Summary
En enkel metod för att fastställa primär mus organoid kolontumör beskrivs. Denna metod utnyttjar den funktion som kolon tumörceller överleva och växa in organoids i media som innehåller begränsade tillväxtfaktorer, medan normal kolonepitelcell inte.
Abstract
Flera humana och murina tjocktarmscancer cellinjer har fastställts, är fysiologisk integritet kolontumors såsom flera cellager, basal-apikala polaritet, förmåga att differentiera, och anoikis inte upprätthålls i kolon härledda linjer cancercell. Den aktuella studien visar på en metod för odling av primärtumör musändtarm organoids anpassade från Sato T et al. 1, som behåller viktiga fysiologiska funktioner i kolontumors. Denna metod består av musändtarm tumörvävnad insamling, närliggande normal kolonepitel dissociation, kolon tumörceller matsmältningen i enskilda celler, bädda celler kolontumör in matrigel och selektiv kultur bygger på principen att tumörceller bibehålla tillväxt på begränsande näringsämne villkor jämfört med normala epitelceller.
Den primära tumören organoids om isolerade från genetiskt modifierade möss ger ett mycket användbart system för att bedöma tumör autonom funktjon av specifika gener. Dessutom tumören organoids är mottagliga för genetisk manipulation av virus mediterade genleverans, därför signalvägar involverade i tjocktarmen tumorigenesis kan också undersökts genom överuttryck eller knockdown. Primärtumör organoids kultur ger en fysiologisk relevanta och genomförbara metoder för att studera de mekanismer och terapeutiska metoder för kolon Tumörgenesens.
Introduction
De tarmepitelceller föröka sig och vända vid en extra takt, snabbare än alla andra vävnader i ryggradsdjur kroppen 2,3. De delande celler inkluderande intestinala stamceller (ISC) och transit-förstärkande celler differentierar till antingen sekretoriska (bägare, Paneth och enteroendocrine) celler eller enterocyterna 3. ISC är beläget vid basen av kryptan. Paneth celler flytta ner till botten av kryptor och är långlivade, medan andra härstamningar migrerar uppåt till villi 3,4. Här cellerna exponeras för tarminnehållet inklusive mikrobiota och fälls från villus tips genom en anoikis-inducerad apoptotisk mekanism. Även kolon saknar villi och Paneth celler, är mekanismen för att upprätthålla homeostas liknande 4.
Den Wnt signalväg har varit inblandad i att spela en avgörande roll i intestinal spridning och ISC underhåll 4. Borttagande av the transkriptionsfaktor TCF4, en nedströms effektor av Wnt-signalering leder till förlust av intestinala stamceller och efterföljande nedbrytning av vävnaden 5. Likaså minskar transgen uttryck av Wnt inhibitor DKK1 epiteliala spridning och utarmar sekretoriska cellhärstamningar 6. Omvänt inducerar överuttryck av den Wnt agonisten R-spondin-en potent och snabb förökning av intestinala kryptceller 7.
