Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Pasient avledet celle Kultur og Isolering av CD133 doi: 10.3791/50200 Published: March 13, 2013

Summary

Denne artikkelen beskriver fremstilling av nystekte oppnådd melanom vevet inn primære cellekulturer, og hvordan å fjerne forurensninger av erytrocytter og fibroblaster fra kreftceller. Til slutt beskriver vi hvordan CD133

Abstract

Til tross for bedre behandlinger alternativer for melanom tilgjengelig i dag, pasienter med avansert malignt melanom har fortsatt en dårlig prognose for progresjonsfri og total overlevelse. Derfor må translasjonsforskning å gi ytterligere molekylære bevis for å forbedre målrettet terapi for maligne melanomer. I det siste, onkogene mekanismer knyttet til melanom ble grundig studert i etablerte cellelinjer. På vei til mer personlige behandlingsregimer basert på individuelle genetiske profiler, foreslår vi å bruke pasient-deriverte cellelinjer i stedet for generiske cellelinjer. Sammen med høy kvalitet kliniske data, spesielt på oppfølging av pasientene, vil disse cellene være medvirkende til bedre å forstå de molekylære mekanismene bak melanom progresjon.

Her rapporterer vi etablering av primære melanom kulturer fra dissekert fersk svulstvev. Denne fremgangsmåten inneholder male og dissosiasjon av vevet inn enkeltceller, reFjerning av forurensninger med erytrocytter og fibroblaster samt primær kultur og pålitelig verifisering av cellenes melanom opprinnelse.

Nylige rapporter viste at melanomer, som de fleste svulster, havn en liten undergruppe av kreft stamceller (CSCS), som synes å utelukkende drivstoff startfasen og progresjon mot metastatisk staten. En av de viktigste markører for CSC identifisering og isolering i melanom er CD133. Å isolere CD133 + CSCS fra primære melanom kulturer, har vi endret og optimalisert Magnetic-Activated Cell Sortering (MACS) prosedyren fra Miltenyi resulterer i høy sortering renhet og levedyktigheten til CD133 + CSCS og CD133 - bulk, som kan dyrkes og funksjonelt analysert etterpå.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kutane maligne melanomer er den minst vanlige, men mest dødelige typen hudkreft. På grunn av en økende forekomst, en høy grad av malignitet og en rask formidling, melanomer nå står for 75% av maligne hudsvulster dødsfall 1,2. Foruten kirurgisk excision av primærtumor, kjemoterapi, strålebehandling, immunterapi og kombinert kjemo-og immunterapi av metastasized melanom er state-of-the-art strategier for melanom behandling 3,4. Imidlertid er malignt melanom preget av en dårlig respons på kjemoterapeutika (5-12%) 5,6, og bare de 50-70% av melanom pasienter bærer BRAF V600E genmutasjon nytte lovende nye målrettede terapier som behandling med vemurafenib 7 Slik forbedre total overlevelse, er en mye bedre forståelse av mekanismene for melanom tumorigenesis nødvendig.

Å studere disse mekanismene i det siste, veletablerte kommersiellesielt tilgjengelige cellelinjer ble brukt. Nyere tilnærminger til å studere molekylære hendelser av kreft initiering og progresjon utnytte primærkulturer avledet direkte fra svulstvev - en strategi bærende manifold fordeler: Forskeren har full kontroll over pasienten og vev utvalg. De undersøkte celler fått fra fagmessig valgt svulstvev, ligner svulsten med all heterogenitet sin og oppfølging for pasienten og en detaljert patologi er tilgjengelig for å tillate egenskapene til kultur å bli sammenlignet med dem av den opprinnelige svulsten 8.

I kontrast, er bruken av etablerte cellelinjer som relevante modellsystemer i kreftforskning diskutert kontroversielt. Allerede i 1987 Osborne og kollegene beskrevet betydelige biologiske forskjeller mellom MCF-7 menneskelige brystkreft cellelinjer fra ulike laboratorier 9. Denne omfattende genomisk ustabilitet og variasjon i RNA uttrykk under subkultur var confirmed av Hiorns et al. og ga støttende data for bevis for at cellelinjer gjør utvikles i kultur, og dermed svekke den direkte relevansen av slike etablerte kulturer som modeller av menneskelig kreft 10.

