Summary
Церебральный мониторинга перфузии была продемонстрирована для повышения точности при ишемическом инсульте моделей. Технические трудности часто ограничивают использование этого необходимый инструмент для мозгового исследования. В этом видео, оптимизированного системы показана для получения одной или нескольких площадках гемодинамический мониторинг во время внутрипросветного окклюзии средней мозговой артерии у крыс.
Abstract
Поступательного потенциал доклинических исследований инсульта зависит от точности экспериментального моделирования. Церебральный мониторинга перфузии на животных моделях острого ишемического инсульта позволяет подтвердить успешное артериальной окклюзии и исключить субарахноидальное кровоизлияние. Церебральный мониторинга перфузии также может быть использована для изучения внутричерепного кровообращения залога, который становится мощным детерминантом инсульт результатах и возможных терапевтической мишени. Несмотря на признанную роль лазерной доплеровской мониторинга перфузии в рамках существующих руководящих принципов для экспериментальной ишемии головного мозга, ряд технических трудностей, что существует предел его широкое использование. Одним из основных вопросов является получение надежной и длительной привязанности глубокого проникновения лазерного доплеровского зонда на череп животного. В этом видео мы покажем наш оптимизированный для системы мониторинга мозговой перфузии во время переходного окклюзии средней мозговой артерии внутрипросветного нити в крысу. Мы разработали яN-House простой способ получить заказ держатель для двойного волокна (глубокого проникновения) Лазерные датчики Доплера, который позволяет на нескольких площадках мониторинга, если необходимо. Непрерывного и длительного мониторинга перфузии головного мозга может быть легко получен через неповрежденный череп.
Introduction
Трансляционные исследования на гемодинамические факторы, влияющие на ход патофизиологии и терапии должен быть реализован, так как это важный вопрос, часто парадоксально пренебрегают основными исследованиями 1.
Церебральный мониторинга перфузии является важным, но недостаточно, инструмент для точного моделирования ишемического инсульта 2. Помимо подтверждения артериальной окклюзии сосудов и исключения субарахноидального кровоизлияния 3, непрерывный мониторинг мозговой перфузии могут дать полезную информацию о степени и последовательности перфузионного дефицита, функциональное состояние внутричерепных сосудов залога и гемодинамического эффекта новых терапевтических подходов.
Недавнее исследование, из нашей группы показывают, что во многих местах гемодинамический мониторинг может быть использован для оценки внутричерепного кровообращения залога и не может предсказать размер инфаркта и функциональный дефицит 4. Эти экспериментальные данные являются ПОСЛУЖИТЬСтент с клиническими исследованиями, которые показали, что функциональные показатели мозгового кровообращения залог является предиктором клинического исхода при ишемическом инсульте 5, 6. По этой причине, церебральный залогов были выступает как потенциальная цель терапии в остром периоде ишемического инсульта 7.
Лазерная доплеровская (LD) инструменты являются наиболее распространенным инструментом, используемым для оценки перфузии головного мозга у экспериментальных ишемического инсульта и их использование рекомендованных последние руководящие принципы по этой теме 8. LD инструментов мера микрососудистой перфузии в небольших корковых объем, глубину записанного сигнала, зависит от ширины отделения волокна, волокна с двумя зондами LD позволяет более глубокого проникновения по сравнению с одиночным волокном LD зондов 9. Значения кровотока выражается в условных единицах перфузии (PU), которые указывают на относительные, а не абсолютные мозгового кровотока. Калибровка ПУ обычно осуществляется УсинСтандарты г подвижности, в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. LD флоуметрии позволяет непрерывно динамического наблюдения и формирования количественных данных в рамках одной сессии.
Среди технических проблем, которые в настоящее время ограничивают использование LD, основным вопросом является получение надежной и длительной привязанности глубокого проникновения лазерного доплеровского зонда на череп животного. Это очень важно для длительного мониторинга и если несколько датчиков используются для различных церебральных артерий территорий, как мы выполняем в нашей лаборатории.
В частности, длительное время хирургических требуется, если датчики крепятся к черепу использованием заусенцев отверстий или черепно винта, в то время как плохой сигнал и незащищенных вложений происходит, если одно волокно (с низким уровнем проникновения) LD датчики крепятся к черепу простой хирургического клея. Две волокна (глубокого проникновения) LD зонды обеспечивают более высокий и более последовательным сигналом, но они больше, чем одну зондов волокна и не может быть вприкреплены к черепу с помощью хирургического клея только.
