Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133 doi: 10.3791/50200 Published: March 13, 2013

Summary

I den här artikeln beskriver framställningen av nyligen erhållna melanom vävnad i primära cellkulturer, och hur du tar bort föroreningar av erytrocyter och fibroblaster från tumörcellerna. Slutligen beskriver vi hur CD133

Abstract

Trots förbättrade behandlingar alternativ för melanom som finns idag, patienter med avancerat malignt melanom har fortfarande en dålig prognos för progressionsfri och total överlevnad. Därför måste translationell forskning för att ge ytterligare molekylära bevis för att förbättra riktade terapier för maligna melanom. Under de senaste, onkogena mekanismer relaterade till melanom var omfattande studerats i etablerade cellinjer. På vägen till mer personliga behandlingsregimer baserade på individuella genetiska profiler, föreslår vi att använda patientnära härledda cellinjer i stället för generiska cellinjer. Tillsammans med högkvalitativa kliniska data, speciellt om patienten uppföljning kommer dessa celler att bidra för att bättre förstå de molekylära mekanismerna bakom melanom progression.

Här rapporterar vi inrättandet av primära melanom kulturer från dissekerade färsk tumörvävnad. Detta förfarande innefattar hackning och dissociation av vävnad till enskilda celler, reborttagande av föroreningar med erytrocyter och fibroblaster samt primär kultur och tillförlitlig kontroll av cellernas melanom ursprung.

Färska rapporter visar att melanom, liksom majoriteten av tumörer, hamn en liten subpopulation av cancer stamceller (CSCs), som verkar uteslutande bränsle tumör initiering och progression mot metastaserande staten. En av de viktigaste markörer för CSC identifiering och isolering i melanom är CD133. För att isolera CD133 + CSCs från primära melanom kulturer har vi modifierat och optimerat Magnetic cellsortering (MACS) proceduren från Miltenyi resulterar i hög sortering renhet och livskraft CD133 + CSCs och CD133 - bulk, som kan odlas och funktionellt analyseras därefter.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kutana maligna melanom är den minst vanliga, men mest dödliga typen av hudcancer. På grund av en ökande förekomst, en hög grad av malignitet och en snabb spridning, melanom står nu för 75% av maligna hudtumörer dödsfall 1,2. Förutom kirurgisk excision av primärtumör, kemoterapi, strålbehandling, immunterapi och kombinerad kemo-och immunoterapi av metastaserad melanom är state-of-the-art strategier för melanom behandling 3,4. Dock malignt melanom kännetecknas av en dåligt svar på kemoterapeutika (5-12%) 5,6, och endast de 50-70% av melanompatienter bär BRAF V600E nytta genmutation från lovande nya målinriktade behandlingar som behandling med vemurafenib 7 till förbättra total överlevnad, är en mycket bättre förståelse för mekanismerna bakom melanom tumörbildning behövs.

Att studera dessa mekanismer i det förflutna, väletablerade kommersiellaciellt tillgängliga cellinjer användes. Nyare metoder för att studera de molekylära händelser cancer initiering och progression använder primära kulturer härledda direkt från tumörvävnad - en strategi bär mångahanda förmåner: Forskaren har full kontroll över patient och vävnad urval. De samplade cellerna fått från sakkunnigt utvalda tumörvävnad, liknar tumören med alla dess heterogenitet och uppföljning data för patienten och en detaljerad patologi är tillgänglig för att egenskaperna hos kulturen att jämföras med de ursprungliga tumören 8.

Däremot är användningen av etablerade cellinjer som relevanta modellsystem i cancerforskningen diskuteras kontroversiellt. Redan i 1987 Osborne och kollegor beskrivs signifikanta biologiska skillnader mellan MCF-7 humana bröstcancercellinjer från olika laboratorier 9. Denna omfattande genomisk instabilitet och variation i RNA uttryck under subkultur var confirmed av Hiorns et al., och som stödjande data för bevis för att cellinjer inte utvecklas i kulturen, och därigenom försvaga direkt relevans för sådana etablerade kulturer som modeller för cancer hos människor 10.