En annen viktig faktor som i stor grad har blitt ignorert gjennom årene, er risikoen for forurensning eller overvekst av kulturer med urelaterte "falske" celler, som først ble markerte over tjue år siden ved å demonstrere at et stort antall av cellelinjer ble forurenset av HeLa celler 8,11. Feiltolkning av data fra "falske" cellelinjer har nylig kommet frem i lyset i litteraturen igjen. Ved hjelp av en kombinasjon av DNA-profilering og molekylære cytogenetikk avslørte MacLeod et al. At av 252 nye tumor-avledede humane cellelinjer deponert ved den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ), nesten 18% ble funnet å være intraspecies eller interspecies kryss -forurensninger 12,13.

For å unngå disse problemene og for å gjøre bruk av fordelene nevnt ovenfor, har vi besluttet å etablere lav passasje melanom cellelinjer fra ferske skåret metastaser.

Robust cellen separasjon og analyse teknologier krever encellede forberedelser som skal genereres samtidig begrense celle død og ødeleggelse av karakteristiske overflateproteiner. En Borstemmaskin instrument for automatisert dissosiasjon av vev i encellede suspensjoner er gentleMACS Dissociator produsert av Miltenyi. Når den brukes i kombinasjon med gentleMACS C Rør og optimalisert dissosiasjon løsninger, en effektiv og skånsom dissosiasjon av svulstvev i et lukket system oppnås samtidig bevare antigen epitoper og redusere celletap. Instrumentet tilbyr optimalisert, forhåndsinnstilte programmer for en rekke spesifikke applikasjoner og garantier standardisert forberedelse av encellede suspensjoner fra melanom vev 14.

<p class = "jove_content"> Nye rapporter viste at flertallet av svulster havn en liten undergruppe av såkalte kreft stamceller (CSCS), som utelukkende utviser tumor-initiere og selv-fornyende kapasitet. Identifiseringen av melanocyte-produserende stamceller i dermis i huden ført til den hypotese at disse cellene kan være opprinnelsen til kreft stamceller (CSCS) i melanom siden eksponering for UVA-stråling kan prime disse cellene for malign transformasjon 15. Resultatet av en slik en genetisk lesjon ville være celler som er bærere av en kombinasjon av svulst og stamcelleegenskaper.

En av de viktigste markørene kan sies å representere en undergruppe CSCS i melanom er CD133 16-20. CD133 (også kjent som Prominin 1), et medlem av pentaspan transmembrane glykoproteiner, er uttrykt i hematopoetiske stamceller, endotelceller progenitorceller, neuronal og glial stamceller 21-23. Uttrykk for CD133 er korrelert medasymmetrisk celledeling 24, og den glykosylerte epitop av CD133 ble vist å være downregulated upon celledifferensiering 25. Nylig ble CD133 + melanomceller vist seg å ha selvfornyelse og tumor-innvielse kapasitet 19,20.

Å studere funksjonen til CD133 + antatte melanom CSCS, har vi endret og optimalisert Magnetic-Activated Cell Sortering (MACS) system fra Miltenyi Biotech å få høyanriket og levedyktige bestander av CD133 + og CD133 - celler.

