Summary
RPPA permite la expresión de la proteína de cientos de muestras, impresos en portaobjetos de nitrocelulosa para ser interrogado simultáneamente, usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Esta técnica se ha aplicado para estudiar el efecto de la heterogeneidad de tratamiento de drogas dentro de células claras carcinoma renal.
Abstract
Actualmente no existe ningún tratamiento curativo para el cáncer metastásico de células renales de células claras, el más común de variante de la enfermedad. Un factor clave en esta resistencia al tratamiento se cree que es la complejidad molecular de la enfermedad de 1. La terapia dirigida, tales como el inhibidor de la tirosina cinasa (ITC)-sunitinib han sido utilizados, pero sólo el 40% de los pacientes responderán, con la gran mayoría de estos pacientes que recaen dentro de 1 año 2. Por ello, la cuestión de la resistencia intrínseca y adquirida en pacientes renales de células cancerosas es muy relevante 3.
Con el fin de estudiar la resistencia a TKIs, con el objetivo final de desarrollar tratamientos eficaces y personalizados, tejido secuencial después de un período específico de terapia dirigida se requiere, un enfoque que ha resultado exitoso en leucemia mieloide crónica 4. Sin embargo, la aplicación de esta estrategia en el carcinoma de células renales se complica por el alto nivel de bOTH inter e intratumoral heterogeneidad, que es una característica de carcinoma de células renales 5,6, así como otros tumores sólidos 7. Heterogeneidad Intertumoral debido a las diferencias transcriptomic y genética está bien establecida incluso en pacientes con presentación similar, estadio y grado del tumor. Además es evidente que existe un gran morfológica (intratumoral) heterogeneidad en RCC, que es probable que represente heterogeneidad molecular aún mayor. Mapa detallado y clasificación de los tumores RCC por análisis morfológico combinada y la clasificación de Fuhrman permite la selección de áreas representativas para el análisis proteómico.
El análisis de proteínas basado en 8 de CCR es atractivo debido a su amplia disponibilidad en los laboratorios de patología, sin embargo, su aplicación puede ser problemática debido a la limitada disponibilidad de anticuerpos específicos 9. Debido a la naturaleza de dot blot de las matrices de la proteína de fase inversa (RPPA), la especificidad del anticuerpo debe be pre-validado; como tal control de calidad estricto de los anticuerpos utilizados es de suma importancia. A pesar de esta limitación, el formato de dot blot sí permite la miniaturización de ensayo, lo que permite la impresión de cientos de muestras en un portaobjetos de nitrocelulosa sola. Diapositivas impresas se pueden analizar de una forma similar a análisis de Western con el uso de anticuerpos primarios específicos y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, lo que permite la multiplexación. La expresión diferencial de proteínas en todas las muestras en un portaobjetos se pueden analizar simultáneamente al comparar el nivel relativo de fluorescencia de una manera más rentable y de alto rendimiento.
Protocol
1. La identificación de la heterogeneidad morfológica y molecular del tumor
- Tumores extraídos de -80 ° C congelador y se mantuvo en hielo seco.
- Dividir los tumores en secciones de aproximadamente 1 cm 3. Mapear la posición original de cada sección del tumor respecto a la otra y la etiqueta con un nombre único. Almacenar las muestras en crioviales individuales a -80 º C hasta que esté listo para su uso.
- Muestras de abrigo en octubre y cortadas en un criostato a -22 ° C.
- Las muestras se tiñeron con hematoxilina y eosina método counterstaining.
- El análisis microscópico de cortes congelados para asegurar que son de naturaleza ccRCC, tumor viable y para la clasificación (de bajo grado y de alto grado o mixto baja / alta calidad, difícil de diferenciar los grados Fuhrman 1 a 4 de la sección congelada). Figura 1 A y B (H & E tinción de alta calidad y bajo mixta).
- Seleccione hasta 4 muestras de cada región morfológicamente diferentes dentro de cada tumor para la extracción de proteínas.
2. La extracción de proteínas de muestras de tumores
- Cortar muestra de tumor de octubre
- Place 50-75 mg de tejido en tubos de 2 ml con 990 l de tampón de lisis [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), NaCl 150 mM] suplementado con aprotinina (Sigma A6279) (10 mg / ml), cóctel inhibidor de fosfatasa 2 (Sigma, P5716), cóctel inhibidor de fosfatasa 3 (Sigma, P0044) y un cóctel inhibidor de proteasa (Roche, 11836153001).