En annan viktig faktor, som till stor del har ignorerats under åren, är risken för kontaminering eller överväxt av kulturer med obesläktade "falska" celler, som först markerade över 20 år sedan genom att visa att ett stort antal cellinjer förorenade av HeLa celler 8,11. Den feltolkning av data från "falska" cellinjer har nyligen framkommit i litteraturen igen. Med en kombination av DNA-profilering och molekylära cytogenetik, avslöjade MacLeod et al. Som 252 nya tumörhärledda humana cellinjer deponerade vid det tyska samlingen av mikroorganismer och cellkulturer (DSMZ), nästan 18% befanns vara inom arten eller mellan arter kors -föroreningar 12,13.

För att undvika dessa problem och att använda sig av de fördelar som nämns ovan, beslutade vi att etablera låg passage melanomcellinjer från nyligen utskurna metastaser.

Robusta cell separation och analys teknik kräver encelliga preparat som skall genereras samtidigt begränsar celldöd och förstörelse av karakteristiska ytproteiner. En bänk instrument för automatiserad dissociation av vävnader i encelliga suspensioner är gentleMACS dissociator tillverkas av Miltenyi. Vid användning i kombination med C-gentleMACS Rör och optimerad dissociation lösningar, en effektiv och skonsam dissociation av tumörvävnad i ett slutet system uppnås samtidigt antigenepitoper och minska cellförlust. Instrumentet erbjuder optimerad, förinställda program för olika specifika tillämpningar och garantier standardiserade beredning av encelliga suspensioner från melanom vävnad 14.

<p class = "jove_content"> Nya rapporter visade att majoriteten av tumörer hyser en liten subpopulation av så kallade cancer stamceller (CSCs), som enbart uppvisar tumör-initiera och självförnyande förmåga. Identifieringen av melanocyt-producerande stamceller i dermis av huden ledde till hypotesen att dessa celler kan vara ursprunget av cancer stamceller (CSCs) i melanom, eftersom exponering för UVA-strålning kan prima dessa celler för malign transformation 15. Resultatet av en sådan genetisk lesion skulle vara celler som hyser en kombination av tumör och stamceller egenskaper cell.

En av de viktigaste markörerna föreslås att representera subpopulationen av CSCs i melanom är CD133 16-20. CD133 (även känd som Prominin 1), en medlem av Pentaspan transmembrana glykoproteiner, uttrycks i hematopoetiska stamceller, endoteliala progenitorceller, neuronala och glia stamceller 21-23. Uttryck av CD133 är korrelerad medasymmetrisk celldelning 24, och den glykosylerade epitopen av CD133 visades vara nedreglerade vid celldifferentiering 25. Nyligen har CD133 + melanomceller visat sig ha självförnyelse och tumör-initiering kapacitet 19,20.

För att studera funktionen av CD133 + förmodad melanom CSCs har vi modifierat och optimerat Magnetic cellsortering (MACS) system från Miltenyi Biotech att få höganrikat och livskraftiga populationer av CD133 + och CD133 - celler.