Magnetisk perle-baserte celleseparasjon tillater enten negativ seleksjon som vist ved Matheu m.fl.. 26 eller positiv utvelgelse som vi viser her. Under positiv utvelgelse bestemt målcellen attraksjon, CD133 f.eks uttrykkende celler, er magnetisk merket med mikroperler, 50-nm superparamagnetiske partikler som er konjugert til høyst spesifikke antistoffer mot etbestemt celleoverflateantigen. Under separasjonen, er magnetisk merkede celler beholdes i kolonnen i det magnetiske feltet av separatoren, mens umerkede celler strømme gjennom. Etter vasketrinnene, er kolonnen fjernet fra magnetfelt av separatoren, og målcellene elueres fra kolonnen. LS eller MS kolonner brukes under positiv utvelgelse resultat i fraksjoner av merkede og umerkede celler med høy renhet. På den annen side, LD kolonner, som brukes for negativ seleksjon, resultere i en litt lavere renhet av den merkede fraksjonen. Grunnet tettere pakking av matrise deres strømningshastigheten i disse kolonnene er lavere resulterende i en høyere risiko for umerkede celler å være fanget i kolonnen. LD kolonner bør derfor bare brukes for strenge uttømming av en uønsket celle undergruppe. Positiv utvelgelse kan utføres ved direkte (antistoff koplet til mikroperler) eller indirekte magnetisk merking (inkubasjon med mikroperler etter incubation med det primære antistoff). Spesifikke MACS mikroperler er tilgjengelig for positiv utvelgelse av tallrike celletyper primære tumorceller som prostata-eller melanom 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den generelle ordningen av eksperimentet inkludert fremstillingen av primære single-celler fra svulstvev, karakterisering av primære cellekulturer fibroblast uttømming og magnetisk celle sortering av CD133 + og CD133 - melanomceller er vist i Figur 1.

1. Prøvetagning

  1. Sjekk for etisk godkjenning før man vurderer de neste trinnene.
  2. Forbered en 50 ml tube med sterilt PBS supplert med 1% Penicillin-Streptomycin endelig konsentrasjon og overlate til kirurgi eller team.
  3. Organiser rask transport av svulstvev fra kirurgi til cellekultur lab ved 4 ° C.

2. Forbereder Primær Melanom Single-celler fra svulstvev

  1. Utføre alle trinnene under sterile betingelser.
  2. Før resecting svulsten, må man forberede dissosiasjon mix. 10 ml dissosiasjon mix pr 2-4 g vev er nødvendig. Blandingen kan brukes umidtely eller lagret i 10 ml aliquoter ved -20 ° C for senere bruk.
    1. Forberede en løsning inneholdende 150 mM natriumklorid. Bland med en vortex inntil oppløsningen er klar. Hvis nødvendig sterilt-filtrat natriumkloridoppløsning med en 0,22 um filter.
    2. Vei opp DNase I og forberede en løsning inneholdende 10 mg / ml DNase I i 150 mM natriumklorid. Bland ved å snu inntil oppløsningen er klar.
    3. Forbered en løsning som inneholder 100mg/ml kollagenase IV i PBS. Bland ved å snu inntil oppløsningen er klar. Aliquoter av collagenase løsning kan lagres ved -20 ° C i flere måneder.