- Añadir una sola bola de acero de 5 mm a cada tubo y homogeneizar a 50 Hz durante 5 minutos dos veces utilizando un TissueLyser, comprobando el nivel de homogeneización después de cada período de 5 minutos.
- Verter la muestra homogeneizada a nuevo tubo de 2 ml con pipeta dejando detrás de la bola de acero.
- Añadir 10 l de Triton X-100 a cada muestra antes de la centrifugación a 13.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
- Transferir los sobrenadantes a tubos de microcentrífuga frescos.
- Determinar la concentración de proteína usando BCA ensayo (Figura 2).
- Normalizar las concentraciones de proteína a 1 mg / ml.
3. Validación de anticuerpos
- Preparar muestras de proteínas (extraído de las líneas celulares adecuadas o tejido) para transferencia Western y se ejecutan en un 10% SDS-PAGE gel.
- Transferir las muestras a una membrana de nitrocelulosa durante la noche a 4 ° C.
- Bloquear la membrana en tampón de Odyssey Li-Cor bloqueo (50:50 diluyó en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Diluir los anticuerpos primarios en Buffer Odyssey Li-Cor 50:50 Bloqueo (diluido en PBS) a los fabricantes recomienda dilución normalmente de 1 en 1.000.
- Incubar la membrana en los anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C.
- Hacer un 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T, 1 ml de Tween 20 / 1L PBS).
- Lavar la membrana en PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3).
- Diluir fluorescente marcada con anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo Odyssey (diluido en PBS 50:50) 0,01% SDS a 1:10,000 dilución (1,5 μl/15 ml).
- Incube la membrana en secundariaanticuerpos a temperatura ambiente durante 45 min con agitación suave - es importante para proteger la membrana de la luz hasta el momento en que finalmente se ha escaneado.
- Lavar la membrana en PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3), manteniendo la membrana en la oscuridad.
- Lavar la membrana en PBS a temperatura ambiente durante 5 min (x3) para eliminar Tween20 residual, manteniendo de nuevo la membrana en la oscuridad.
- Lie membrana plana sobre un trozo de papel de filtro en la oscuridad y dejar secar al aire - permitiendo que la membrana se seque puede mejorar la señal y reducir el fondo, pero hacen inútil para pelar y re-sondeo.
- Escanear la membrana en el escáner Odyssey LiCor. Mantener la membrana en la oscuridad hasta el momento en que se ha escaneado.
- Sólo seleccionar anticuerpos que generan una sola banda predominante en el peso molecular correcto. Figura 3 muestra ejemplos de anticuerpos aceptables e inaceptables para su uso con RPPA.
4. RPPA Printing
- Proteína lisados fueron avistados en portaobjetos de vidrio recubiertos de nitrocelulosa (Whatman Fastslides-) utilizando un MicroGrid II robot ayudante. Las diapositivas utilizadas contenían 2 almohadillas en el que las muestras fueron vistos. Cada almohadilla fue vista con muestras idénticas, en este caso 100 muestras. Otros formatos disponibles son 1, 8 y 16 diapositivas de pad. Cuanto mayor sea el número de almohadillas más pequeño es el número de muestras que se pueden observar en cada uno.
- Una serie de cinco diluciones de 2 veces se hicieron de cada muestra y cada uno fue visto entonces por triplicado (que resulta en un total de 15 puntos por muestra).
5. RPPA de detección de proteínas
- Portaobjetos húmedos en Buffer LiCor exceso de bloqueo (50:50 diluyó en PBS). Incubar a temperatura ambiente durante 1 h en una plataforma oscilante.
- Preparar 800 l de anticuerpos primarios en tampón de bloqueo LiCor (50:50 diluyó en PBS) a las concentraciones deseadas y mantener en hielo.
- Montar las diapositivas, ya sea (i) el clip único chip marcoo (ii) cuatro el 'FastFrame' soporte de diapositivas bahía de modo que un sello hermético se forma entre la corredera y la cámara de incubación.
- Retire tampón residual de los pozos y añadir 600 l anticuerpo primario a los pozos respectivos.
- Colocar el portaobjetos y la cámara en una caja sellada húmeda e incubar en la plataforma oscilante durante la noche a 4 ° C.