Med tanke på vikten av Wnt-signalering för intestinal homeostas, är Wnt banan mutationer observeras ofta vid koloncancer 8. Tjocktarmscancer är den tredje vanligaste dödsorsaken i cancer i USA 9. Överskott intaget med rött kött och alkohol, minskad fysisk aktivitet, och ärftliga och somatiska mutationer anses vara riskfaktorer för tjocktarmscancer 10,11. Den adenomatös polypos coli (APC)-genen, en nyckel Wnt signalering faktor, är muterad i en majoritet av patienter med familjär, sporadisk, och kolit-associerad tjocktarmscancer 12,13. Mutationer av andra faktorer inblandade i Wnt signalväg inklusive Axin2 och β-catenin observeras också i koloncancer 14,15. Emellertid är den exakta mekanismen och effektiv terapi för koloncancer saknas fortfarande. För att underlätta utredningen av de molekylära mekanismerna för koloncancer, har humana koloncancer cellinjer som representerar olika stadier av cancer progression från en godartad till en aggressiv celltyp etablerats 16-18. Mus kolonkarcinomceller cellinjer med olika metastaserande egenskaper finns också 19,20. Ändå är primära celler eller organoid kulturer föredra framför transformerade cellinjer eftersom de nära efterlikna in vivo-tillståndet och generera mer fysiologiskt relevanta uppgifter 21. De flesta kolon-cancer cellinjer växa som monoskikt fäst vid plattan eller som cellsuspensioner, lacking apikal-basolateral läggning och täta förbindelser mellan celler. Också, normala och tumör tarmepitelceller in vivo genomgå en spontan form av apoptos kallas anoikis som de differentierade cellerna når villus tips och fälls 22. Dessa funktioner är svåra att rekapitulera i cellinjer men som är viktiga i utvecklingsprocessen av koloncancer 23. Dessa funktioner upprätthålls i primära organoids. Dessutom tumören organoid kulturer ger ett effektivt system för att bedöma tumör autonoma funktionen av gener jämfört med in vivo-studier. Genetisk manipulation in vivo av tarmen är en tidskrävande process främst genom att skapa transgena och / eller möss knockout med tarm-specifika drivrutiner. Men tumören organoids är lätt mottagliga för virus medierad genetisk manipulation och därmed ett bra verktyg för att bedöma exakta molekylära mekanismer. Primära intestinal tumör organoid kulturer HAVe visats vara en möjlig och kraftfull teknik. Primär intestinal cellodling kan skapa funktionella tarm organoids med crypt-villi struktur in vitro från en enda vuxen Lgr5 + stamceller 24. Dessa organoids kan transplanteras och engrafted in skadad kolonvävnad för regenerering 25. Ytterligare anpassning av odlingsbetingelser hade gjort liknande epiteliala organoids från musändtarm och människans tunntarm och tjocktarm genomförbart 1. För primär normal kolonepitel kultur, basalt odlingsmedium samt tillväxtfaktorer inklusive EGF, Noggin, R-spondin och Wnt3a är avgörande, medan basala odlingsmedium och EGF är tillräcklig för att odla primära mus kolontumör organoids 1. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera, kultur, och generera organoids kolontumör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Kolontumör Isolering och Cell Dissociation
- Intestinala tumörer kan isoleras från någon sporadisk eller behandlingsinducerad tjocktarmscancer modellen. Mössen bör avlivas med CO2. Kolon uppsamlas sedan, spolas med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och öppnades longitudinellt. Identifiera regioner som innehåller tumörer med hjälp av ett stereomikroskop, dissekera ut med en sax, och tvätta med kall PBS.
- Inkubera intestinala fragment innehållande tumörer i EDTA kelering buffert (2 mM EDTA, 5,6 mmol / L Na 2 HPO 4, 8,0 mmol / L KH 2 PO 4, 96,2 mmol / l NaCI, 1,6 mmol / L KCl, 43,4 mmol / l sackaros, 54,9 mmol / l D-sorbitol, 0,5 mmol / L DL-ditiotreitol i destillerat vatten) under 60 minuter på is.
- Efter kelering, kommer de flesta av de normala tarmepitelceller lösgöras, medan tumörceller kommer att sitta kvar på mesenkymet. Sug bort den kelering buffert innehållande normala epitelcelleroch tvätta kvarleva tumörfragment en gång med 5 ml kall kelering buffert.
- Sug av kelering buffert, tvätta tumörfragment med 5 ml kall 1x PBS.
- Sug bort den 1x PBS, inkubera tumörfragment i digereringsbuffert (2,5% fetalt bovint serum, 1 enhet / ml penicillin, 1 | ig / ml streptomycin och 2,5 ng / ml amfotericin B, 200 U / ml kollagenas av typ IV, 125 | ig / ml typ II dispas i Dulbeccos Modified Eagle Medium) under 2 h vid 37 ° C.
- Låt tumörfragment att reglera vid normal gravitation för 1 min och samla in supernatanten i ett 15 ml Falcon rör. Pellets den enda cell tumör suspension supernatanten genom centrifugering vid 200 xg under 3 min och tvätta en gång med 5 ml PBS genom centrifugering vid 200 xg under 3 min.