    4. Klargjør dissosiasjon blanding med en endelig konsentrasjon på 1% Penicillin-Streptomycin, 1 mg / ml kollagenase IV og 0,1 mg / ml DNase I i Quantum 263 medium. Bland med en vortex. Valgfritt: ved bruk melanom vev avledet fra huden add Amphotericin B løsning på dissosiasjon blandingen til en endelig konsentrasjon på 1,5 ug / ml amfotericin B.
  3. Forvarme den required mengder dissosiasjon mix, PBS og Quantum 263 medium til 37 ° C.
  4. Place svulstvev på et sterilt petriskål. Aspirer overdreven løsning fra vev og tilsett 500 pl dissosiasjon blanding. Hakke svulst i små biter på 2-4 mm ved hjelp av ferske, sterile skalpeller.
  5. Transfer 2-4 g hakket svulstvev i en gentleMACS C Tube inneholder 5 ml dissosiasjon mix. Skyll petriskål med ekstra 4,5 ml dissosiasjon mix og legge resterende vev fragmenter til gentleMACS C Tube.
  6. Lukk gentleMACS C rør og feste det opp ned på hylsen i gentleMACS Dissociator. Kjør gentleMACS programmet "h_tumor_01".
  7. Løsner gentleMACS C røret fra dissociator og inkuber prøven i 30 minutter ved 37 ° C under kontinuerlig rotasjon ved hjelp av MACSmix Tube Rotator på høyeste Hastighet (12 rpm) eller ved å dreie røret manuelt hver 5 min for å resuspendere avgjort vev fragmenter .
  8. Fest gentleMACS C tube opp ned på ermet på than gentleMACS Dissociator og kjøre gentleMACS programmet "h_tumor_02".
  9. Løsner gentleMACS C røret fra dissociator og inkuber prøven i 30 minutter ved 37 ° C under kontinuerlig rotasjon ved hjelp av MACSmix Tube Rotator på høyeste Hastighet (12 rpm) eller ved å dreie røret manuelt hver 5 min for å resuspendere avgjort vev fragmenter .
  10. Fest gentleMACS C tube opp ned på hylsen i gentleMACS Dissociator og kjøre gentleMACS programmet "h_tumor_03".
  11. Løsne gentleMACS C rør fra dissociator, resuspender prøve og bruke cellesuspensjon til en 70 mikrometer celle sil plassert på en 50 ml tube. Hvis tiltetting av filteret skjer, omrør cellesuspensjon med en steril filter spiss inntil hele suspensjonen gjennem.
  12. Skyll celle sil med 5 ml Quantum 263 medium.
  13. Valgfritt: Hvis du fortsatt har vev fragmenter igjen i filteret, resuspender fragmenter i Quantum 263 medium og frø dem på en hensiktsmessig cellekultur dish. Inkuber fragmenter ved 37 ° C og 5% CO 2.
  14. Kast celle sil og lukke 50 ml rør med det fordøyde cellesuspensjonen. Sentrifuger cellesuspensjon i 5 min ved 300 xg og kast supernatanten.
  15. Valgfritt: Hvis cellepellet ser rød på grunn av en høy andel av erytrocytter forberede 1x Red Blood Cell Lysis Solution ved å fortynne 10x løsning 1:10 i dobbel-destillert vann, resuspender cellepellet i 500 ul PBS og tilsett 5 ml 1x Red Blood Cell Lysis løsning. Vortex 5 sek og inkuber ved romtemperatur i 10 min. Sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg og kast supernatanten.
  16. Resuspender kreftceller med Quantum 263 og frø cellene i riktig cellekultur kolbe. Kultur tumorceller ved 37 ° C og 5% CO 2 og rutinemessig passasje celler når de når 80% konfluens.