- Completar hasta 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 100 l de Tween 20/100 ml de PBS).
- Retire los portaobjetos de la cámara frigorífica y retire con cuidado los anticuerpos primarios de cada pocillo.
- Añadir 600 l de PBS-T y lavar los portaobjetos en la plataforma oscilante a temperatura ambiente durante 5 min (X3).
- Preparar fluorescente marcada con anticuerpos secundarios mediante la dilución en tampón de bloqueo Odyssey (50:50 diluyó en PBS) 0,01% de SDS a 1:2,000 dilución (1 l / 2 ml) en la primera instancia.
- Retire tampón de los pocillos y añadir 600 l fluorescente marcada con anticuerpos secundarios a los pozos respectivos. Incubar anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 45 min con agitación suave - loEs importante para proteger la membrana de la luz hasta el momento en que finalmente se ha escaneado.
- Eliminar los anticuerpos secundarios de lavado bien y brevemente (x3) en 600 l de PBS-T a temperatura ambiente. Extraer el portaobjetos de la portadora, transferir a un recipiente adecuado y lavar en exceso de PBS-T durante 15 minutos, manteniendo la membrana en la oscuridad.
- Retirar PBS-T y la membrana lavado adicional con PBS a temperatura ambiente durante 15 min para retirar los residuos de Tween-20, manteniendo de nuevo la membrana en la oscuridad.
- Secar la Fastslide en 50 ° C horno durante 10 min y luego escanear en el escáner Odyssey Li-Cor. Mantenga la diapositiva en la oscuridad hasta que se hayan escaneado.
- Escanear el portaobjetos a 680 nm y / o 800, dependiendo del anticuerpo secundario / anticuerpos utilizados. Para la detección de dos colores siempre uso altamente transversal adsorbidos anticuerpos secundarios para minimizar la reactividad cruzada. La cuidadosa selección de anticuerpos primarios y secundarios es necesario para la detección de dos colores. De importancia primaria es la selección de losespecies diferentes de acogida (por ejemplo, conejo y ratón) para los dos anticuerpos primarios. Esto permite la discriminación por anticuerpos secundarios anti-conejo y anti-ratón que están marcados con colorante con espectros de emisión fácilmente distinguibles.
- Los archivos de imágenes se guardan como archivos. Tiff. Figura 4 (imagen de los archivos escaneados).
6. Análisis de Datos
- Activar el software MicroVigene (VigeneTech, Carlisle, MA, EE.UU.).
- Abra. Archivo tiff imagen que contiene el análisis de la diapositiva RPPA.
- Seleccionar un archivo de plantilla predefinida que tendrá una rejilla para superponer sobre la imagen de la diapositiva RPPA.
- Haga clic en la Definición de zonas de interés (ROI) botón para que aparezca la cuadrícula.
- Coloque la rejilla sobre los puntos RPPA. Figura 6a (imagen de la cuadrícula sobre la imagen).
- Haga clic en el botón Seleccionar todo para seleccionar todo el ROI.
- Haga clic en Buscar todos. MicroVigene se Automticamente encontrar el ROI, encontrar los puntos, se resta el fondo, limpie el polvo y cuantificar las manchas.
- Haga clic en el botón Ver Curve dilución para mostrar los resultados de todas las muestras de la diapositiva RPPA.
- Haga clic en Guardar Datos de dilución.
- Como cada muestra se imprime a través de 5 puntos cada dilución por triplicado hay 15 puntos a analizar, lo que reduce el riesgo de errores y mejora la calidad de ajuste de la curva. MicroVigene produce un 4-parámetro logistic-log modelo "Supercurve" algoritmo (Figura 6b), que incorpora todos los puntos para producir una curva sigmoidea de la cinética de anticuerpos de unión a antígeno. El supuesto es que los mismos anticuerpo-antígeno cinética de unión se lleva a cabo en cada punto de la muestra, incluso en las diferentes muestras, por lo tanto, tomando todos los puntos en una matriz para ajustar una curva de respuesta común puede aumentar la confianza del ajuste de la curva 10,11
Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x)))
donde x es la dilutiofactor n e Y es la intensidad de la señal.
Las muestras pueden ser analizadas comparativamente con el valor y0, que en nuestro análisis corresponde al valor de y en el punto medio de los valores de x después de la asignación de aquellos en el supercurve. - Exportar los datos en Microsoft Excel y la trama y0 como en la figura 7.
