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Medicine

优化系统的脑灌注监测在中风模型大鼠的大脑中动脉闭塞腔内

Published: February 17, 2013 doi: 10.3791/50214

Summary

已被证明是改善脑灌注监测缺血性中风模型的准确性。技术困难往往限制了使用这个脑血管研究的重要工具。在这段视频中,一个优化的系统,以获得单个或多个网站在管腔内对大鼠大脑中动脉闭塞的血流动力学监测。

Abstract

临床前中风研究的平移潜力取决于实验模拟的准确性。在动物模型中的急性缺血性中风的脑灌注监测,可以确认成功的动脉闭塞和排除蛛网膜下腔出血。脑灌注监测,也可用于研究颅内侧支循环,这正在成为一个强大的中风结果的决定因素和可能的治疗靶点。尽管认可的准则进行实验性脑缺血作用的激光多普勒血流监测,存在一些技术上的困难,限制了其广泛使用。的主要问题之一是获得一个安全的和长期的深穿透激光多普勒探头附件的动物头骨。在这段视频中,我们将展示我们已优化的线栓在大鼠大脑中动脉闭塞的脑灌注监测系统。我们开发了我N-房子一个简单的方法来获得一个定制的双光纤(深穿透)激光多普勒探头,如果需要的话,允许多站点监控的持有人。 A连续和长期的监测脑灌注可以很容易地获得较完整的头骨。

Introduction

血流动力学因素影响中风的病理生理和治疗的需要实施的转化研究,重要的问题,因为这往往是矛盾的所忽视的基本研究。

脑灌注的监测是重要的,但未被充分利用的,准确的缺血性中风的建模工具,用于2。除了 ​​动脉血管闭塞的确认和排除蛛网膜下腔出血3,持续脑灌注监测灌注赤字,颅内侧支血管的功能状态和血流动力学的影响的新的治疗方法的程度和一致性,可以提供有用的数据。

本集团最近的一项研究表明,多部位的血流动力学监测可用于评价颅内侧支循环,并能预测梗死面积和功能障碍4。这些实验结果的注意事项,支架的临床研究表明,脑侧支循环的功能性预测的临床结果在缺血性中风患者的5,6。出于这个原因,脑抵押品一直主张在急性期缺血性中风的7作为一个潜在的治疗目标。

激光多普勒(LD)的工具是最常用的工具,用于测量脑灌注缺血性中风的实验,其使用推荐最近关于这一主题的指导方针8。 LD仪器测量微血管灌注在一个小的皮质体积,所记录的信号的深度依赖于纤维分离的宽度,与双纤维LD探针允许更深的渗透相比,单纤维LD探针9。血流量值表示为相对的而不是绝对脑血流量的任意灌注单位(PU)表示。的PU的校准通常是进行全光照克的蠕动标准,根据制造商的说明。 LD血流仪可以连续动态监测和定量数据的生成在同一个会话。

其中的技术问题,目前限制使用的LD,一个主要问题是获得一个安全的和长期的深穿透激光多普勒探头附件的动物头骨。长期监测,这是非常重要的,如果有多个探头用于不同的脑动脉领土,我们执行的是在我们的实验室。

特别是,如果需要探针使用钻孔或颅骨螺钉连接到颅骨延长手术时间,而会发生不良的信号和不安全附件,如果单纤维(低渗透性)LD探针被连接到通过简单的手术胶水颅骨。双床纤维(深穿透)LD探头提供了一个更高,更一致的信号,但它们是大于单一的光纤探头,并不能在tached的头骨仅采用手术胶。

在这段视频中,我们将展示我们已优化的线栓在大鼠大脑中动脉闭塞的脑灌注监测系统。我们描述了一个简单的方法来获得一个高效,产品订制,成本低持有人单个或多个双光纤(深穿透)LD探头,用于长期监测脑灌注较完整的头骨。

瞬态MCAO在大鼠的手术程序中可以看出在视频文章由Uluç和同事10中未示出该播放器。

Protocol

1。如何使探头架(单站点还是多站点)