3. Karakterisering av Primary Cell Kultur og Fibroblast Nedbryting

  1. Analyser primære cellekulturer fenotypisk med en microscope.
  2. Høste en liten mengde (0,5 x 10 6 celler) av den primære cellekultur og utføre RT-PCR med primere for neoplastiske-, melanom-, stamcelle-og stroma celle markørgener. De viktigste genene til å analysere er CD90 (fibroblast markør), TYR (melanom / melanocyte markør), CD133 (kreft stamcelle markør), CD83 (markør for modne dendrittiske celler) og en husholdningsgenet (f.eks HPRT eller GAPDH).
  3. Hvis mikroskopisk analyse og høy uttrykk for CD90 under RT-PCR viste en høy forurensning av det primære melanom kultur med fibroblaster, må du tømme fibroblaster med anti-fibroblaster mikroperler og D Kolonner fra Miltenyi.

4. Magnetic Cell Sortering av CD133 + og CD133 - melanomceller Bruke LS kolonner

  1. Forbered MACS buffer inneholdende 2 mM EDTA og 5% FCS i PBS. Bland ved å snu og sterilt-filtrat buffer ved hjelp av en 0,22 mikrometer Steritop-GP Filter Unit. Chill buffer til 4-8 ° Cog Degas før bruk.
  2. Forvarme Accutase, PBS og Quantum 263 medium til 37 ° C.
  3. Vask 80% konfluente celler med PBS. Legge til riktig mengde Accutase og inkuber inntil celler løsne fra kultur overflaten. Samle celler i en 50 ml rør ved hjelp Quantum 263 medium.
  4. Bestem cellenummer og sentrifuger nødvendige antall celler (Ifølge Miltenyi protokoll et maksimalt antall på 2x 10 9 celler kan lastes per LS Kolonne. Cellelinje spesifikke optimale numre bør bestemmes og kan være betydelig lavere.) I 5 min ved 300 xg og 4-8 ° C. Aspirer supernatanten helt.
  5. Resuspender maksimalt 1x 10 8 celler med 350 ul MACS buffer (for høyere celle tall skalere opp alle følgende MACS buffer, FCR Blokkering Reagent, CD133/1-Biotin og anti-Biotin mikroperler volumer tilsvarende).
  6. Tilsett 100 ul FcR Blokkering Reagent.
  7. Tilsett 50 ul CD133/1-Biotin. Bland godt med en virvel og inkuber ved 4-8 ° C feller 10 min.
  8. Vask cellene ved tilsetning av 10 ml MACS-buffer og sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg og 4-8 ° C. Aspirer supernatanten helt.
  9. Gjenta vasketrinn (4,8)
  10. Gjensuspender cellepellet med 400 pl MACS buffer.
  11. Legg 100 ul anti-Biotin mikroperler. Bland godt med en virvel og inkuber ved 4-8 ° C i 15 min.
  12. I mellomtiden forbereder MACS separator for magnetisk separasjon. Fest QuadroMACS til MACS Separator Multi Stand. Sett det nødvendige antall LS kolonner med kolonnen vingene til fronten i det magnetiske feltet i QuadroMACS. Plasser en Pre-Separasjon Filter (med 30 mikrometer nylonmesh) inn i hver LS kolonne og en passende samling rør (15 ml eller 50 ml) under hver kolonne. Forbered filter og kolonnen ved å skylle med 3 ml MACS buffer. Kast gjennomstrømning.
  13. Vask cellene ved tilsetning av 10 ml MACS-buffer og sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg og 4-8 ° C. Aspirer supernatanten helt.
  14. Resuspender celler med 500 ulMACS buffer og anvende cellesuspensjon på LS kolonne med Pre-Separation Filter.
  15. Vask tre ganger med 3 ml MACS buffer per kolonne. Bare legge ny buffer når kolonnen reservoaret er tomt.
  16. De innsamlede hele strømmen inneholder umerkede CD133 - celle fraksjon.
  17. Kast Pre-Separation filter, fjerner kolonnen fra separator og legg den på et egnet samling rør.
  18. Påfør 5 ml MACS buffer. Skyll ut de merkede CD133 + celler ved fast skyve stempelet inn i kolonnen.
  19. Å øke renheten av den negative fraksjonen, påfør cellesuspensjon på en ny ekvilibrert LS kolonne inn i QuadroMACS. Avløpsvannet inneholder CD133 - fraksjonen.
  20. Kast kolonner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utarbeidelse av enkelt-celler fra svulstvev

Figur 2 eksemplifiserer en reseksjon lymfeknute metastasering av et sent stadium melanom pasient før (A) og etter (B) mekanisk dissosiasjon i 2-4 mm biter. Etter enzymatisk dissosiasjon av vevet og filtrering gjennom en 70 um nylonmesh ble celler pelletert og supernatanten kastes. På dette trinnet ble det observert en høy forurensning med erytrocytter som indikert av det rødlige fargen på cellepellet i fig 2C. Deretter utarmet vi de røde blodlegemer, som resulterte i en cellepellet av lys brun farge (figur 2D). Disse cellene ble resuspendert og dyrket med Quantum 263 medium ved 37 ° C og 5% CO 2.

Karakterisering av primære cellekulturer

Å validere om cellene stammer fra tumor og ikke fra omkringliggende stroma, utførte vi RT-PCRav melanocyte/melanoma-, fibroblast-, dendrittiske-og stamceller markørgener. Voksen melanocytter fungert som normale kontroll celler for TYR og embryonale carcinoma cellelinje NCCIT som positiv kontroll for stamcelleforskningen markør CD133. PCR resultater, vist i figur 3, viste at noen primære celler er faktisk av melanocytt opprinnelse (positiv for TYR) og er negative for markør av modne dendrittiske celler (CD83). Videre ble melanom cellelinjer funnet å uttrykke CD133, et gen avgjørende for asymmetrisk celledeling og en kjent kreft stamcelle markør. HPRT ble brukt som lasting kontroll.