- Varianza proteína intratumoral se calculó por separado para los pacientes tratados no tratados y tratados en un marco de ANOVA. Distribuciones de varianza combinando los datos de todas las proteínas analizadas se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney (MWT). Variaciones intratumorales de proteínas individuales se compararon mediante una prueba F donde las hipótesis de normalidad y homocedasticidad celebradas respectivamente evaluó mediante la Lillefours y pruebas Fligner, tasa de falso descubrimiento (FDR) corrección se aplicó 12. La expresión diferencial de proteínas entre muestras de los pacientes tratados y no tratados fue probado para cada proteína usando la t de Student prueba donde la normalidad y la homoscedasticidad suposicións se cumplieron, por lo demás MWT se realizó, FDR fue aplicado sobre valores combinados t-test y MWT 12. Importancia de la expresión de la proteína y la correlación de Pearson varianza para las proteínas se estimaron utilizando un enfoque estándar [R de referencia] y FDR aplicado 12.
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Representative Results
Un ejemplo de una diapositiva escaneada RPPA se puede ver en la Figura 4 (i) con dos canales 680 y 800 nm mostradas. La separación de las imágenes por longitud de onda, la Figura 4 (ii) permite a cada almohadilla en la diapositiva RPPA a analizar y expresión de la proteína individual determinada Figura 4 (iii). Como se puede ver en la Figura 4 (iii) la expresión de las proteínas individuales en las muestras es único con gelsolina tiene un alto nivel de expresión a través de la corredera en comparación con cMYC que tiene una expresión de la proteína mucho más baja, pero aún expresa universalmente en todas las muestras probado. En contraste CD10 dio expresión variable, con ciertas muestras dar un alto nivel de expresión a pesar de otras muestras que tienen poca o ninguna expresión detectable. Finalmente pJAK2 no produjo ninguna expresión de la proteína detectable por encima del nivel de fondo. Desde una perspectiva de control de calidad de los resultados de pJAK2 sería inaceptable mientras que los deCD10 sería aceptable debido a los niveles de expresión de proteínas detectadas de un número de muestras de la diapositiva. Figura 5 muestra pone de relieve la falta de reactividad cruzada entre los anticuerpos secundarios y los anticuerpos primarios de otra especie. Un ejemplo de la Supercurve utiliza para calcular muestras a través de una diapositiva individual se puede ver en la Figura 6. Estas curvas se utilizan para producir los datos relativos a base de proteínas de expresión tales como en la Figura 7 (ac). Figura 7a muestra los niveles de expresión de una proteína representante a través de las tres diapositivas RPPA destacan cómo RPPA puede detectar diferencias entre las muestras tratadas y no tratadas. Figura 7b se centra en los niveles de expresión diferencial de proteínas después de las muestras de la Figura 7a se han agrupado sobre la base de tratamiento, con expresión de la proteína más alta se ha encontrado que en el pretratamiento. Figura 7c se centra en la intratumoral mayorvarianza de las muestras post tratamiento después de que las muestras han sido agrupados sobre la base de tratamiento, con una mayor varianza que se encontraron en las muestras post tratamiento.
La Figura 1a. Muestra de tejido mapa de tejido asociado con el tratamiento pre tinción H & E de secciones congeladas
La Figura 1b. Muestra de tejido mapa de tejido después del tratamiento con asociado tinción H & E de secciones congeladas
Figura 2. Configuración para el ensayo de Bradford para la determinación de proteínas, including curva de calibración, tabla de resultados y formato de 96 pocillos. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Ejemplos de anticuerpos primarios adecuados y no adecuados para su uso con RPPA
Figura 4. Diagrama de flujo del proceso de exploración RPPA. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 6a. Montaje de la Red en los puntos de deslizamiento RPPA. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 6b. Ejemplo de SuperCurve que se utiliza para el análisis comparativo de todas las muestras en la diapositiva RPPA. Puntos verdes representan "aceptarcapaces de "puntos rojos representan y" atípicos "en base a los límites predefinidos en el software de análisis.
Figura 6C. Ejemplo de la reproducibilidad de las muestras manchadas, ejemplo que se muestra incluye los puntos por triplicado de las 5 diluciones de una muestra única, además de la pieza en bruto.
Figura 7a. Típico RPPA datos de una proteína (MLH1), comparado a través de varias diapositivas. Cada muestra corresponde a una región sub tumor.
Figura 7b. DIFERENCIALAl expresión de la proteína MLH1 para las muestras pre y post tratamiento.
Figura 7c. Varianza en MLH1 expresión entre las muestras pre y post tratamiento.
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Discussion
El método que aquí se presenta RPPA representa una alternativa de alto rendimiento para la técnica de transferencia rendimiento ampliamente utilizado, pero relativamente baja occidental de análisis de proteínas. El método permite a cientos de muestras a ser semi-cuantitativamente analizados y comparados simultáneamente permitiendo la comparación directa de las proteínas clave a través de una amplia selección de líneas celulares y muestras de tejidos. Multiplexación con especies diferentes de anticuerpo aumenta aún más la capacidad de la técnica permitiendo que los anticuerpos múltiples para ser usados simultáneamente. El ejemplo presentado aquí pone de relieve la capacidad de RPPA en el estudio de la heterogeneidad tumoral y el efecto de la terapia dirigida en la heterogeneidad.
Como técnica RPPA tiene una serie de pasos críticos de que la selección de anticuerpos es primordial. Debido a la naturaleza de dot blot de la especificidad del anticuerpo técnica no puede ser confirmado durante el análisis y debe ser determinado antes de su uso. En el presente estudio 83 anticuerpos fueron válidosATED en transferencias Western de los cuales sólo 58 pasaron (a prueba de velocidad de ~ 30%). De estos 58, 55 anticuerpos dieron resultados aceptables cuando los análisis sobre RPPA (95% de éxito). Otras medidas esenciales incluyen la selección de una concentración de detectar muestras en el RPPA desliza así como la uniformidad de las manchas. Una mayor concentración dará resultados más sensibles, pero puede dar lugar a un menor número de muestras que se están manchados debido a insuficiente de proteínas está presente. La cantidad mínima de tejido que proporcionará suficientes proteínas para RPPA manchado es tumor dependiente. Para RCC un mínimo de 50 mg fue utilizado que permite múltiples subsecciones de un tumor a ser análisis mientras aún se mantiene una concentración manchado de 1 mg / ml. La uniformidad de la localización es también clave como el análisis supone que todas las muestras se vio a una sola concentración, aunque esto puede ser verificado utilizando un anticuerpo proteína total después de diapositiva manchado. La consideración final es el uso de una muestra de control para ser utilizado cuando el número de muestras son tan altos queque no se pueden observar en una sola diapositiva como fue el caso en los ejemplos aquí. En el ejemplo usado aquí hemos incorporado proteína a partir de una línea celular renal, así como a partir de una línea celular de HUVEC como controles. El uso de la proteína de la línea celular permite que grandes cantidades de proteínas que se extraen y se utilizan para varias diapositivas. El control compensa cualquier error intrínseco debido al manchado o anticuerpo incubaciones y compensa las desviaciones debidas a los diferentes usuarios y las diapositivas se utilizan en días diferentes.
RPPA como técnica es flexible con respecto al número de muestras que se utilizan. Los ejemplos que aquí se presenta utiliza ~ 300 muestras procedentes de 45 muestras tumorales que se distribuyen en tres diapositivas, con 2 pastillas en cada diapositiva. Como alternativa, el formato actual podría haber sido visto en una sola diapositiva con un pad. Como tal, el formato puede ser adaptado a las necesidades individuales de los experimentos, las almohadillas más sobre un portaobjetos de los anticuerpos más pueden ser utilizados simultáneamente pero limitar el número de samplos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo de los autores FCO, DF, JN, DJH y GDS se ha mencionado anteriormente es financiado por la Oficina de Director Científico, el número de concesión: ETM37 y apoyado por el Centro de Cáncer Research UK Medicina Experimental del Cáncer. La obra de AL es financiado por el Colegio Real de Cirujanos de Edimburgo Robertson Trust, el Fideicomiso de Melville para el cuidado y la cura del cáncer y el Consejo de Investigación Médica. IO es apoyado por una beca de la Royal Society de Edimburgo Gobierno escocés cofinanciado por las acciones Marie Curie y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido. Los autores desean agradecer a SCOTRRCC cosolicitantes y colaboradores por sus útiles debates sobre algunos de los temas tratados en este documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aprotinin | Sigma | A6279 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame' four bay slide holder | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
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