  1. 所需的材料是天然橡胶,小塑料管和金属钢丝。探针架座可定制的动物的大小,激光多普勒探针的数量和大小,以及脑血管领土需要以被监视。
  2. 切所需要的尺寸(约10毫米×10毫米的300克大鼠)的天然橡胶。
  3. 标记探针的位置(s)和前囟门上的天然橡胶,根据所需的立体定位坐标;大脑中动脉闭塞,缺血核心典型的坐标在囟-1毫米,5毫米横向于预期中线外围设备的缺血性borderzone领土的,预期的坐标可以在囟+2毫米,2毫米正中线旁开。
  4. 标记很清楚的X前囟门的位置,这是具有里程碑意义的安装探头持有人的头骨。 </ P>
  5. 钢丝插入到一个小塑料管(其大小需要的大小相匹配的探针)。
  6. 钢丝插入到探针具有被定位在点的天然橡胶;钢丝推入橡胶,直到塑料管已被插入到橡胶太。
  7. 抽出钢丝。
  8. 如果需要多个探头,重复步骤1.5-1.7其他探头位置。
  9. 可选的多个探头:包装带,塑料管周围的探头,以确保更好的稳定。
  10. 可选:进行化学消毒的几个探头支架以备日后使用。

2。术前准备

  1. 缺血中风模型通常是作为一种生存手术。在这种情况下,如在我们的视频所示(存活时间24小时后的手术),外科医生用灭菌的仪器及用品使用无菌技术。
  2. 异氟醚麻醉大鼠(3%的归纳法N相,1.5%的维护)。
  3. 将大鼠俯卧在手术台上。
  4. 轻轻地剃了头的影响。
  5. 应用纱布和消毒液消毒皮肤。
  6. 管理2%利多卡因5毫克/公斤区皮下,颅。

3。探测定位和固定在完整的头骨

  1. 做一个正确的正中皮肤切口(右MCAO)和解剖皮下组织,,以达到颅筋膜, 帽状腱膜
  2. 作出正确的的正中切口在颅筋膜和执行钝性分离,以达到颅骨,准备一个颅骨区域的探头支架的应用是足够大的。
  3. 请注意:无需钻孔或骨质疏松。
  4. 应用红药水消毒和干燥的颅骨表面的解决方案。
  5. 使用吹风机(冷空气),以加速干燥颅骨表面。 在这一点上,颅缝线和囟都清晰可见。
  6. 自定义探针支架用无菌剪刀切割边缘。
  7. 施加一个小的探针架座的表面下方的手术胶量(氰基丙烯酸酯,兽医批准),小心地避免的塑料管的下开口(请注意:如果一个显着量的胶之间仍然存在的光学表面的探头和头骨,这可能会产生一个低信号,并在多次使用后,可能会损坏探头)。
  8. 应用探头持有人的颅骨表面,精心选配的X标志性建筑前囟门。轻轻压在探头支架。
  9. 使用吹风机(冷空气设定),以加速干燥手术胶水。
  10. 固定探头支架,通过把探头周围的人的动物头一个手术线;要小心定位的手术线,下颌骨,避免颌下区和日Ë的脖子上。
  11. 可选的探头支架,填补了塑料管(S)的的光学凝胶( 常见的超声心电图凝胶),这将增加LD信号的质量。
  12. 将探头(s)在探头支架和验证实际的LD流量计的读数。根据制造商的说明使用LD流量计。
  13. 安全探针(S)捆绑各处的动物的头,要小心,避免颌下区和颈部定位下颌骨的手术线。

4。在缺血的脑灌注监测

  1. 将大鼠仰卧的姿势,小心地避免牵拉的力量(S)或上探探头支架。
  2. 在MCAO脑灌注监测。

5。拆除探头(S)和探头架

  1. 切缝线探针(),探头支架的动物头周围。
  2. 轻轻钝性解剖颅周围的软组织和皮肤的天然橡胶基地的探头支架。
  3. 拆下探头支架。
  4. 应用的颅骨表面的消毒液。
  5. 颅皮肤缝合。

6。手术后的护理

  1. 管理2.5毫升的生理盐水皮下,以防止脱水,并停止气体麻醉后,使用加热垫,保持动物的体温。
  2. 为了生存术:提供超前镇痛与酮洛芬4 mg / kg皮下注射,并在12小时手术后,重复相同剂量
  3. 在我们的实验条件下,安乐死在手术后24小时吸入CO 2。

Representative Results

诱导瞬态MCAO(60分钟)通过插入一个聚硅氧烷涂覆的长丝在颈外动脉。然后将长丝通过颈内动脉的末端推压最多的MCA的起源,根据LD的监测。瞬时普通颈动脉和pterygopalatin的动脉闭塞期间灯丝手术插入。的外科手术过程中的示意性表示在图1A所示。

坐标定位LD探头的选择颅根据底层动脉领土。明胶墨汁灌注( 图1B)的初步实验表明,缺血核心,预计在中央MCA领土(前囟门-1毫米,5毫米,中线探针1),而预计在borderzone领土之间的侧支循环皮层中,前脑动脉分支(前囟2毫米,从中线2毫米;探头2)。

脑血流动力学进行了研究,采用多点激光多普勒探头的整个期间的外科手术, 之前,期间和之后MCAO( 图2)。在MCAO脑灌注赤字较小,表现出较高程度的可变性探头2探头1,个体间差异的功能性颅内侧支循环缺血条件下。多点激光多普勒监测也可以研究脑血流动力学的变化闭塞的近端额外的颅内脑动脉(颈总动脉,颈内动脉,动脉pterygopalatin)的过程中。

中风结果评估再灌注24小时后的梗死体积,计算与甲酚紫( 图3),和加西亚官能neuroscore 11染色的19个连续的部分。免疫组化特异性标志物ASSOciated与缺血性脑损伤的进行,为了获得地形分布的神经元丢失(微管相关蛋白2,MAP2)和缺血半影区(热休克蛋白70,热休克蛋白70)有关的多站点颅内循环血流动力学监测( 图4)。

图1
图1。在管腔内MCAO在大鼠脑灌注的监测。 A.瞬态MCAO手术程序的示意图。使用甲硅氧烷包覆长丝的起源的MCA闭塞后,被引入在外部的颈动脉,并推动通过颈内动脉。近端宫颈动脉结扎(颈外动脉)或瞬时闭塞的(pterygopalatin动脉和颈总动脉)在多项式dure。一位代表大脑后明胶墨汁染色。 transcardiac灌注明胶油墨溶液进行缺血发作,60分钟后,没有再灌注。正常灌注的脑染色明胶墨和色为灰色与黑色染色血管,而出现缺血性(灌注)的区域依然是不染(粉红色)。颅坐标定位两个LD探针被示出。探头1 = 1毫米5毫米中线前囟门,探头2 = +2毫米,2毫米的中线前囟门。

图2
图2。使用多站点激光多普勒探头的脑血流动力学记录。一个典型的血流动力学模式,这表明缺血条件下的功能活性的颅内抵押品所示。在这种动物,LD描呈小呃灌注赤字探头2通道,探头1通道,在CCA闭塞及大脑中动脉闭塞。 MCA-O =大脑中动脉闭塞。 CCA-O =常见的颈内动脉闭塞。 PU =灌注单位。

图3
图3。代表的脑切片的梗塞灶体积的计算。组织学冠状切片(50μm的19例250μm的间隔;囟2.5毫米-3.0毫米)被固定在4%多聚甲醛和甲酚紫染色的0.1%。梗塞体积计算使用ImageJ图像处理软件,校正因脑水肿的半球间的不对称,并表示在3毫米。 点击这里查看大图

图4。免疫组织化学染色的分子标记的神经元的损失和半影。代表连续脑切片示出,进行染色甲酚紫0.1%(A)或与标记的神经元丢失(微管相关蛋白2,MAP2,B)和缺血半影区(热免疫染色休克蛋白70,热休克蛋白70,C)。

Discussion

我们内部开发的一个简单的,低成本的系统的安全附件的一个或多个双光纤(深层渗透)LD探头的大鼠在MCAO程序的完整的头骨。虽然获得可靠的连接的LD探测到的头骨显然是一个微不足道的问题,实际上是这个实验中的一个主要问题,因为它是一个平滑的信号检测和监测脑灌注成功的前提。

侵入性操作,如钻孔和骨螺钉,通常延长手术时间,引进更多的实验变量相关的开颅手术,而这可能会阻碍研究人员从使用LD监控的,不要。另一方面,在使用单纤维(低渗透)探针,它是较薄的和相对容易到被粘直接颅骨表面,给出了低质量的信号,可以不被用于可靠地与成年大鼠无需钻或减薄的头骨。

我们使用简单和成本低的材料,如天然橡胶,塑料管和金属钢丝。甲量身定制的探头支架可以在几分钟和生产适于本实验条件下。这些探头支架可以容纳一个或多个深穿透LD探头,传统的单一的现场监控缺血核心或动脉在不同的地区,在同一个半球或跨越两个半球的多个现场监控。可以生产许多探头支架,化学灭菌,并存储,以备将来使用。兽医批准手术的胶水(cyanoacrilate),加速由冷空气,是用来安装探针架座的完整表面的大鼠颅骨,根据所需的颅坐标。最后,探头设置,进一步巩固了在常见的缝合线。

这个LD探针的整体时间设置,掌握这种技术后,约10分钟。

如所示n这个视频中,我们定期监测脑灌注在中央MCA领土(LD头1:缺血性核心)和MCA领土的外围设备(LD探头2:主要是半影区)。在我们最近的研究中,我们发现,在LD中的探针2(​​平均52%±16%的SD,与基准相比)的血流量的变化的可变性是高于LD探头1(平均3​​1%±6%的SD,相比基线)和可用于,预测中风结果4。

我们的研究人员想利用我们在内部开发的系统可能会提供一些​​故障排除建议。在实验开始时,要小心,干的很不错的的颅骨表面(与红药水和冷空气)前安装探头支架,以防止过早支队。此外,可以肯定申请天然橡胶上的胶水,避免接触的塑料管中,并与开口端的LD探针的光学表面,以防止不良的信号和潜在的损坏探头。周围的动物头,追平了缝合时要小心,以避免气道阻塞(这是防止通过定位在下颚骨缝合)。定位和固定的探针后,转弯时不小心牵引探头电缆的动物在仰卧位颈椎手术,这一步通常需要两个人,一个人的动物和第二个人的探头电缆,轻轻地定位到所需的位置。最后,血液污染的双纤维LD探头易于管理的最终制造商所提供的清洁说明。

我们已优化的脑灌注监测系统,在这个视频中,可以提供一个更简单,更快速,更可靠的替代的探头设置系统,这是目前在售的商业公司在这一领域的。此外,我们认为,由其他研究人员使用该系统可以提高螺柱y的脑血流动力学的的试验行程中,导致脑抵押品的新一代疗法的发展。

Disclosures

摩尔仪器有限公司(阿克明斯特,英国德文郡),它产生的激光多普勒仪器显示在我们的实验研究提供了这个视频文章的资金用于生产。

米兰比可卡大学动物保护委员会的批准,在使用的实验动物(DL 116/1992)的国家指导方针,按照欧盟指令对动物实验实验方案(2010/63/EU )下的项目许可证(N. 219/2011-B)从意大利卫生部。

Acknowledgments

我们感谢夫人卡罗琳·罗伯逊的语音和夫人埃莱娜皮罗瓦诺的视频制作,对她的帮助。这项研究是支持的米兰比可卡大学,“2011年雅典耀丰多二”。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor Moor Instruments
VP12 probe Moor Instruments
Reagent/Material
Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm Doccol Corporation 403956PK10
Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns Multiple suppliers
Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm Multiple suppliers
Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm Multiple suppliers
Nonabsorbable suture, coated, braided silk Multiple suppliers
Cyanoacrylate surgical glue Multiple suppliers
Isoflurane (100% v/v) for veterinary use Multiple suppliers

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References

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Beretta, S., Riva, M., Carone, D., Cuccione, E., Padovano, G., Rodriguez Menendez, V., Pappadá, G. B., Versace, A., Giussani, C., Sganzerla, E. P., Ferrarese, C. Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (72), e50214, doi:10.3791/50214 (2013).More

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