Innledningsvis, den primære cellekultur inneholdt også en høy forurensning med fibroblaster som indikert av den høye ekspresjon av CD90 (figur 3 venstre, øvre panel).

Etter fibroblast utarming, inneholdt denne cellekultur bare TYR + melanom celles og ingen flere fibroblaster (CD90 -) (figur 3 venstre, nedre panel). Fraværet av fibroblaster kunne bekreftes lysfelt mikroskopi, som vist i Figur 4.

Magnetic celle sortering av CD133 + og CD133 - melanomceller

Primære melanom celler, som viser CD133 uttrykk som indikert av RT-PCR kan sorteres i CD133 + og CD133 - celler. Med den modifiserte protokollen fra Indirekte CD133 microbead Kit, en høy renhet (> 99,75%) og utbytte av CD133 + og CD133-fraksjoner, samt en høy levedyktighet begge fraksjoner etter sortering, oppnås. Sortering effekt og renhet bør alltid verifiseres ved immunofluoresence flekker eller Western blot-analyse, som vist i figur 5A og B.

Figur 1 Figur 1. Generell ordning av eksperimentet. Primær melanom cellekultur og isolering av CD133 + formodede kreftstamceller omfatter reseksjon av en svulst fulgt av mekanisk og enzymatisk dissosiasjon av tumorcellene med en dissosiasjon blanding med DNase I og kollagenase IV og gentleMACS Dissociator. Hvis tumorcellene er svært forurenset med røde blodlegemer, en rød blodcelle uttømming trinn anbefales. Dyrkede primære celler må da være preget av mikroskopiske og RT-PCR-analyse for å bekrefte om de er melanom celler. En høy forurensning med fibroblaster indikert ved ekspresjon av CD90 kan fjernes ved fibroblast uttømming hjelp Miltenyi anti-fibroblaster mikroperler. Endelig kan CD133 + og CD133-melanom celler være fraksjonert etter den indirekte CD133 Micro-Bead Kit menneske fra Miltenyi. Etter sortering er renhet bekreftet og CD133 + end CD133-melanom fraksjoner kan analyseres side ved side.

Figur 2
Figur 2. Utarbeidelse av enkelt-celler fra svulstvev. A:. Eksempel på en reseksjon melanom metastasering før dissosiasjon inn enkeltceller B: Melanom metastasering etter mekanisk dissosiasjon av tumorvevet i 2-4 mm biter ved hjelp av to sterile skalpeller C:. Pellet av enkeltceller sterkt forurenset med røde blodceller D. : Pellet av enkeltceller etter erytrocytt trykkavlastning.

Figur 3
Figur 3. Uttrykk analyse av primære cellekulturer. RT-PCR analyse av gener relatert til produksjonen av melanin (TYR), fibroblast markør (CD90), dendrittiske celle markør ( CD83) og gener avgjørende for asymmetrisk celledeling (CD133) viste at i utgangspunktet, den primære cellekultur inneholdt CD133 + melanom celler (TYR +) og ingen dendrittiske celler (CD83-), men ble svært forurenset med fibroblaster (CD90 +) (venstre, øvre panel) . Etter fibroblast uttømming denne cellekultur inneholdt bare TYR + og CD90-melanom celler (venstre, nedre panel). HPRT ble brukt som lasting kontroll. NCCIT og voksne melanocytter fungerte som positiv kontroll for CD133 og TYR, henholdsvis.