В этом видео мы покажем наш оптимизированный для системы мониторинга мозговой перфузии во время переходного окклюзии средней мозговой артерии внутрипросветного нити в крысу. Мы опишем простой метод получения эффективных, на заказ, низкие затраты держатель для одного или нескольких двойных волокна (глубокого проникновения) LD зондов, которые будут использоваться для длительного мониторинга перфузии головного мозга над нетронутыми черепа.
Хирургические процедуры для переходных MCAO в крысу можно было увидеть в видео-статьи Uluc и его коллеги 10 и не показано на этом видео.
Protocol
1. Как сделать держатель зонда (Single сайта или Multi-сайт)
- Материалами, необходимыми являются натуральный каучук, небольшие пластиковые трубы и металлический стилет. Держатель зонда может быть настроен на размер животного, количество и размер лазерного доплеровского датчика, и церебральных сосудистых территории, которые необходимо контролировать.
- Вырезать натурального каучука необходимого размера (примерно 10 мм х 10 мм на 300 крысах г).
- Отметьте положение зонда (ы) и брегмы на натуральный каучук, в зависимости от желаемой стереотаксических координат; для окклюзии средней мозговой артерии, типичный координаты для ишемического основных ожидается в брегмы -1 мм, 5 мм латеральнее срединной линии; для периферийных ишемическая приграничной территории, ожидаемые координаты могут быть брегмы +2 мм, 2 мм сбоку от средней линии.
- Марк очень четко позицию брегмы с X, это ориентир для крепления держателя зонда к черепу. </ Li>
- Вставьте стилет в небольшую пластиковую трубку (его размер должен соответствовать размеру зонда).
- Вставьте стилет в натуральный каучук в точке, где зонд должен быть установлен, нажмите стилет в резиновую до пластиковая трубка была вставлена в резиновую тоже.
- Вывод стилет.
- Если несколько датчиков необходимо, повторите шаги 1.5-1.7 для других позиций зонда.
- Дополнительно для нескольких зондов: оберните ленту вокруг пластиковых труб для обеспечения лучшей стабилизации зондов.
- Дополнительно: выполнять химическую стерилизацию нескольких владельцев зонд для будущего использования.
2. Предоперационной подготовки
- MCAO инсульта модели обычно выполняется как выживание операции. В этом случае, как показано в нашем видео (время выживания 24 часа после операции), хирург использует асептики с стерилизованных инструментов и принадлежностей.
- Anesthetize крысы с изофлурана (3% inductioп фазы, 1,5% обслуживание).
- Положите крысу в положении лежа на операционном столе.
- Мягко бритье головы крыс.
- Применить антисептический раствор для марлевым тампоном и дезинфицируют кожу.
- Администрирование Лидокаин 2%, 5 мг / кг подкожно в область черепа.
3. Позиционирование датчика и обеспечение безопасности За неповрежденном черепа
- Сделайте правый разрез кожи парамедианной (для правого MCAO) и рассекают подкожную клетчатку, чтобы достичь черепно фасции (Galea aponeurotica).
- Сделайте правый разрез парамедианной в черепной фасции и выполнять тупой диссекции, чтобы достичь костей черепа, подготовка области костей черепа который является достаточно большим для применения держатель зонда.
- Пожалуйста, обратите внимание: нет необходимости сверления отверстий или истончение костей.
- Применить Merbromin решение для дезинфекции и сушки поверхности черепа.
- Используйте фен для волос (набор для холодного воздуха) для ускорения высыхания поверхности черепа. На данный момент, черепных швов и брегмы четко видны.
- Настройка держатель зонда, сокращая края стерильными ножницами.
- Нанесите небольшое количество хирургического клея (Цианакрилатный, ветеринарные утвержденных) на поверхность под держатель зонда, тщательно избегая нижнее отверстие пластиковые трубы (обратите внимание: если значительное количество клея остается между оптической поверхности зонда и череп, это может привести к низкой сигнала и может привести к повреждению зонда после многократного использования).
- Применить держатель зонда к поверхности черепа, тщательно соответствия брегмы с достопримечательностью X. Применить мягкое давление на держатель зонда.
- Используйте фен для волос (набор для холодного воздуха) для ускорения сушки хирургического клея.