Magnetisk pärla-baserad cellseparation möjliggör antingen negativ selektion såsom visas av Matheu et al. 26 eller positiv selektion som vi visar här. Under positiv selektion den särskilda mål-celltyp, t.ex. CD133-uttryckande celler, är magnetiskt märkta med mikrokulor, 50-nm superparamagnetiska partiklar som är konjugerade till mycket specifika antikroppar mot ettsärskilt cellytantigen. Under separering är de magnetiskt märkta cellerna kvarhålles i kolonnen i det magnetiska fältet i separatorn, medan omärkta celler strömma genom. Efter tvättningssteg, är kolonnen avlägsnas från det magnetiska fältet i separatorn, och målcellerna elueras från kolonnen. LS eller MS kolonner används under positivt val resulterar i fraktioner av märkta och omärkta celler med hög renhet. Å andra sidan, LD kolonner, som används för negativ selektion, resulterar i en något lägre renhet av den märkta fraktionen. På grund av tätare packning av sin matris flödeshastigheten i dessa kolumner är lägre resulterande i en högre risk för omärkta celler som skall fångas i kolumnen. LD kolumner bör därför endast användas för strikt utarmning av en oönskad cell subpopulation. Positiv selektion kan utföras genom direkt (antikropp kopplad till mikrokulor) eller indirekt magnetisk märkning (inkubation med mikrokulor efter incubation med den primära antikroppen). Specifika MACS mikropärlor är tillgängliga för positiv selektion av många celltyper av primära tumörceller som prostata eller melanom 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den övergripande planen för försöket med angivande utarbetandet av primära singel-celler från tumörvävnad, karakterisering av primära cellkulturer, fibroblast utarmning och magnetiska cellsortering av CD133 + och CD133 - melanomceller visas i figur 1.

1. Prov Förvärv

  1. Kontrollera om etiskt godkännande innan man överväger nästa steg.
  2. Förbered en 50 ml tub med steril PBS kompletterad med 1% penicillin-streptomycin slutlig koncentration och lämna över till kirurgi eller team.
  3. Organisera snabb transport av tumörvävnad från kirurgi till cellodling labb vid 4 ° C.

2. Förbereda primärt melanom Single-celler från tumörvävnad

  1. Utför alla steg under sterila förhållanden.
  2. Innan resektion av tumören, måste man framställa dissociationen blandningen. 10 ml dissociation blandning per 2-4 g vävnad krävs. Blandningen kan användas omedelbart eller lagras i 10 ml alikvoter vid -20 ° C för senare användning.
    1. Bered en lösning innehållande 150 mM natriumklorid. Blanda med en virvel tills lösningen är klar. Om nödvändigt steril-filtrat natriumkloridlösning med användning av en 0,22 pm filter.
    2. Väg ut DNas I och bereda en lösning innehållande 10 mg / ml DNas I i 150 mM natriumklorid. Blanda genom att vända tills lösningen är klar.
    3. Bered en lösning innehållande 100mg/ml kollagenas IV i PBS. Blanda genom att vända tills lösningen är klar. Alikvoter av kollagenas-lösning kan förvaras vid -20 ° C under flera månader.