Figur 4
Figur 4. Mikrografer av primære cellekulturer før og etter fibroblast uttømming. A: Lysfelt micrograph av en primær cellekultur svært forurenset med fibroblaster B:. Lysfelt micrograph av samme primære melanom cellekultur etter fibroblast utarming.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 5
Figur 5. Verifisering av MACS via immunfluorescens flekker og vestlige blotting. A: immunfluorescens mikrografer av melanom celler 24 timer etter sortering med den indirekte CD133 microbead Kit fra Miltenyi. Celler ble utsådd på dekkglass og farget med CD133 / 1 (W6B3C1) antistoff etterfulgt av inkubasjon med Alexa Fluor 488 geit anti-kanin sekundært antistoff. Bare i CD133 + brøkdel et bestemt signal på cellemembranen ble observert som indikert av hvite piler (venstre panel). CD133-celler ikke flekk for tilstedeværelsen av protein (høyre panel) B:. Bekreftelse av sortering renhet ved kvantitativ fluorescerende Western blotting. En sterk CD133 signal ble oppdaget i CD133 + fraksjon, mens en meget svak CD133 uttrykk ble observert i the CD133-befolkningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å fjerne erytrocytt forurensing fra svulsten cellepelleten vi anbefale å bruke det røde blodlegemer lysis løsning fra Miltenyi. Fordelene med lysering erytrocyttene over den tradisjonelle Ficoll tetthetsgradient sentrifugering er at det er raskere og enklere. Videre er forurensninger med Ficoll eller røde blodceller og tap av tumorceller unngås. Når du observerer veksten av fibroblaster i den primære cellekulturer de bør fjernes umiddelbart siden de normalt overgrow kreftceller når venter for lenge.

Ved sortering celler med Miltenyi er MACS teknikk anbefaler vi høste cellene enzymatisk. Ved hjelp av en celle skrape kan være mildere til cellene og deres overflate epitoper, men vil også produsere celle fragmenter, som binder spesifikt til MACS kolonner og tette kolonner. Fordelene med Accutase fremfor den tradisjonelle Trypsin / EDTA behandling inkluderer redusert celle stress, leading til bedre levedyktighet og minimal risiko for å innføre adventivskudd agenter inn i cellekulturer. Den Accutase preparatet inneholder ikke noen pattedyr eller rekombinante bakterielle proteiner 28.

Å hindre lukking av antistoffer på celleoverflaten og ikke-spesifikk celle merking man bør arbeide raskt, holde cellene kaldt og bruke pre-avkjølte løsninger. Alle inkubasjon trinn skal utføres ved 2-8 ° C, men ikke på isen siden lavere temperaturer kan øke inkubasjonstider. Den ideelle cellenummer per kolonne må bestemmes for hver ny celle kultur. I vårt laboratorium har vi arbeidet med melanom cellelinjer hvor maksimum celle antall 4x 10 7 celler kan brukes per LS kolonne. MS kolonner fungerte ikke i det hele tatt for denne celletype. For svært store celler Miltenyi gir også stor celle kolonner, som skal brukes i stedet.

Den MACS buffer anbefalt av Miltenyi inneholder 2 mM EDTA og 0,5% BSA i PBS. Hvis en redusert viasynligheten for cellene etter magnetisk sortering er observert, kan dette være på grunn av BSA og / eller EDTA i bufferen. For å forbedre celleviabilitet BSA kan erstattes med 5% FCS, som er vanligvis bedre tolerert enn BSA. EDTA i MACS buffer kan utelates for å øke cellens levedyktighet men vil redusere sortering renhet ved 2-3%.

MACS buffer til å stabilisere kolonnene skal kastes. Det er ikke anbefalt å samle sortert celler i denne likevekt løsning siden det kan skade cellene. I stedet bør sortert celler samles i et rør utstyrt med kulturmedium til stabilisere cellene direkte etter sortering.

For å unngå tilstopping av kolonnene er det viktig å skaffe en enkelt-cellesuspensjon før magnetisk sortering ved føring cellene gjennom en 30 um nylonmesh (= forutskilling Filtre). Å øke renheten av den negative fraksjonen, en andre sikt gjennom en frisk, ekvilibrert LS kolonne eller selv LD kolonne(= For uttømming av celler) er foreslått.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker professor M. Dietel og Dirk Schumacher for å støtte dette arbeidet og kritisk lesing manuskriptet.

Forskningen fører til disse resultatene har fått støtte fra Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking henhold tilskuddsavtalen n ° 115234, ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA selskapenes i tingsinnskudd. Dette arbeidet ble også støttet av Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).
Pasient avledet celle Kultur og Isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Antatte kreft stamceller fra melanom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter