Summary
Monitorização da perfusão cerebral foi demonstrada para melhorar a precisão em modelos de isquemia AVC. Dificuldades técnicas, muitas vezes limitam o uso desta ferramenta essencial para a pesquisa vascular cerebral. Neste vídeo, um sistema optimizado é mostrado para obter um controlo único ou multi-local hemodinâmicas durante a oclusão da artéria cerebral média intraluminal em ratos.
Abstract
O potencial de translação de pesquisa pré-clínica AVC depende da precisão de modelação experimental. Monitorização da perfusão cerebral em modelos animais de acidente vascular cerebral isquémico agudo permite confirmar a oclusão arterial bem sucedido e não incluem hemorragia subaracnóide. Monitorização da perfusão cerebral também pode ser utilizado para estudar a circulação colateral intracraniana, a qual está a emergir como um poderoso determinante de acidente vascular cerebral e resultado de um possível alvo terapêutico. Apesar de um reconhecido papel de monitorização da perfusão Laser Doppler como parte das diretrizes atuais de isquemia cerebral experimental, uma série de dificuldades técnicas existentes que limitam o seu uso generalizado. Uma das questões principais é a obtenção de uma ligação segura e prolongada de uma penetração profunda Laser Doppler sonda ao crânio animal. Neste vídeo, mostramos o nosso sistema otimizado para monitorização da perfusão cerebral durante a oclusão da artéria cerebral média por passageiro filamento intraluminal no rato. Nós desenvolvemos in-casa de um método simples para obter um suporte feito sob encomenda para dupla fibra (penetração profunda) sondas laser Doppler, que permitem multi-site de monitoramento, se necessário. A monitorização contínua e prolongada de perfusão cerebral pode facilmente ser obtida sobre o crânio intactos.
Introduction
Investigação translacional em fatores hemodinâmicos que afetam fisiopatologia AVC e terapia precisa ser implementada, uma vez que esta importante questão é muitas vezes negligenciada por paradoxalmente pesquisas básicas 1.
Monitorização da perfusão cerebral é uma ferramenta essencial, mas pouco utilizado, para a modelagem de acidente vascular cerebral isquêmico preciso 2. Além da confirmação da oclusão do vaso arterial e exclusão de hemorragia subaracnóide 3, monitorização da perfusão contínua cerebral pode fornecer informações úteis sobre o grau de consistência e de déficit de perfusão, o estado funcional dos vasos colaterais intracranianos e o efeito hemodinâmico de novas abordagens terapêuticas.
Um estudo recente do nosso grupo indicam que a monitorização hemodinâmica multi-site pode ser utilizado para avaliar a circulação colateral intracraniana e pode prever o tamanho do infarto e déficit funcional 4. Estes resultados experimentais são consistent com estudos clínicos, que mostraram que o desempenho funcional da circulação colateral cerebral é preditivo de resultado clínico em pacientes com derrame isquêmico 5, 6. Por esta razão, colaterais cerebrais foram recomendadas como um alvo terapêutico potencial na fase aguda do acidente vascular cerebral isquêmico 7.
Laser-Doppler (LD) instrumentos são a ferramenta mais comum usado para medir a perfusão cerebral no AVC isquémico experimental e seu uso é recomendado pelas diretrizes recentes sobre este tema 8. LD instrumentos perfusão microvascular medida num pequeno volume cortical, a profundidade do sinal gravado ser dependente da largura de separação de fibras, com sondas de fibras individuais LD, permitindo uma penetração mais profunda em comparação com sondas de fibra única LD 9. Os valores de fluxo de sangue estão expressos como unidades arbitrárias de perfusão (PU), que indicam a relação, em vez de o fluxo de sangue cerebral absoluto. Calibração de PU é normalmente realizada usinpadrões de motilidade de g, de acordo com as instruções do fabricante. LD fluxometria permite um acompanhamento contínuo e dinâmico e geração de dados quantitativos dentro da mesma sessão.
Entre os problemas técnicos que atualmente limitam o uso do LD, uma questão importante é a obtenção de uma ligação segura e prolongada de uma penetração profunda Laser Doppler sonda ao crânio animal. Isto é essencial para a monitorização prolongada e se várias sondas são utilizadas para diferentes territórios arteriais cerebrais, como estamos realizando em nosso laboratório.
Em particular, o tempo cirúrgico prolongado é necessário se as sondas estão ligadas ao crânio utilizando orifícios da rebarba ou parafusos cranianos, enquanto sinal fraco e fixação insegura ocorre se as sondas de fibra única (menor penetração) LD estão ligados ao crânio por meio de cola cirúrgica simples. Duplos fibra sondas (penetração de profundidade) LD fornecer um sinal maior e mais consistente, mas eles são maiores do que as sondas de fibra única e não pode ser menosapenso ao crânio utilizando apenas cola cirúrgica.
Neste vídeo, mostramos o nosso sistema otimizado para monitorização da perfusão cerebral durante a oclusão da artéria cerebral média por passageiro filamento intraluminal no rato. Descreve-se um método simples para se obter uma eficiente, feito, de baixo custo para titular único ou múltiplo de dupla fibra (penetração profunda) sondas de LD, a ser utilizado para monitorização prolongada da perfusão cerebral intacta sobre o crânio.
O procedimento cirúrgico para a MCAO transiente no rato pode ser visto no vídeo, artigo por Uluc e colaboradores 10 e não é mostrado neste vídeo.
Protocol
1. Como fazer o suporte da sonda (Single Site ou multi-site)
- Os materiais necessários são de borracha natural, pequenos tubos de plástico e um estilete de metal. O suporte da sonda pode ser personalizado para o tamanho do animal, o número eo tamanho das sondas de laser Doppler, e o território vascular cerebral, que precisa de ser monitorizado.
- Cortar a borracha natural do tamanho necessário (aproximadamente 10 mm x 10 mm para um rato de 300 g).
- Marque a posição da sonda (s) e o bregma na borracha natural, de acordo com as coordenadas estereotáxicas desejados, por oclusão da artéria cerebral média, as coordenadas típico para o núcleo isquémico são esperados no bregma -1 mm, 5 mm lateral à linha média, por um território borderzone periférica isquémica, as coordenadas podem ser esperados no bregma mm +2, 2 mm lateral à linha média.
- Marcar claramente a posição do bregma com um X, isto é o ponto de referência para fixar o suporte da sonda para o crânio. </ Li>
- Inserir o estilete para um tubo de plástico (o seu tamanho tem de corresponder ao tamanho da sonda).
- Inserir o estilete na borracha natural, no ponto em que a sonda tem de ser posicionada, empurre o estilete na borracha até que o tubo de plástico ter sido inserida a borracha também.
- Retirar o estilete.
- Se várias sondas são necessárias, repita os passos de 1,5-1,7 para cargos de outra sonda.
- Opcional para várias sondas: enrolar uma fita em torno dos tubos de plástico para assegurar uma melhor estabilização das sondas.
- Opcional: realizar a esterilização química de vários titulares de sonda para futuras utilizações.
2. Preparação pré-cirúrgica
- MCAO modelo de derrame é geralmente realizada como uma cirurgia de sobrevivência. Neste caso, como mostrado na nossa vídeo (tempo de sobrevivência 24 horas pós-cirurgia), o cirurgião utiliza uma técnica asséptica, com instrumentos esterilizados e suprimentos.
- Anestesiar o rato com isoflurano (inductio 3%n de fase, manutenção 1,5%).
- Coloque o rato em decúbito ventral na mesa de operação.
- Delicadamente raspar a cabeça do rato.
- Aplique uma solução anti-séptica de uma compressa de gaze e desinfectar a pele.
- Administrar de lidocaína a 2%, 5 mg / kg por via subcutânea na região craniana.
3. Posicionamento da sonda e Proteção Durante o crânio intacto
- Faça uma incisão na pele paramediana direita (para OACM direita) e dissecar o tecido subcutâneo para atingir a fáscia do crânio (gálea aponeurótica).
- Fazer uma incisão paramediana direita na fáscia craniano e executar dissecção romba para atingir o osso do crânio, preparar uma área de osso do crânio que é suficientemente grande para a aplicação do suporte da sonda.
- Atenção: não há necessidade de perfuração ou desgaste ósseo.
- Aplicar merbromin solução para desinfectar e secar a superfície do crânio.
- Usar um secador de cabelo (definido para o ar frio), para acelerar a secagem da superfície do crânio. Neste ponto, as suturas cranianas e da bregma são claramente visíveis.
- Personalize o suporte da sonda, cortando as bordas com tesoura estéril.
- Aplicar uma pequena quantidade de cola cirúrgica (cianoacrilato, veterinário-aprovado) para a superfície por baixo do suporte da sonda, cuidadosamente, evitando a abertura inferior dos tubos de plástico (note: se uma quantidade significativa de cola permanece entre a superfície óptica da sonda e o crânio, isto pode produzir um sinal de baixa e pode danificar a sonda depois de múltiplas utilizações).
- Aplique o suporte da sonda à superfície do crânio, cuidadosamente correspondente ao bregma, com o marco X. Aplique uma leve pressão no suporte da sonda.
- Usar um secador de cabelo (definido para o ar frio), para acelerar a secagem da cola cirúrgica.
- Fixe o suporte da sonda amarrando um fio cirúrgico em torno do suporte da sonda e da cabeça do animal; ter cuidado para posicionar o fio cirúrgico sobre a mandíbula, evitando a região submandibular e thpescoço e.
- Opcional: encher o tubo de plástico (s) de suporte da sonda com um gel óptico (por exemplo um ultra-som comum ou gel eletrocardiograma), o que irá aumentar a qualidade do sinal de LD.
- Coloque a sonda (s) no suporte da sonda e verificar a leitura do medidor de fluxo real de LD. Utilizar o medidor de fluxo de LD de acordo com as instruções do fabricante.
- Fixe a sonda (s) de amarrá-los em torno da cabeça do animal; ter cuidado para posicionar o fio cirúrgico sobre a mandíbula, evitando a região submandibular e no pescoço.
4. Monitoramento perfusão cerebral durante OACM
- Coloque o rato em decúbito dorsal, evitando cuidadosamente as forças tracionais na sonda (s) ou suporte da sonda.
- Iniciar o monitoramento de perfusão cerebral durante OACM.
5. Suporte de remoção da sonda (s) e da sonda
- Corte as suturas em torno do (s) sonda, a sonda de suporte e a cabeça do animal.
- Gentilmente neutralizar dissecar cranianos tecidos moles e pele ao redor da base de borracha natural do suporte da sonda.
- Retire o suporte da sonda.
- Aplicar uma solução anti-séptica para a superfície do crânio.
- Suturar a pele do crânio.
6. Cuidados pós-operatório
- Administrar 2,5 ml de solução salina por via subcutânea para evitar a desidratação e manter a quente animal usando uma almofada de aquecimento depois de parar a anestesia gasosa.
- Para a cirurgia sobrevivência: proporcionar analgesia preventiva com cetoprofeno 4 mg / kg por via subcutânea, e repetir a mesma dose em 12 horas do pós-operatório
- Sob as nossas condições experimentais, a eutanásia foi realizada às 24 horas pós-cirurgia por inalação de CO2.
Representative Results
MCAO transiente (60 min) foi induzido através da inserção de um filamento revestido com silicone na artéria carótida externa. O filamento foi então empurrado através da extremidade terminal da artéria carótida interna até à origem da MCA, sob monitorização LD. Artéria carótida comum e artéria pterygopalatin foram transitoriamente ocluído durante a inserção cirúrgica do filamento. Uma representação esquemática do procedimento cirúrgico é mostrado na Figura 1A.
As coordenadas craniana para posicionar as duas sondas LD foram escolhidos de acordo com o território subjacente arterial. Experiências preliminares com perfusão de tinta gelatina (Figura 1B) mostrou que o núcleo isquémico é esperado no centro território MCA (bregma -1 mm, 5 mm a partir da linha média; Sonda 1), enquanto que o fluxo colateral é esperado no território borderzone entre o ramos corticais de médio e anterior artérias cerebrais (bregma 2 milímetros, 2 mm da linha média; Probe 2).
Hemodinâmica cerebral foi estudada através de vários locais de sondas de laser Doppler durante todo o período do procedimento cirúrgico, isto é, antes, durante e após a MCAO (Figura 2). O déficit de perfusão cerebral durante MCAO foi menor e mostrou um elevado grau de variabilidade na sonda 2 em relação à sonda 1, sugerindo diferenças inter-individuais no desempenho funcional de colaterais intracranianos sob condições isquémicas. O local de multi-Laser Doppler controlo também permite estudar as alterações hemodinâmicas cerebrais durante a oclusão proximal extra-craniana artérias cerebrais (artéria carótida comum, artéria carótida interna, artéria pterygopalatin).
Resultado AVC foi avaliada 24 horas após a reperfusão, em volume do enfarte, calculado em 19 secções consecutivas coradas com violeta de Cresyl (Figura 3), e Garcia neuroscore funcional 11. Imunohistoquímica para marcadores específicos associada a lesão cerebral isquémica foi executada, a fim de obter uma distribuição topográfica de perda neuronal (associada a proteína de microtúbulo 2, MAP2) e penumbra isquémica (heat shock protein-70, Hsp70) em relação ao controlo multi-local hemodinâmica da circulação intracraniana (Figura 4).
Figura 1. Monitorização da perfusão cerebral durante OACM intraluminal no rato. A. Representação esquemática do procedimento cirúrgico para a MCAO transiente. Um filamento revestido com silicone foi utilizado para ocluir a origem da MCA, após ter sido introduzido na artéria carótida externa e empurrado através da artéria carótida interna. Proximais artérias cervicais foram ou ligado (artéria carótida externa) ou transitoriamente ocluído (artéria pterygopalatin e da artéria carótida comum) durante o procedimento. B. O cérebro de um representante é mostrado depois de gelatina de tinta de coloração. Perfusão transcardíaca de gelatina-tinta solução foi realizada 60 minutos após o início da isquemia, sem reperfusão. O cérebro normalmente perfundido estava manchada pela tinta de gelatina e apareceu como de cor cinza com preto vasos manchados, enquanto a área isquêmica (não-irrigado) permaneceu imaculada (cor de rosa). Coordenadas cranianos para posicionar as duas sondas de LD são mostrados. Sonda 1 = mm -1 partir bregma, 5 mm a partir da linha média; Probe 2 = +2 mm do bregma, a 2 mm da linha média.
Figura 2. Cerebrais gravações hemodinâmicos usando multi-site sondas laser Doppler. Um padrão hemodinâmico típico que sugere funcionalmente ativos colaterais intracranianas em condições isquêmicas é mostrado. Neste animal, traçados LD mostrou um pequenoer déficit de perfusão em apuração de canal 2, em comparação com a sonda 1 canal, tanto durante CCA oclusão e oclusão MCA. MCA-O = meio oclusão da artéria cerebral. CCA-O = oclusão da artéria carótida comum. Perfusão PU = unidades.
Figura 3. Secções de cérebro representativos para o cálculo do volume de enfarte histológicas secções coronais (50 um; n = 19 com 250 intervalo de im; milímetros bregma 2,5 milímetros a -3,0). São fixados em paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de Cresyl 0,1%. Volume de infarto é calculada usando ImageJ software de processamento de imagem, corrigida para assimetrias inter-hemisféricas, devido ao edema cerebral, e expresso em mm 3. Clique aqui para ver maior figura
Figura 4. A imunocoloração de marcadores moleculares de perda neuronal e penumbra representativos secções cerebrais consecutivas são mostrados, os quais foram corados com violeta de Cresyl 0,1% (A) ou imunocoradas com marcadores de perda neuronal associada a proteína do microtúbulo (2, MAP2, B). E penumbra isquémica (calor proteína de choque-70, Hsp70, C).
Discussion
Nós desenvolvemos em casa um sistema simples e de baixo custo para uma fixação segura de uma ou várias sondas twin-fibras (penetração profunda) LD para o crânio intacto de ratos durante o processo de OACM. Embora, aparentemente, um problema trivial, a obtenção de uma fixação de confiança da sonda de LD para o crânio é, na verdade, um problema importante nesta configuração experimental, uma vez que é o pré-requisito para a detecção de sinal suave e um controlo bem sucedido de perfusão cerebral.
Procedimentos invasivos, como buracos rebarbas e parafusos de osso, geralmente prolongar o tempo cirúrgico e introduzir mais variáveis experimentais relacionados a craniotomia, e isso pode desencorajar os investigadores e abster-se-os de utilizar monitoramento LD. Por outro lado, a utilização de fibra única (baixa penetração) sondas, que são mais finas e relativamente fácil de ser colada directamente à superfície do crânio, dá baixa qualidade de sinal e não pode ser utilizado de modo fiável com ratos adultos sem perfurar ou desbaste do crânio.
Usamos materiais simples e de baixo custo, como a borracha natural, tubos de plástico e um estilete de metal. Um suporte de sonda feito por encomenda pode ser produzido em poucos minutos e adaptada às condições experimentais. Estes suportes de sonda pode acomodar uma ou mais sondas de penetração profunda LD, para o monitoramento local clássico único no núcleo isquêmico ou para vários sites de monitoramento em diferentes territórios arteriais no mesmo hemisfério ou entre os dois hemisférios. Muitos proprietários de sonda pode ser produzida quimicamente esterilizada e armazenado para uso futuro. Veterinário-aprovado cola cirúrgica (cianoacrilato), acelerada por ar frio, é utilizado para fixar o suporte da sonda para a superfície intacta do crânio de ratos, de acordo com as coordenadas desejadas cranianos. Finalmente, a sonda de montagem está ainda fixado no seu lugar por meio de suturas comuns.
O tempo total desta sonda LD set-up, depois de dominar esta técnica, é de cerca de 10 min.
Como mostrado in Neste vídeo, rotineiramente monitorar a perfusão cerebral na ACM centro território (LD sonda 1: núcleo isquêmico) e no periférico MCA território (LD sonda 2: principalmente uma área de penumbra). No nosso estudo recente mostrou-se que a variabilidade de alterações do fluxo sanguíneo em LD sonda 2 (média de 52% ± 16%, SD, em comparação com a linha de base) é superior em comparação com a sonda 1 LD (média de 31% ± 6% SD, em comparação com o linha de base), e podem ser usados para predizer 4 resultado derrame.
Podemos fornecer alguns conselhos de resolução de problemas para os pesquisadores que gostariam de usar nosso sistema desenvolvido internamente. No início da experiência, ter o cuidado de secar muito bem a superfície do crânio (com merbromin e ar frio), antes de fixar o suporte da sonda para evitar o descolamento prematuro. Além disso, certifique-se de aplicar a cola sobre a borracha natural, evitando o contacto com a extremidade aberta do tubo de plástico e a superfície óptica da sonda de LD, para evitar que o sinal fraco, o potencial para a sonda. Quando atar o fio de sutura em volta da cabeça do animal, ter cuidado a fim de evitar a obstrução das vias aéreas (isto é impedido pelo posicionamento do fio de sutura ao longo do osso da mandíbula). Depois de posicionar e fixar as sondas, tome cuidado para não cabos das sondas de tração ao girar o animal em decúbito dorsal para a cirurgia cervical; esta etapa geralmente requer duas pessoas, uma pessoa segurando o animal e uma segunda pessoa segurando os cabos das sondas e gentilmente posicionando-os para a posição desejada. Finalmente, contaminação sanguínea eventual do twin-LD sonda de fibra é de fácil manuseio, seguindo as instruções de limpeza fornecidas pelo fabricante.
Nosso sistema otimizado para monitorização da perfusão cerebral, como mostra este vídeo, pode oferecer uma alternativa mais fácil, mais rápido e mais confiável para a sonda de set-up de sistemas que são vendidos atualmente por empresas comerciais nesta área. Além disso, acreditamos que a utilização deste sistema por outros investigadores pode aumentar o pernoy de hemodinâmica cerebral no campo experimental acidente vascular cerebral, que conduzem ao desenvolvimento de uma nova geração de agentes terapêuticos colaterais cerebrais.
Disclosures
Os fundos para a produção deste vídeo-artigo foi fornecido por Moor Instruments Ltd (Axminster, Devon, Reino Unido), que produz os instrumentos laser Doppler mostrados no nosso estudo experimental.
O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Atenção Animal da Universidade de Milano Bicocca, de acordo com as diretrizes nacionais para o uso de animais de laboratório (DL 116/1992) e da directiva da União Europeia para experiências com animais (2010/63/UE ), sob licença do projeto (n. 219/2011-B) do Ministério da Saúde italiano.
Acknowledgments
Agradecemos a Sra. Caroline Robertson para o voice-over e Elena Sra. Pirovano por sua ajuda na produção de vídeo. Este estudo foi financiado pela Universidade de Milano Bicocca ", Fondo di Ateneo 2011".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor |  Moor Instruments |
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| VP12 probe | Moor Instruments |
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| Reagent/Material | |||
| Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm | Doccol Corporation | 403956PK10 | |
| Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns | Multiple suppliers | ||
| Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm | Multiple suppliers | ||
| Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm | Multiple suppliers | ||
| Nonabsorbable suture, coated, braided silk | Multiple suppliers | ||
| Cyanoacrylate surgical glue | Multiple suppliers | ||
| Isoflurane (100% v/v) for veterinary use | Multiple suppliers | ||
References
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