- Закрепите держатель зонда, связывая хирургической нити вокруг держателя зонда и голову животного, будьте осторожны, чтобы поместить хирургической нити на нижней челюсти, избегая подчелюстной области и гоэлектронной шею.
- Дополнительно: заполните пластиковые трубки (ы) держатель зонда с оптическим гелем (например, общие УЗИ или ЭКГ гель), что позволит увеличить качество сигнала LD.
- Поместите зонд (ы) в держатель зонда и проверить фактическое показание расходомера LD. Использование расходомеров LD в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
- Закрепите зонд (ы) связывая их вокруг головы животного, будьте осторожны, чтобы поместить хирургической нити на нижней челюсти, избегая подчелюстной области и шеи.
4. Церебральный мониторинга перфузии во время MCAO
- Положите крысу в положении лежа на спине, тщательно избегая тяговая силы на зонд (ы) или держатель зонда.
- Начало мозговой перфузии во время мониторинга MCAO.
5. Удаление Probe (ы) и держатель зонда
- Разрежьте швы вокруг зонда (ы), держатель зонда и голова животного.
- Аккуратно вскрыть черепную притупить мягких тканей и кожи вокруг базы природных резины держатель зонда.
- Снимите держатель зонда.
- Применить антисептический раствор для поверхности черепа.
- Шва черепа кожу.
6. Послеоперационный уход
- Администрирование 2,5 мл физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание и держать животное теплой помощью грелки после остановки газообразных анестезии.
- Для выживания операции: предоставление преимущественного обезболивание с Кетопрофен 4 мг / кг подкожно и повторить в той же дозе в 12 ч после операции
- В наших условиях, эвтаназия была выполнена в 24 час после операции по CO 2 ингаляции.
Representative Results
Переходный MCAO (60 мин) было вызвано установкой силиконовым покрытием нити в наружной сонной артерии. Нить затем толкнул через терминал конца внутренней сонной артерии до начала MCA, при мониторинге LD. Общей сонной артерии и артерии pterygopalatin были временно окклюзии во время хирургического введения нити. Схематическое изображение хирургическая процедура показана на рисунке 1а.
Черепной координаты для позиционирования двух LD зонды были выбраны в соответствии с основной артериальной территории. Предварительные эксперименты с желатином чернил перфузии (рис. 1б) показал, что ишемическая основных ожидается в центральной MCA территории (брегмы -1 мм, 5 мм от средней линии; Probe 1), в то время как обеспечение потока ожидается в приграничной территории между корковых ветвей средней и передней мозговой артерии (брегмы +2 мм, 2 мм от средней линии; зонд 2).
Церебральной гемодинамики изучали с помощью нескольких местах лазерной доплеровской зонды в течение всего периода хирургической процедуры, то есть до, во время и после MCAO (рис. 2). Церебрального дефицита перфузии во время MCAO было меньше, и показали высокую степень изменчивости Probe 2 по сравнению с Probe 1, предполагая, между индивидуальными различиями в функциональных показателей внутричерепного залогов при ишемических условиях. Мульти-сайт лазерной доплеровской мониторинга также позволяет изучать изменения церебральной гемодинамики при окклюзии проксимального экстра-черепной мозговой артерии (общей сонной артерии, внутренней сонной артерии, pterygopalatin артерии).
Ход результат оценивается через 24 часа после реперфузии по объему инфаркта, рассчитанный на 19 последовательных срезах, окрашенных Cresyl фиолетовый (рис. 3), и Гарсия функциональных neuroscore 11. Иммуногистохимия для специфических маркеров свяные с ишемического повреждения мозга была выполнена, с целью получения топографических распределения потерю нейронов (микротрубочки связаны 2 белка, MAP2) и ишемической полутени (белок теплового шока-70, Hsp70) в связи с мульти-сайт гемодинамического мониторинга внутричерепного кровообращения (рис. 4).
Рисунок 1. Церебральный мониторинга перфузии во время внутрипросветного MCAO у крыс. А. Схематическое изображение хирургической процедуры для переходных MCAO. Силиконовым покрытием нити были использованы для закрывают происхождения MCA, после того, как введено в наружной сонной артерии и протолкнул внутренней сонной артерии. Проксимальный шейки артерии либо лигировали (наружной сонной артерии) или временно окклюзии (pterygopalatin артерии и общей сонной артерии) во время процедурДюре. B. Представитель мозга проявляется после желатина чернил окрашивания. Transcardiac перфузия желатином чернил решения проводились через 60 мин после начала ишемии, без реперфузии. Обычно перфузии мозга окрашивали по желатин-чернила и появились серого цвета с черными окрашенных судов, в то время как ишемическая (не-перфузии) области остались неокрашенными (розового цвета). Черепно координаты для размещения двух LD зондов показано на рисунке. Probe 1 = -1 мм от брегмы, 5 мм от средней линии; зонд 2 = +2 мм от брегмы, 2 мм от средней линии.