    4. Förbered dissociations blanda med en slutlig koncentration av 1% penicillin-streptomycin, 1 mg / ml kollagenas IV och 0,1 mg / ml DNas I i Quantum 263-medium. Blanda med en virvel. Valfritt: vid användning melanom vävnad härledd från hud add amfotericin B-lösning till dissociationen blandningen till en slutlig koncentration av 1,5 | ig / ml amfotericin B.
  3. Pre-varm i required mängder dissociation mix, PBS och Quantum 263 medelstora till 37 ° C.
  4. Placera tumörvävnad på en steril petriskål. Aspirera överdriven lösning från vävnaden och tillsätt 500 pl dissociation blandning. Finhacka tumör i små bitar 2-4 mm med färska, sterila skalpeller.
  5. Överför 2-4 g hackad tumörvävnad i en gentleMACS C Tube innehållande 5 ml dissociation mix. Skölj Petriskål med ytterligare 4,5 ml dissociation mix och tillsätt resterande vävnadsfragment till gentleMACS C Tube.
  6. Stäng gentleMACS C Tube och fäst den upp och ner på hylsan för gentleMACS dissociator. Kör gentleMACS programmet "h_tumor_01".
  7. Lossa gentleMACS C Tube från dissociator och inkubera provet i 30 minuter vid 37 ° C under kontinuerlig rotation med MACSmix Tube Rotator på högsta köra hastighet (12 rpm) eller genom att vrida röret manuellt varje 5 min till återsuspendera regleras vävnadsfragment .
  8. Fäst gentleMACS C Tube upp och ned på hylsan av tHan gentleMACS dissociator och kör gentleMACS programmet "h_tumor_02".
  9. Lossa gentleMACS C Tube från dissociator och inkubera provet i 30 minuter vid 37 ° C under kontinuerlig rotation med MACSmix Tube Rotator på högsta köra hastighet (12 rpm) eller genom att vrida röret manuellt varje 5 min till återsuspendera regleras vävnadsfragment .
  10. Fäst gentleMACS C Tube upp och ned på hylsan för gentleMACS dissociator och kör gentleMACS programmet "h_tumor_03".
  11. Lossa gentleMACS C Tube från dissociator, återsuspendera prov och tillämpa cellsuspensionen till en 70 nm-cell sil placerad på en 50 ml tub. Om igensättning av filtret sker, rör cellsuspension med ett sterilt filter spets tills ett totalt upphävande gick igenom.
  12. Skölj cellfilter med 5 ml Quantum 263 medium.
  13. Valfritt: Om du fortfarande har vävnadsfragment kvar i filtret, återsuspendera fragment i Quantum 263 medium och frö dem i en lämplig cellkultur distim. Inkubera fragment vid 37 ° C och 5% COj 2.
  14. Kasta cellfilter och stäng 50 ml tub med det kokade cellsuspensionen. Centrifugera cellsuspensionen under 5 min vid 300 xg och kassera supernatanten.
  15. Valfritt: Om cellpellet är röd på grund av en stor mängd erytrocyter förbereder 1x röda blodkroppar Lysis genom att späda 10x lösning 1:10 i dubbeldestillerat vatten, resuspendera cellpelleten i 500 pl PBS och tillsätt 5 ml 1x Röd Lysis blodkroppar lösning. Vortex 5 sek och inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter. Centrifugera i 5 minuter vid 300 xg och kassera supernatanten.
  16. Resuspendera tumörceller med Quantum 263 och utsäde cellerna i lämplig cellkultur kolv. Kultur tumörceller vid 37 ° C och 5% COj 2 och rutinmässigt celler passage när de når 80% konfluens.