2. Kultur av intestinal tumör
- Resuspendera tumörcellen pelleten med 500 pl PBS, räkna isolerade enstaka tumörceller med hjälp av en hemocytometer.
- Pellets tumörceller genom centrifuging vid 200 xg under 3 min, och återsuspendera dem i 5 mg / ml Matrigel på is och plattan i 24-brunnars plattor med 15.000 celler per 50 | il Matrigel per brunn.
- Låt Matrigel polymerisera i 15 minuter vid 37 ° C, och tillsätt 500 pl / brunn basalt odlingsmedium (1 enhet / ml penicillin, 1 | ig / ml streptomycin och 2,5 ng / ml amfotericin B, 10 mmol / L HEPES , 2 mM Glutamax, 1x N2 komplettera, 1x B27 tillskott, 1 mmol / L N-acetylcystein i Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium/F12) innehållande 50 ng / ml murin EGF.
Tre. Underhåll av etablerade organoids
- Ändra basala odlingsmedium innehållande EGF var 2 dagar och organoids passage 01:05 gång i veckan.
- För passage, byt odlingsmediet med färskt basalt odlingsmedium. Mekaniskt störa organoids och Matrigel med en P1000 pipett med tips avskurna och överför till en 15 ml Falcon rör. Ytterligare mekanisk dissociation sker med hjälp av en brand polerat Pasteur pipette.
- Tvätta dissocierade organoids med 5 ml av basal odlingsmedium och centrifugera vid 200 xg under 2 min.
- Bort supernatanten, suspendera pelleten med Matrigel och tillsätt odlingsmedium som beskrivits ovan.
4. Lagring och återvinning av etablerade organoids
- För långtidsförvaring, frysa organoids i flytande N 2, som är stabil i minst 2 år. För frysning organoids, störa med en P1000 pipett med tips avskurna och överför till en 15 ml Falcon rör.
- Tvätta dissocierade organoids med 5 ml av basal odlingsmedium och centrifugera vid 200 xg under 2 min.
- Bort supernatanten, suspendera pelleten med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) innehållande 20% fetalt bovint serum (FBS) och 10% dimetylsulfoxid (DMSO).
- Överför celler i 1,5 ml cryotubes, sedan lägga rören i en Nalgene Mr Frosty frysning behållare och förvara i en -80 ° C frys för att uppnå en kylhastighetav -1 ° C / min. Efter inkubation över natten, överföra rören i flytande N2.
- För återhämtning, är de frysta organoids snabbt tinas i ett 37 ° C vattenbad, tvätta med basal odlingsmedium, spinn ner, återsuspendera i Matrigel och kultur med förhållanden som beskrivits ovan.
Fem. RNA-extraktion, Protein Extraction och Immunhistokemi
- RNA-extraktion: Celler uppsamlas såsom beskrivits ovan för passage. RNA isoleras med PicoPure TM RNA Isolation Kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Protein Extraction: Cellpelletar uppsamlas såsom beskrivits ovan och lyserades i 100 | il med radioimmunoprecipitation analysbuffert (RIPA, 50 mmol / L Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol / l NaCI, 2 mmol / l EDTA, 1% NP-40, 0,1 % SDS) med 1x proteashämmare.
- Immunohistokemi: Sug bort cellodlingsmedium, överföra tumör organoids med P1000 pipett med tips avskurna i Cryo-formen och fryser omedelbart tisstämma frysmedium (oktober) med torris. Frysta sektioner skars på 7 ^ m och färgades som beskrivits tidigare 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidsförloppet för en kolontumör organoid formation från en tre månader gammal APC min / + mus visas i figur 1. På dag 0, kan enskilda celler observeras flera timmar efter plätering (Figur 1A). På dag 1, överlevde kolontumör epitelceller med eldfast kärnor kunde observeras. På dag 3, fördubblade celler. På dag 6, utökat storleken på organoid mer än tio gånger och visade tecken på apoptos i mitten. På dag 14, skulle orgnoids växa i oregelbundna fack (Figur 1B). Här hade vi 39.33 ± 22.05 organoids / välformad under matsmältningen skick 200 U / ml kollagenas under 2 timmar, jämfört med inga organoids bildats under matsmältningen skick 75 U / ml kollagenas i 30 min i denna studie (Figur 1C).
För att visa detta organoid kultur-modellen kan användas för funktionella studier, immunfluorescensfärgning av β-kate nin, en integrerad komponent för Wnt-signaleringsvägen visas i fig. 2. De positiva färgade celler för β-catenin är belägna i de ur skikten i organoid, som bekräftade tillväxtmönstret med en central lumen som föreslagits av Dr Clevers "grupp 24.
Figur 1. En representativ organoid formation härledd från kolontumör tagen från en tre månader gammal Apc min / + mus odlades för (A) 0, 1, 3, 6 och (B) 14 dagar visas. (C) Den framgångsrika andelen organoid bildning under två olika betingelser kollagenasdigestion.
50210fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50210/50210fig2.jpg "/>
Figur 2. Immunfluorescensfärgning av β-catenin för organoids härrör från en kolontumör tagen från en tre månader gammal APC min / + mus visas. 4 ',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydroklorid (DAPI) användes för att färga kärnor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De experimentella procedurer som beskrivs i detta protokoll kommer att möjliggöra isolering och odling av primära murina kolontumors. Protokollet är anpassad från sädes-arbete av Dr Clevers grupp 1,24,27. Vi optimerat koktiden och kollagenas koncentration för att få ett bättre utbyte av tumör organoids. De kritiska stegen inkluderar tumörceller matsmältningen i enskilda celler, Matrigel resuspension och selektiv kultur. För tumörcell matsmältningen, i syfte att erhålla en effektiv dissociation av kolontumörer och bibehålla sin hållbarhet, bör matsmältningen och koncentration av kollagenas vara empiriskt härledda och optimeras. Till exempel när du använder kollagenas vid 75 U / ml och inkubationstid på 30 minuter, gjorde vi inte få enskilda upphävanden tumörceller och inga organoids bildades under detta förhållande i våra händer. Att upprätthålla cell-cellkontakt rapporteras vara kritiskt för odling av cancer 28, här vid användning av kollagenas vid 300 U / ml och incubation tid av 3 timmar, stromaceller kontaminering är också observerats. Likaså bör Matrigel resuspension, koncentrationen, och stelningstiden också bestämmas empiriskt. De organoids tillåter exakt bedömning av tumören epitel. De organoids etablerats från intestinala tumörer har förmåga att långtidsodling. Vi har lätt användas etablerade organoids i flera månader utan väsentliga skillnader i proliferation och differentiering. Den etablerade organoid kan manipuleras genetiskt för knockdown och överuttryck. Dessutom kan tumören organoids att genereras från humana tumör biopsiprov, därför odling teknik kan användas för att studera grundläggande mekanism hos en patient specifikt sätt. Den Wnt banan är avgörande för intestinal embryonal utveckling. I den vuxna tarmen Wnts är avgörande för den normala spridningen av transit-förstärkande celler och oregelbundenhet i den Wnt banan är avgörande för kolon Tumörgenesens 29. Selektiv kultur with EGF är tillräcklig för att upprätthålla kolontumör organoid tillväxt. Men när kompletterat med Wnt3a, de organoids växa mer effektivt. Därför är cellerna reagerar för den tillväxtbefrämjande effekter av Wnt ligander, till skillnad från flera kolon-härledda cellinjer.
De organoids närmare efterlikna tarmepitelet än etablerade kolon härledda cancer linjer, och vi tror att den ger mer exakta och fysiologiskt relevanta uppgifter. Såsom beskrivits ovan, är denna teknik användbar för undersökning av initiering och mekanismer progression för koloncancer. Även tumören organoids kommer att ge mer exakta uppgifter vid bedömningen av den terapeutiska effekten av behandlingar tjocktarmscancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats med bidrag till YMS från National Institutes of Health (CA148828), The University of Michigan Gastrointestinal peptid Center, och Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research och Tom Liu Memorial Fonder vid University of Michigan Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R.
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R.