Рисунок 2. Церебральной гемодинамики записи с использованием мульти-сайт лазерной доплеровской зондов. Типичная картина гемодинамики которая предполагает функционально активных внутричерепного залогов при ишемических условиях показан. В этом животном, LD обводка показали небольшойэ перфузии дефицит Probe 2 канала, по сравнению с датчика 1 канала, как во время ОАС окклюзии и MCA окклюзии. MCA-O = окклюзии средней мозговой артерии. CCA-O = общей сонной артерии окклюзии. PU единиц = перфузии.
Рисунок 3. Представитель срезы головного мозга для расчета объема инфаркта Гистологическое корональные разделы (50 мкм, N = 19 с интервалом 250 мкм; брегмы +2,5 мм до -3,0 мм). Зафиксированы в 4% параформальдегид и окрашивали Cresyl фиолетового 0,1%. Инфаркт объеме рассчитывается с использованием ImageJ обработки изображений программное обеспечение, с поправкой на межполушарной асимметрии в связи с отеком мозга, и выражается в мм 3. Нажмите, чтобы увеличить рисунок
Рисунок 4. Иммуноокрашивание молекулярных маркеров потерю нейронов и полутень представитель последовательных участков мозга показали, что окрашивали Cresyl фиолетового 0,1% (A) или иммуноокрашиванию с маркерами потерю нейронов (микротрубочки связаны 2 белка, MAP2, B)., И ишемической полутени (тепла шока-70, Hsp70, C).
Discussion
Мы разработали в доме простые и недорогие системы для надежного крепления одного или нескольких двойных волокна (глубокого проникновения) LD зондов к нетронутым череп крысы во время MCAO процедуры. Хотя и очевидно тривиальная задача, получение надежного крепления зонда LD с черепом на самом деле является серьезной проблемой в этой экспериментальной установки, так как это является необходимым условием для гладкого сигнала обнаружения и успешного мониторинга перфузии головного мозга.
Инвазивные процедуры, такие как заусенцы отверстия и костные винты, как правило, продлить время хирургических и ввести более экспериментальные переменные, связанные с трепанация черепа, и это может отбить у исследователей и воздерживаться от их использования LD мониторинга. С другой стороны, использование одного волокна (низкое проникновение) зонды, которые являются более тонкими и относительно легче клеить прямо на поверхности черепа, дает низкое качество сигнала и не может быть использована надежно взрослых крыс без сверления или истончение черепа.
Мы использовали простые и дешевые материалы, такие как натуральный каучук, пластиковые трубы и металлической стилет. Заказные держатель зонда может быть произведено в течение нескольких минут и адаптированы к условиям эксперимента. Эти держатели зонда может расположиться один или более глубокого проникновения LD зондов, для классической одном участке мониторинга на ишемические основной или нескольких местах мониторинга в различных артериальных территории в том же полушарии или между двумя полушариями. Многие владельцы зонд может быть произведено, химически стерилизуют, и хранить для будущего использования. Ветеринарная утвержденных хирургического клея (cyanoacrilate), ускоряется холодный воздух, используется для крепления держателя зонда к нетронутой поверхности крысы черепа, в зависимости от желаемой черепно координат. Наконец, зонд настройки далее закрепляется на месте по общему швов.
Общее время этого LD зонд настройки, после овладения этой техникой, составляет около 10 мин.
Как показал яп этом видео, мы регулярно контролировать перфузии головного мозга в центральной MCA территории (LD зонд 1: ишемическая ядро) и в периферийной территории MCA (LD зонд 2: в основном полутени область). В нашем недавнем исследовании мы показали, что изменчивость изменения кровотока в LD зонда 2 (означает 52% ± 16% SD, по сравнению с базовым) выше по сравнению с LD зонда 1 (означает 31% ± 6% SD, по сравнению с базовый уровень) и может быть использована для прогнозирования хода четыре результата.
Мы можем предоставить некоторые устранение неисправностей советы для исследователей, которые хотели бы использовать наш внутренний разработанной системы. В начале эксперимента, будьте осторожны, чтобы высушить очень хорошо поверхности черепа (с Merbromin и холодного воздуха) перед установкой держателя зонда для предотвращения преждевременной отслойки. Кроме того, не забудьте нанести клей на натуральный каучук, избегая контакта с открытым концом пластиковой трубки и оптического поверхности LD зонд, чтобы предотвратить плохой сигнал и потенциального ущерба для зонда. Когда связывая нить вокруг головы животного, будьте осторожны, чтобы избежать обструкции дыхательных путей (это предотвратить, установив шов на нижней челюсти). После размещения и крепления зондов, будьте осторожны, чтобы не кабелей тяговых зонда при повороте животное в положении лежа на спине шейки хирургии; этот шаг, как правило, требуется два человека, один человек держит животное и второе лицо, занимающее кабели датчиков и аккуратно их позиционирования в нужное положение. Наконец, возможное заражение крови двойным слоем LD зонд легко управляется после очистки инструкции, предоставленной производителем.
Наша оптимизированная система для мониторинга мозговой перфузии, как показано на этом видео, могли бы обеспечить более простой, быстрой и надежной альтернативой зонд настройки системы, которые в настоящее время продаются коммерческими компаниями в этой области. Кроме того, мы считаем, что использование этой системы на другие исследователи могут повысить шпилькиУ церебральной гемодинамики в экспериментальных инсульта поля, что приводит к развитию нового поколения мозговой терапии залога.
Disclosures
Финансирование для производства этого видео-статья была предоставлена Moor Instruments Ltd (Axminster, Девон, Великобритания), который производит лазерной доплеровской инструменты показано в наших экспериментальных исследований.
Экспериментальный Протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными из Университета Milano Bicocca, в соответствии с национальными рекомендациями по использованию лабораторных животных (DL 116/1992) и Директивы Европейского Союза для экспериментов на животных (2010/63/EU ), в рамках проекта лицензии (п. 219/2011-B) от итальянского Министерства здравоохранения.
Acknowledgments
Мы благодарим г-жа Каролин Робертсон за голос за кадром и Елена Pirovano за помощь в видео-продукции. Это исследование было поддержано Университета Milano Bicocca, "Fondo ди Ateneo 2011".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor |  Moor Instruments |
||
| VP12 probe | Moor Instruments |
||
| Reagent/Material | |||
| Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm | Doccol Corporation | 403956PK10 | |
| Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns | Multiple suppliers | ||
| Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm | Multiple suppliers | ||
| Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm | Multiple suppliers | ||
| Nonabsorbable suture, coated, braided silk | Multiple suppliers | ||
| Cyanoacrylate surgical glue | Multiple suppliers | ||
| Isoflurane (100% v/v) for veterinary use | Multiple suppliers | ||
References
- Sutherland, B. A., Papadakis, M., Chen, R. L., Buchan, A. M. Cerebral blood flow alteration in neuroprotection following cerebral ischemia. J. Physiol. 589, 4105-4114 (2011).
- Prinz, V., Endres, M. Chapter 3 Modeling focal cerebral ischemia in rodents: Introduction and overview. Rodent models of stroke. Dirnagl, U. , Human Press. (2010).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Riva, M., Pappadà, G. B., et al. Hemodynamic monitoring of intracranial collateral flow predicts tissue and functional outcome in experimental ischemic stroke. Exp. Neurol. 233, 815-820 (2012).
- Menon, B. K., Smith, E. E., et al. Regional leptomeningeal score on CT angiography predicts clinical and imaging outcomes in patients with acute anterior circulation occlusions. Am. J. Neuroradiol. 32, 1640-1645 (2011).
- Bang, O. Y., et al. Collateral flow predicts response to endovascular therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 42, 693-699 (2011).
- Shuaib, A., Butcher, K., Mohammad, A. A., Saqqur, M., Liebeskind, D. S. Collateral blood vessels in acute ischaemic stroke: a potential therapeutic target. Lancet Neurol. 10, 909-921 (2011).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Shepherd, A. P., Öberg, P. A. Laser-Doppler Blood Flowmetry. , Kluwer Academic Publishers. (1990).
- Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation. Stroke. 26, 627-634 (1995).