3. Karakterisering av primära Cell Culture och Fibroblast Utarmning

  1. Analysera primär cellkultur fenotypiskt med en microscope.
  2. Skörda en liten mängd (0,5 x 10 6 celler) i den primära cellkulturen och utföra RT-PCR med primers för neoplastiska-, melanom-,-celler och stamceller stroma cell markörgener. De viktigaste generna att analysera är CD90 (fibroblast markör), TYR (melanom / melanocyt markör), CD133 (cancer stamceller markör), CD83 (markör för mogna dendritiska celler) och en hushållning gen (t.ex. HPRT eller GAPDH).
  3. Om mikroskopisk analys och högt uttryck av CD90 under RT-PCR visade en hög förorening av den primära melanom kulturen med fibroblaster, måste du tömma fibroblaster användning av anti-fibroblaster mikrokulor och D kolumner från Miltenyi.

4. Magnetisk cellsortering av CD133 + och CD133 - melanomceller Använda LS kolumner

  1. Bered MACS buffert innehållande 2 mM EDTA och 5% FCS i PBS. Blanda genom att vända och steril-filtrat buffert med en 0,22 um Steritop-GP filterenhet. Chill buffert till 4-8 ° Coch avgasa före användning.
  2. Pre-varm Accutase, PBS och Quantum 263 medium till 37 ° C.
  3. Tvätta 80% konfluenta celler med PBS. Tillsätt lämplig mängd Accutase och inkubera tills cellerna lossnar från odlingsytan. Samla cellerna i ett 50 ml rör med Quantum 263-medium.
  4. Bestäm antalet celler och centrifugera önskat antal celler (Enligt Miltenyi protokoll ett maximalt antal 2x 10 9 celler kan laddas per LS kolumn. Cellinje specifika optimala nummer bör bestämmas och kan vara betydligt lägre.) Under 5 min vid 300 xg och 4-8 ° C. Aspirera supernatanten fullständigt.
  5. Resuspendera högst 1x 10 8 celler med 350 ul MACS buffert (för högre cellantal skala upp alla följande MACS buffert, FcR blockeringsreagens, CD133/1-Biotin och anti-biotin mikrokulor volymer därefter).
  6. Tillsätt 100 | il FcR Blocking Reagent.
  7. Tillsätt 50 | il CD133/1-Biotin. Blanda väl med användning av en virvel och inkubera vid 4-8 ° C feller 10 min.
  8. Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml MACS buffert och centrifugera under 5 min vid 300 xg och 4-8 ° C. Aspirera supernatanten fullständigt.
  9. Upprepa tvättsteg (4,8)
  10. Återsuspendera cellpelleten med 400 pl MACS-buffert.
  11. Tillsätt 100 fil anti-biotin mikropärlor. Blanda väl med användning av en virvel och inkubera vid 4-8 ° C under 15 minuter.
  12. Samtidigt förbereder MACS separator för magnetisk separation. Fäst QuadroMACS till MACS Separator Multi Stand. Sätt in erforderligt antal LS kolumner med kolumnen vingar på framsidan i det magnetiska fältet i QuadroMACS. Placera en förseparering Filter (med 30 nm nylonnät) i varje LS kolonn och en lämplig samling rör (15 ml eller 50 ml) under varje kolumn. Förbered filter och kolumn genom att skölja med 3 ml MACS buffert. Kasta genomströmning.
  13. Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml MACS buffert och centrifugera under 5 min vid 300 xg och 4-8 ° C. Aspirera supernatanten fullständigt.
  14. Resuspendera celler med 500 plMACS buffert och tillämpa cellsuspension på LS kolumnen med källsortering filter.
  15. Tvätta tre gånger med 3 ml buffert MACS per kolonn. Bara lägga ny buffert när kolonnen behållaren är tom.
  16. Den uppsamlade totala utflödet innehåller den omärkta CD133 - cellfraktionen.
  17. Kassera förseparation filter, ta bort kolumnen från separatorn och placera den på ett lämpligt insamlingssystem rör.
  18. Applicera 5 ml MACS buffert. Omedelbart spola ut de märkta CD133 + celler genom hårt trycka in kolven i kolonnen.
  19. För att öka renheten hos den negativa fraktionen, tillämpa cellsuspension på en ny jämviktad LS kolumn införd i QuadroMACS. Effluenten innehåller CD133 - fraktionen.
  20. Släng kolumner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Beredning av single-celler från tumörvävnad

Figur 2 exemplifierar en resekerade metastas lymfkörteln ett sent skede melanompatient före (A) och efter (B) mekanisk dissociation i 2-4 mm bitar. Efter enzymatisk dissociation av vävnad och filtrering genom en 70 | im nylonnät, var cellerna pelleterades och supernatanten kastades. Vid detta steg vi observerade en hög förorening med erytrocyter såsom anges av den rödaktiga färgen på cellpelleten i figur 2C. Därefter, utarmat vi de röda blodkropparna, vilket resulterade i en cellpellet av ljus brun färg (figur 2D). Dessa celler återsuspenderades och odlades med Quantum 263-medium vid 37 ° C och 5% COj 2.

Karakterisering av primära cellkulturer

För att validera om cellerna härstammar från tumör och inte från omgivande stroma, utförde vi RT-PCRav melanocyte/melanoma-, fibroblastliknande, dendritiska-och stamceller markörgener. Vuxna melanocyter tjänade som normala kontroller celler för TYR och den embryonala karcinomcellinje NCCIT som positiv kontroll för stamceller markör CD133. PCR-resultaten, som visas i figur 3, avslöjade att vissa primära celler är t.ex. av melanocytisk ursprung (positiv för TYR) och är negativa för markören av mogna dendritiska celler (CD83). Vidare har melanomcellinjer befanns uttrycka CD133, en gen avgörande för asymmetrisk celldelning och en känd cancer stamceller markör. HPRT användes som lastning kontroll.

