon av DNA-profilering og molekylære cytogenetikk avslørte MacLeod et al. At av 252 nye tumor-avledede humane cellelinjer deponert ved den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ), nesten 18% ble funnet å være intraspecies eller interspecies kryss -forurensninger ^12,13.

For å unngå disse problemene og for å gjøre bruk av fordelene nevnt ovenfor, har vi besluttet å etablere lav passasje melanom cellelinjer fra ferske skåret metastaser.

Robust cellen separasjon og analyse teknologier krever encellede forberedelser som skal genereres samtidig begrense celle død og ødeleggelse av karakteristiske overflateproteiner. En Borstemmaskin instrument for automatisert dissosiasjon av vev i encellede suspensjoner er gentleMACS Dissociator produsert av Miltenyi. Når den brukes i kombinasjon med gentleMACS C Rør og optimalisert dissosiasjon løsninger, en effektiv og skånsom dissosiasjon av svulstvev i et lukket system oppnås samtidig bevare antigen epitoper og redusere celletap. Instrumentet tilbyr optimalisert, forhåndsinnstilte programmer for en rekke spesifikke applikasjoner og garantier standardisert forberedelse av encellede suspensjoner fra melanom vev ^14.

<p class = "jove_content"> Nye rapporter viste at flertallet av svulster havn en liten undergruppe av såkalte kreft stamceller (CSCS), som utelukkende utviser tumor-initiere og selv-fornyende kapasitet. Identifiseringen av melanocyte-produserende stamceller i dermis i huden ført til den hypotese at disse cellene kan være opprinnelsen til kreft stamceller (CSCS) i melanom siden eksponering for UVA-stråling kan prime disse cellene for malign transformasjon ^15. Resultatet av en slik en genetisk lesjon ville være celler som er bærere av en kombinasjon av svulst og stamcelleegenskaper.

En av de viktigste markørene kan sies å representere en undergruppe CSCS i melanom er CD133 ^16-20. CD133 (også kjent som Prominin 1), et medlem av pentaspan transmembrane glykoproteiner, er uttrykt i hematopoetiske stamceller, endotelceller progenitorceller, neuronal og glial stamceller ^21-23. Uttrykk for CD133 er korrelert medasymmetrisk celledeling ^24, og den glykosylerte epitop av CD133 ble vist å være downregulated upon celledifferensiering ^25. Nylig ble CD133 ⁺ melanomceller vist seg å ha selvfornyelse og tumor-innvielse kapasitet ^19,20.

Å studere funksjonen til CD133 ⁺ antatte melanom CSCS, har vi endret og optimalisert Magnetic-Activated Cell Sortering (MACS) system fra Miltenyi Biotech å få høyanriket og levedyktige bestander av CD133 ⁺ og CD133 ^– celler.

Magnetisk perle-baserte celleseparasjon tillater enten negativ seleksjon som vist ved Matheu m.fl.. ²⁶ eller positiv utvelgelse som vi viser her. Under positiv utvelgelse bestemt målcellen attraksjon, CD133 f.eks uttrykkende celler, er magnetisk merket med mikroperler, 50-nm superparamagnetiske partikler som er konjugert til høyst spesifikke antistoffer mot etbestemt celleoverflateantigen. Under separasjonen, er magnetisk merkede celler beholdes i kolonnen i det magnetiske feltet av separatoren, mens umerkede celler strømme gjennom. Etter vasketrinnene, er kolonnen fjernet fra magnetfelt av separatoren, og målcellene elueres fra kolonnen. LS eller MS kolonner brukes under positiv utvelgelse resultat i fraksjoner av merkede og umerkede celler med høy renhet. På den annen side, LD kolonner, som brukes for negativ seleksjon, resultere i en litt lavere renhet av den merkede fraksjonen. Grunnet tettere pakking av matrise deres strømningshastigheten i disse kolonnene er lavere resulterende i en høyere risiko for umerkede celler å være fanget i kolonnen. LD kolonner bør derfor bare brukes for strenge uttømming av en uønsket celle undergruppe. Positiv utvelgelse kan utføres ved direkte (antistoff koplet til mikroperler) eller indirekte magnetisk merking (inkubasjon med mikroperler etter incubation med det primære antistoff). Spesifikke MACS mikroperler er tilgjengelig for positiv utvelgelse av tallrike celletyper primære tumorceller som prostata-eller melanom ^27.

Protocol

Den generelle ordningen av eksperimentet inkludert fremstillingen av primære single-celler fra svulstvev, karakterisering av primære cellekulturer fibroblast uttømming og magnetisk celle sortering av CD133 + og CD133 – melanomceller er vist i Figur 1. 1. Prøvetagning Sjekk for etisk godkjenning før man vurderer de neste trinnene. Forbered en 50 ml tube med sterilt PBS supplert med 1% Penicillin-Streptomycin endelig konsentrasjo…

Representative Results

Utarbeidelse av enkelt-celler fra svulstvev Figur 2 eksemplifiserer en reseksjon lymfeknute metastasering av et sent stadium melanom pasient før (A) og etter (B) mekanisk dissosiasjon i 2-4 mm biter. Etter enzymatisk dissosiasjon av vevet og filtrering gjennom en 70 um nylonmesh ble celler pelletert og supernatanten kastes. På dette trinnet ble det observert en høy forurensning med erytrocytter som indikert av det rødlige fargen på cellepellet i fig 2C. De…

Discussion

For å fjerne erytrocytt forurensing fra svulsten cellepelleten vi anbefale å bruke det røde blodlegemer lysis løsning fra Miltenyi. Fordelene med lysering erytrocyttene over den tradisjonelle Ficoll tetthetsgradient sentrifugering er at det er raskere og enklere. Videre er forurensninger med Ficoll eller røde blodceller og tap av tumorceller unngås. Når du observerer veksten av fibroblaster i den primære cellekulturer de bør fjernes umiddelbart siden de normalt overgrow kreftceller når venter for lenge.

<p…

Materials

			Reagent
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water	Sigma-Aldrich, Inc.	A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads	Miltenyi Biotec GmbH	130-050-601
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-395
Collagenase IV	Sigma-Aldrich, Inc.	C5138
DNase I	Applichem GmbH	A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg	PAA Laboratories GmbH	H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich, Inc.	E-7889
FBS Superior	Biochrom	S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-895	Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x)	Invitrogen GmbH	15140-122
Quantum 263	PAA Laboratories GmbH	U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec GmbH	130-094-183
			Equipment
Cell strainer (70 μm)	BD Biosciences	352350
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-237
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-235
MACS Separator Multi Stand	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-401
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-753
Natriumchloride	Merck KGaA	567440-1KG
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES)	Carl Roth GmbH & Co. KG	P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml	Miltenyi Biotec GmbH	SCGPS05RE