Inledningsvis innehöll den primära cellkulturen också en hög förorening med fibroblaster såsom indikeras av den högt uttryck av CD90 (figur 3 vänster, övre panelen).

Efter fibroblast utarmning innehöll denna cell kultur endast TYR + melanomcellers och inga fler fibroblaster (CD90 -) (figur 3 vänster, nedre panelen). Avsaknaden av fibroblaster skulle kunna bekräftas av ljusfält mikroskopi, såsom visas i fig 4.

Magnetisk cellsortering av CD133 + och CD133 - melanomceller

Primära melanom celler, som visar CD133 uttryck som anges med RT-PCR kan sorteras in i CD133 + och CD133 - celler. Med det modifierade protokollet från Indirekt CD133 mikrokorn Kit, en hög renhet (> 99,75%) och utbyte av CD133 + och CD133-fraktionerna, liksom en hög livskraft båda fraktionerna efter sortering uppnås. Sortering effekt och renhet bör alltid verifieras genom immunofluoresence färgning eller Western blot-analys såsom visas i figur 5A och B.

Figur 1 Figur 1. Övergripande syftet med experimentet. Primär melanom cellodling och isolering av CD133 + förmodade cancer stamceller innefattar resektion av en tumör, följt av mekanisk och enzymatisk dissociation av tumörcellerna med en dissociations blandning med DNas I och kollagenas IV och gentleMACS dissociator. Om tumörcellerna är kraftigt förorenat med röda blodkroppar, är en erytrocyt utarmning steg rekommenderas. Odlade primära celler måste sedan präglas av mikroskopisk och RT-PCR-analys för att bekräfta om de är melanomceller. En hög förorening med fibroblaster som anges av uttrycket av CD90 kan avlägsnas med fibroblast utarmning med Miltenyi anti-fibroblaster mikropärlor. Slutligen kan CD133 + och CD133-melanomceller fraktioneras enligt indirekt CD133 Micro-Bead Kit människa från Miltenyi. Efter sortering är renheten bekräftas och CD133 + end CD133-melanom fraktionerna kan analyseras sida vid sida.

Figur 2
Figur 2. Beredning av single-celler från tumörvävnad. A:. Exempel på en resekerade melanom metastas före dissociation till enskilda celler B: Melanom metastas efter mekanisk dissociation av tumörvävnaden i 2-4 mm bitar med användning av två sterila skalpeller C:. Pellets av enskilda celler starkt förorenade med röda blodkroppar D. : Pellet av enstaka celler efter erytrocyt utarmning.

Figur 3
Figur 3. Expressionsanalys av primära cellkulturer. RT-PCR-analys av gener relaterade till melaninproduktion (TYR), fibroblast-markör (CD90), dendritisk cellmarkör ( CD83) och gener avgörande för asymmetrisk celldelning (CD133) visade att initialt innehöll den primära cellkulturen CD133 + melanomceller (TYR +) och inga dendritiska celler (CD83-) men var mycket förorenad med fibroblaster (CD90 +) (vänster, övre panelen) . Efter fibroblast utarmning denna cellkultur innehöll endast TYR + och CD90-melanomceller (vänster, nedre panelen). HPRT användes som lastning kontroll. NCCIT och vuxna melanocyter tjänade som positiv kontroll för CD133 och Tyr, respektive.

Figur 4
Figur 4. Mikrofotografier av primära cellkulturer före och efter fibroblast utarmning. A: Brightfield mikrofotografi av en primär cellkultur förorenat högt med fibroblaster B:. Brightfield mikrofoto av samma primära melanom cellkultur efter fibroblast utarmning.

e_content "fo: keep-together.within-page =" alltid "> Figur 5
Figur 5. Kontroll av MACS via immunofluorescensfärgning och western blotting. A: Immunofluorescens mikrofotografier av melanomceller 24 tim efter sortering med indirekt CD133 mikrokorn Kit från Miltenyi. Celler såddes på täckglas och färgades med CD133 / 1 (W6B3C1) antikropp följt av inkubation med Alexa Fluor 488 get-anti-kanin sekundär antikropp. Endast i CD133 + fraktionen en specifik signal vid cellmembranet observerades såsom anges av vita pilar (vänstra panelen). CD133-celler inte färgas för närvaron av proteinet (högra panelen) B:. Bekräftelse av sortering renhet genom kvantitativ fluorescerande western blotting. En stark CD133-signal detekterades i CD133 + fraktionen, medan en mycket svag CD133 expression observerades i the CD133-populationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att ta bort erytrocyter föroreningar från tumören cellpelleten rekommenderar vi använder röda blodkroppar lys från Miltenyi. Fördelarna med lysera erytrocyter över den traditionella Ficoll densitetsgradientcentrifugering är att det är snabbare och enklare. Vidare föroreningar med Ficoll eller röda blodkroppar och förlust av tumörceller undvikas. När du observerar tillväxten av fibroblaster i den primära cellkulturen de bör tas bort omedelbart eftersom de normalt växa över tumörcellerna när de väntar för länge.

Vid sortering celler med Miltenyi s MACS teknik rekommenderar vi att skörda cellerna enzymatiskt. Med hjälp av en cellskrapa kan vara skonsammare mot cellerna och deras epitoper yta, men skulle också producera cellfragment, vilka binder ospecifikt till MACS kolumnerna och täppa kolumnerna. Fördelarna med Accutase över den traditionella Trypsin / EDTA-behandling inkluderar minskad cellstress, Leading till förbättrad lönsamhet och minimerad risk för att införa främmande agens i cellkulturerna. Den Accutase preparatet innehåller inga däggdjur eller rekombinant bakteriella proteiner 28.

För att förhindra tak av antikroppar på cellytan och icke-specifik cellmärkning man bör arbeta snabbt, hålla cellerna kalla och använda förväg kylda lösningar. Alla inkubationssteg skall utföras vid 2-8 ° C, men inte på isen, eftersom lägre temperaturer kan öka inkubationstider. Den idealiska cellantalet per kolumn måste bestämmas för varje ny cellodling. I vårt labb vi arbetat med melanomcellinjer där en maximal celler antal 4x 10 7 celler kan tillämpas per LS kolonn. MS kolumner fungerade inte alls för denna celltyp. För mycket stora celler Miltenyi ger också stor cell kolumner, som bör användas i stället.

Den MACS-buffert som rekommenderas av Miltenyi innehåller 2 mM EDTA och 0,5% BSA i PBS. Om en minskad viaheten av cellerna efter magnetisk sortering observeras, kan detta bero på BSA och / eller EDTA i bufferten. För att förbättra BSA cellviabilitet kan ersättas med 5% FCS, vilket är vanligen bättre tolereras än BSA. EDTA i MACS bufferten kan uteslutas att öka cellens livskraft, men kommer att minska sortering renheten med 2-3%.

MACS buffert som används för att utjämna kolumnerna ska kasseras. Det rekommenderas inte att samla in de sorterade cellerna i jämvikt lösning eftersom det kan skada cellerna. Istället bör sorterade celler samlas i ett rör levereras med odlingsmedium för att stabilisera cellerna direkt efter sortering.

För att undvika igensättning av kolumnerna är det viktigt att erhålla en enda-cellsuspension före magnetisk sortering genom att passera cellerna genom en 30 | im nylonnät (= källsortering filter). För att öka renheten hos den negativa fraktionen, en andra körning genom en fräsch, jämviktad LS kolonn eller LD-kolonn(= För utarmning av celler) föreslås.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna tackar professor M. Dietel och Dirk Schumacher för att stödja detta arbete och kritiskt läsa manuskriptet.

Den forskning som lett fram till dessa resultat har erhållit stöd från initiativet för innovativa läkemedel gemensamt företag enligt bidragsavtal nr 115234, resurser som består av ekonomiska bidrag från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) och EFPIA företag "i natura. Detta arbete stöddes också av Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).
Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Förmodade Cancer stamceller från melanom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter