Summary
Här presenterar vi en elektrofysiologisk metod baserad på fastfasbundna membran med fokus på sina ansökningar för att karakterisera electrogenic membrantransportörer.
Abstract
Den elektrofysiologiska metoden vi presenterar är baserad på en uppburen fast membran (SSM) bestående av ett skikt octadecanethiol kemisorberad på en guldbelagda sensorchip och en fosfatidylkolin monoskikt ovanpå. Detta aggregat är monterat i en kyvett innehållande referenselektroden, en klorerad silvertråd.
Efter adsorption av membranfragment eller proteoliposomer innehållande membran proteinet av intresse, är en snabb lösning för utbyte som används för att inducera transportverksamheten inom membranproteinet. I de enda lösning börsprotokollet två lösningar, är en icke-aktiverande och en aktiverande lösning behövs. Flödet styrs av trycksatt luft och en ventil och rörsystem inom en Faradays bur.
Kinetiken för electrogenic transportarbetet erhålls via kapacitiv koppling mellan SSM och proteoliposomer eller membranfragment. Metoden är därför endast ger transient strömmar. Den toppström representerar den stationära transportverksamhet. De tidsberoende transportören strömmar kan rekonstrueras genom krets analys.
Denna metod är särskilt lämpad för prokaryota transportörer eller eukaryota transportörer från intracellulära membran, som inte kan undersökas med patch clamp eller spänning metoder klämma.
Introduction
Här visar vi en ny elektrofysiologisk metod som bygger på en uppburen fast membran (SSM) för karakterisering av electrogenic membranproteiner.
Den fasta bäraren består av ett tunt guldskikt på en glasskiva, sensorchipet. Den hydrofila guldytan används för att binda tiolgruppen i en alcanethiol reagens. Efteråt avslutar selfassembly av en fosfatidylkolin monolyer bildandet av SSM.
För att mäta electrogenic reaktioner av membranproteiner är proteoliposomer eller membranfragment adsorberas på SSM (Figur 1). Proteinet innehållande membran och SSM bildar då en kapacitivt kopplad membransystem. Därför kan laddning translokation hos det protein som innehåller membran detekteras genom kapacitiv koppling via SSM. Denna metod ger endast transienta strömmar. Den toppström representerar den stationära transportverksamhet. Den tidsberoende transportör currents kan rekonstrueras genom krets analys.
Sensorn chip är monterat i en kyvett-systemet (figur 2). Kuvetten har en cylindrisk kyvett volym på 17 l (nettovolym med O-ring monterad). En fjäder kontaktstift skapar kontakt till förstärkaren. Ett utlopp kontakt är fastskruvat ovanpå av huvuddelen och uppbär referenselektroden, en klorerad silvertråd.
Kyvetten är monterad i en Faradays bur. Den är ansluten till en fluidväg, som används för att inducera transport aktiviteten av membranprotein som svar på en snabb lösning för utbyte (figur 3). I de enda lösning börsprotokollet två lösningar, är en icke-aktiverande och en aktiverande lösning krävs. Flödet styrs med tryckluft med hjälp av en programvara ventilstyrning på en dator eller manuella växlar på ett gränssnitt rutan.
Protocol
Ett. Ställa in en apparat för SSM-baserade Electrophysiology
Detaljer ges i två av våra tekniska publikationer, som även innehåller schematiska ritningar och fotografier av våra kyvetter och inrätta 1, 2. Annan lösning utbyte konfigurationer och protokoll flöde diskuteras också i vår metod papper 2.
I det följande vi lägga till några nya förbättringar och tekniska detaljer som är av direkt betydelse för videopresentation.
Ventil kontroll och datainsamling
Gränssnittet låda innehåller en kommersiell USB digital utgång / analog ingång gränssnitt (NI USB 6009 National Instruments) och drivrutinerna ventil. Den styr vätskeflödet och ansvarar för datainsamling. Ventilerna är normalt drivs med 12 V. Men för snabb omkoppling av ventilerna kan drivas med en spänning på upp till 18 V. I videon använder vi en 12 V strömkälla. </ P>
Ventilen förare kretskortet kan fungera fyra ventiler. Den var tillverkad av verkstaden vid Max Planck-institutet för biofysik. Ventilerna kan styras av datorn eller manuellt via omkopplare på frontpanelen. Det senare är praktiskt för spolning och tvättning förfaranden. Under mätningen är gränssnittet rutan datorstyrd med hjälp av en ventilstyrning och datainsamling programvara (Surfe 2 R programvara, IonGate Biosciences).
2. Beredningar
I detta avsnitt de olika protokollen för framställning av en SSM-baserade elektrofysiologi experiment nämns.
2.1 Göra lipidlösningen för bildandet av SSM
- Blanda 25 pl oktadecylamin (5 mg / ml i kloroform) och 375 | il Diphytanoylphosphatidylcholine (20 mg / ml i kloroform) i en glas injektionsflaska.
- Med hjälp av en rotationsindunstare och kontinuerligt kvävgasflöde, indunsta kloroform förca 30 min.
- Avlägsna lipiden från väggarna i glasflaskan genom skakning med 500 | il av n-dekan. Den slutliga lipidkoncentrationen är 15 mg / ml med 1:60 (w / w) oktadecylamin.
- Överför lösningen till glaset lagring flaskan. Förvara lipidlösningen vid -20 ° C.
2,2 Klorering av referenselektroden
De referenselektroder måste kloreras i regelbundna intervall på grund av nötning.
- Avlägsna resten av den gamla silverchloride lager med fint sandpapper innan klorering processen.
- Placera silvertråd tillsammans med en platinaelektrod i en 1 M saltsyralösning och klorera under 15 min vid 0,5 mA. Efter avslutad klorering, ändrar silvertråd dess färg till homogen mörkgrå.
2.3 Beredning av polyakrylamidgel bro
- Bered en lösning innehållande 100 mM KPi vid pH = 7, 100 mM KCl och 6% Akrylamid.
- Lägg 0,3% APS (10% lager) och 0,6% TEMED och kort blanda lösningen med en pipett.
- Omedelbart efter blandning av lösningen, använd en pipett för att injicera 30 ìl av blandningen i den tomma gel bro behållare. Det är viktigt att undvika luftbubblor under injektionen.
- Under en inkubationstid på 20 min gelén polymeriserar.
- Efter polymerisation gelen bron lagras i lösning (100 mM KPi pH 7, 100 mM KCl). För att förlänga livslängden av gelén bron lösningen lagrades vid 4 ° C.
2.4 Beredning av mät-lösningar
På grund av den starka växelverkan av de lösta ämnena med SSM, är elektriska artefakter genereras när lösningar av olika sammansättning utbyts. Därför är framställningen av lösningarna ett kritiskt steg. Vidta följande försiktighetsåtgärder under lösningens beredningsprocessen för att minimera artefakter lösning utbyte.
- Gör icke-aktivering och aktivering lösningar från en sats, justera pH och jonstyrka.
- Hög salt bakgrund bidrar till att minska artefakter lösning utbyte.
- Dela upp satsen lösningen i två volymer.
- Lägg den aktiverande föreningen till den aktiverande lösningen. Använd en kompenserande förening i den icke-aktiverande lösning för att hålla osmolariteten och jonstyrka av båda lösningarna så lika som möjligt.
- Om de lösningar förvaras vid 4 ° C, se till att alla lösningar uppnått rumstemperatur innan du startar en mätning, eftersom även små skillnader i temperatur kan producera artefakter.
Tre. En SSM-baserade Electrophysiology Experiment
Här presenterar vi ett typiskt protokoll för en SSM-baserade elektrofysiologiska experiment.
3.1 Förbereda SSM Setup
Medan SSM Setup inte använda rören är fyllda med en 30% etanol/ Vatten lösning för att undvika bakterietillväxt.
- Tvätta systemet med rent vatten för att avlägsna etanolen från slangen före montering av kyvetten. Byt ut etanol behållare med vatten behållare. Använda högt tryck (0,6-1,0 bar) rengöra systemet med 20-30 ml vatten.
- Upprepa rengöringen med hjälp av en 100 mM KPi buffert vid pH 7,6 eller icke-aktiverande lösning.
- Se till att inga luftbubblor kvar i vätskesystemet.
3.2 Montering av kyvetten
- Fäst en o-ring till referenselektroden
- Ta gelen bron från lagringslösningen och anslut referenselektrod.
- Prefill utloppsanslutningen med icke-aktiverande buffert, sätt en o-ring och anslut gelen bron för att slutföra monteringen referenselektroden. Var särskilt försiktig att inga luftbubblor finns vid korsningen av gelén bron och utloppet lösningen flödet väg.
- Förmontera den huvudsakliga delen av cuvette genom tillsats tappen fjäderkontakten (anslutning till förstärkaren), inloppsröret (förbindelsen till terminal ventil), o-ringen (tätning för SSM) och skruvarna.
- Med hjälp av en pincett, ta sensorchipet ur det lagrande lösning (10 mM octadecanethiol i etanol).
- Med hjälp av en pipett, tvätta bort kvarvarande lösningen med ca. 5 ml ren etanol.
- Torka elektroden under kvävgas.
- Placera sensorchipet exakt på basdelen av kyvetten så att inloppsborrningen av huvuddelen av kyvetten är riktad mot den cirkulära aktiva området av sensorn.
- Tillsätt 1 pl av lipidlösningen till den aktiva delen av sensorchipet. Se till, att guldet lagret är helt täckt av lipid.
- Omedelbart efter tillsättning av lipidlösningen, stäng kyvetten genom att lägga till den förmonterade huvuddelen.
- Innan du monterar kyvetten i Faradays bur, vara säker på att alla ytor är helt torra.
- Connect förstärkaren till fjäderkontakten stiftet och inloppsröret till terminalen ventilen. Sedan fixa kyvetten med skruvarna inuti Faradays bur.
- Skruv utloppsanslutningen till toppen av kyvetten. Slutligen ansluter utloppsröret till utloppsanslutningen och spänningsgeneratorn till referenselektroden.
- Omedelbart efter montering av kyvetten tvätta systemet med buffert vid 0,6 bar. Detta leder till spontan SSM bildning.
3.3 Mätning av membran parametrar
För att kontrollera kvaliteten på SSM, är kapacitans och konduktans mättes med hjälp av funktionen generator.
- Använda funktionsgeneratorn, applicera 100 mV DC-spänning för att mäta konduktans.
- Beräkna ledningsförmågan: Den nuvarande förfall visar laddningen av membranet kondensator. När kondensatorn är fulladdad uppmätt ström ger membranet ledningsförmågan med Ohms lag. För enkelhets skull använder vi current 1 sek efter spänningen appliceras för att beräkna konduktans G = I / U.
- Applicera en triangulär växelspänning av 50 mV topp till topp amplitud och en frekvens av 0,5 Hz för att mäta kapacitansen.
- Beräkna kapacitans: Amplituden hos den resulterande fyrkantvågen ström representerar laddningsströmmar hos kondensatorn. Kapacitansen C är lika med den överförda laddning Q = IΔt dividerat med AU = 100 mV. (AU är dubbelt pålagd spänning på 50 mV för att jag är skillnaden nuvarande positiva minus negativa lutningen av den triangulära spänning.)
- Övervaka de elektriska parametrarna för membranet upprepade gånger var 10 min i ca. 30 och 40 minuter, tills konstanta värden uppnås. Tvätta i mellan med KPi-buffert vid högt tryck i området av ca 0,6 till 1 bar.
- Uppskatta kvaliteten på SSM: Optimala parametrar är i intervallet 0,1 till 0,2 NS och 2-3,5 nF. En hög konduktans över 0,8 NS och låga kapacitans under 1 nF indikeraratt SSM inte är rätt utformad. En hög kapacitans över 4 nF kan innebära att den aktiva zonen inte täcks helt av SSM.
- Om parametrarna inte är det optimala intervallet, bör membranet kasseras och annan SSM beredda, med hjälp av en nyligen beredd elektrod chip.
3.4 Kontroll efter artefakter lösning utbyte
Efter membranet parametrarna har kontrollerats, skall mät buffertar testas för artefakter lösning utbyte.
- Sätt respektive lösningsbehållare till vätskesystemet.
- Avlägsna luftbubblor från vätskesystemet, med hjälp av manuella ventiler.
- Använda datainsamling programvara valde flödet protokoll som du vill använda i experimentet.
- Justera trycket till 0,6 bar och starta mätningen.
- Bortsett från de mekaniska ventil switching artefakter, bör helst inte artefakt strömmar mätas eller de bör vara mycket smaller än de förväntade signalerna protein transporter. Om lösningen utbyte artefakter observeras, försöka optimera buffertkompositioner och / eller beredningen förfarandet innan du fortsätter experimentet.
3.5 Lägga proteinprovet
Vanligtvis proteoliposomer eller fragment membran lagras frysta vid -80 ° C. För en mätning en alikvot på ungefär 30 ^ behövs.
- Skölj SSM med icke-aktiverande lösning.
- Tina proteinprovet på is.
- Tre 10-sek ultraljudsbehandling cykler varvas med 10-sek Kyla intervaller på is. Proteoliposomer sonikeras med en badsonikator. För membranfragment ett tips sonicator (50W, 30 kHz, 1 mm sonotrode diameter, intensitet 20%, cykel 0.5) används. Efter den sista sonikeringssteg inte sätta provet tillbaka på isen, men injicera det direkt i kyvetten.
- Skruva utloppsanslutningen tillsammans med referenselektroden Assembly.
- Med hjälp av en pipett, aspirera 30 ^ proteinprovet och montera pipettspetsen till utloppsborrning.
- Öppna den manuella ventilen i den icke-aktiverande väg till avfallsbehållare och injicera proteoliposomer i kyvetten volymen. Var noga med att inte injicera luft i kyvetten volymen med sensorn.
- Innan du tar bort pipettspetsen, stäng den manuella ventilen för att förhindra ytterligare lösning flöde.
- Låt proteoliposomer att adsorbera till SSM för en inkubationstid på 1 till 2 timmar. Det är också möjligt att inkubera över natten.
3.6 Generell procedur av en SSM-baserade experiment
- Värm upp de mätmetoder buffertar i tiden, om den förvaras vid 4 ° C. Alla mätsystem buffertar måste ha rumstemperatur innan du startar mätningen för att undvika artefakter.
- Vid byte av lösningar, först rengöra rören inuti lösningsbehållare med en icke-fuzzing vävnad, sedan in de nya flaskorna.
- Innan du påbörjar mätningen, använd manuella ventiler för att avlägsna luftbubblor som kan ha utvecklats från den förändrade proceduren.
- Justera trycket precis innan en mätning. Vi använder rutinmässigt ett tryck av 0,6 bar, som vid vår specifika ventil och slang konfiguration ger en flödeshastighet av ca 1,0 ml / sek.
- De första få mätningar kan utföras direkt efter varandra och bör gälla till toppströmmen förblir konstant. Om lösningarna skiljer sig åt i pH en inkubationstid av minst 3 min behövs för att anpassa det inre pH hos proteoliposomer innan mätningen startar.
- Nu uppsättningen är upp redo för mätning. För att minska bullret minst 3 mätningar bör göras och medelvärde.
3.7 kontrollmätningar
En signal genomgång under en serie av mätningar kan inträffa på grund av proteinnedbrytning eller en förlust av adsorption. Varje SSM experiment ska jagnclude en nedsliten kontroll. Detta görs genom upprepade mätningar med identiska lösningar. Den minimala nedsliten styrorgan en mätning i början och en i slutet av försöket, med samma lösning.
Vi rekommenderar att göra nedsliten kontroll under förhållanden där du förväntar dig den högsta toppen amplituden i experimentet. Detta gör det lättare att kvantifiera genomgång av signalen.
Signalen nedsliten kan kvantifieras genom en jämförelse av de högsta amplituderna för de två rundown kontroller. Den resulterande procentvärde kan användas för att korrigera de uppmätta signalerna genom att anta en linjär tid beroende av nedsliten.
3,8 Artifact kontroller
Om möjligt försök att validera dina resultat genom att hämma proteinet av intresse efter experimentet. Kvarvarande signaler troligen lösning utbyte artefakter. Signalerna måste sedan korrigeras för de uppmätta artefakter.
- Tvätta systemet med 20-30 ml rent vatten och 20 till 30 ml 30% etanol / vatten. Den etanollösningen undviker bakteriell tillväxt när systemet inte används.
- Efter denna rengöring, släpp ut trycket ur systemet och stäng av alla instrument.
- Avlägsna kyvetten från Faradays bur och demontera den. Alla delar av kyvetten kan rengöras med vatten och ren etanol, om så är nödvändigt, med hjälp av en badsonikator.
- Placera sensorn chip i ett glas bägare med ren etanol. Sonikera bägaren under ca 1 till 2 minuter med användning av en badsonikator.
- Torka sensorchipet under kvävgas.
- Förvara sensorchipet borta från ljus i en 10 mM Octadecanthiol etanollösning. Efter en inkubationstid av ca 30 min sensorchipet är klar för återanvändning.
Representative Results
Hittills var SSM-baserade elektrofysiologi används för att karakterisera mer än 20 transportörer, mestadels av prokaryot ursprung, t ex Melb 3, NhaA 4 och PutP 5 (sammanfattade i 6). Men även eukaryota transportörer från intracellulära membran, t.ex. ClC7 7 samt jonkanaler, t.ex. nikotinacetylkolinreceptorn 8 har undersökts.
Här presenterar vi som exempel mätningar av socker / H + cotransporter Lacy från Escherichia coli med proteoliposomer med minst 85% rätt sida ut orienterad Lacy vid en LPR av 5 9, 10. Vi fokuserar på de viktigaste stegen som leder till en minimal kinetisk modell för detta transportprotein.
Ett. Elektrofysiologisk karakterisering av vildtyp Lacy
Det första steget är en allmän karakterisering av electrogenic reaktionen genom att mäta olika pH-värden (
Den pH-beroende av Lacy visar två olika electrogenic reaktioner. De kapacitivt kopplade strömmen ökar mellan pH 5 och pH 8,5, men också ändrar sin form. Under alkaliska förhållanden steady state transporter observeras, medan sura pH-värden bara en snabb electrogenic reaktion kvarstår. För att skilja de stationära signaler från de snabba electrogenic reaktioner vi använt krets analys för att rekonstruera transportörer strömmar (Figur 6).
Vid pH 7 den monofasiska signalen blir bifasisk. Detta tyder också på att det finns två olika electrogenic reaktioner. Uppskattat från den överförda laddningen (integral av signalerna), de två reaktionerna har ungefär 6% och 94% av den totala electrogenicity av transporten cykeln.
ove_step "> 2. Tilldelning av electrogenic reaktionerOm du vill tilldela de två electrogenic reaktioner på vissa steg i reaktionen cykel av Lacy, var E325A Lacy varianten mätas (figur 7). Denna variant visar bara laktos utbyte men är bristfälliga för alla aktiva transportsätt, på grund av hämning av proton release. Signalen av E325A Lacy representerar en snabb övergående och är konstant för alla uppmätta pH-värden. Formen och amplituden hos signalen liknar signalen hos vildtyp Lacy under sura betingelser. Dessutom vi observerar en liten negativ fas efter den sjunkande toppströmmen, vilket är karakteristiskt för snabba transienta strömmar mätt i kapacitivt kopplade system. Eftersom laktos bindande och utsläpp är inte electrogenic måste snabbt övergående korrelerar med en electrogenic konformationsanalys övergång efter laktos bindande.
Det är känt att protonen frisättning steget är hastighet Limiting för Lacy omsättning i laktos koncentrationsgradienten driven transportsätt. I detta fall förväntar vi oss en ökning av transporter takt med alkaliskt pH, eftersom proton utsläpp gynnas. Detta är fallet för den stationära transport korrelerad signal hos vildtyp Lacy. Dessutom det kunde visas genom pH-gradient mätning som endast den inre pH-värdet påverkar den stationära transport av Lacy (opublicerad). Därför stora electrogenic reaktionen kan hänföras till protonen frisättning steget.
Tre. Mätningar för kinetisk analys
Efter identifiering av electrogenic reaktioner på och utanför fraktsatser bestämdes med hjälp av en SSM Setup med en hög tidsupplösning på ca 4,5 msek. Detta är bara möjligt under förhållanden, då en reaktion dominerar signalen. I detta fall hastighetskonstanterna kan härledas från de transienta strömmar som övervägs av tidsupplösning av signalerna med hjälp av en iterativ minsta kvadrat de faltning algoritmen (Figur 8). De bestämda hastighetskonstanter samt den föreslagna minsta kinetiska modellen (Figur 9) slutligen användes för simulering av transportören kinetik. De simulerade kurvorna reproducera SSM uppgifter som dessutom bevisar den kinetiska modellen.
Figur 1. Adsorption geometri proteoliposomer på SSM. SSM är bildad på ett sensorchip, ett strukturerat guldbelagda glasskiva. För att mäta electrogenic reaktioner av membranproteiner är proteoliposomer eller membranfragment adsorberas till SSM. De två membranen bildar ett kapacitivt kopplat system. Det är därför endast transienta strömmar upptäcks.
tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg "/>
Figur 2. SSM kyvetten bär sensorchipet och referenselektroden. Sensorchipet är inklämt mellan kyvettens bas och kyvetten huvudet. Referenselektroden är isolerad från flödet väg genom en polyakrylamidgel saltbrygga.
Figur 3. Fluidbana och Elkretsanalys av SSM Setup. Hos den enda lösningen börsprotokollet endast en icke-aktiverande (NA) och en aktiverande (A)-lösning krävs. Flödet styrs av två 2-vägs ventiler (V1) och en terminal ventil (V2). De terminala Ventilen växlar mellan icke-aktiverande och aktiverande lösningar, rikta en av lösningarna till kyvetten och den andra lösningen till en avfallsbehållare (W). Sensorn chip (SSM) är ansluten till förstärkaren (I / U), medan referenselektroden (AgCl) är ansluten till funktionsgenerator (F) i yttre elektriska kretsen. En dator (PC) och ett gränssnitt låda används för ventil drift och datainsamling.
Figur 4. Transienta strömmar mäts med vildtyp Lacy proteoliposomer efter 100 koncentration mM laktos hoppar vid olika pH-värden. Den icke-aktiverande lösningen innehöll 100 mM glukos medan den aktiverande lösningen innehöll 100 mM laktos. Alla lösningar framställdes i 100 mM kaliumfosfatbuffert vid det angivna pH-värdet med 1 mM DTT. För detaljer om mätvillkor i detta och följande figurer hänvisas till 9 och 10.
ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg "/>
Figur 5. Genomsnittsberäknade normaliserade toppströmmar mätt med vildtyp Lacy proteoliposomer efter laktoskoncentration hoppar vid olika koncentrationer och pH-värden. The K M-värden erhålles från hyperboliska passar.
Figur 6. Rekonstruktion av transportmolekyler strömmar. De övergående strömmar (A) som används för att rekonstruera transportören strömmar (B) mättes med vildtyp Lacy proteoliposomer efter 100 koncentration mM laktos hoppar vid pH 8,5 (blå spår) och pH 5,2 (röd spår). Vid pH 8,5 kontinuerlig omsättning observeras medan vid pH 5,2 snabb electrogenic reaktion inträffar. Detta framgår tydligt observeras i den rekonstruerade ström (B).
files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg "alt =" Bild 7 "fo: innehåll-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg "/>
Figur 7. Transient ström uppmätt med E325A Lacy proteoliposomer efter en 100 mM laktos koncentration hoppa vid pH 5,2. Hämmas i proton frisättning steget i transportcykel och därmed transport-deficient Denna LACY varianten. Den lilla negativa komponenten observeras är karakteristisk för snabba transienta strömmar mätt i kapacitivt kopplade system och orsakas av utsläpp av membranet kapacitans efter en snabb electrogenic reaktion. Dess tidskonstant π0 bestäms av kapacitanser och konduktanser i systemet (Figur 1).
Figur 8. Övergående strömmar som mäts med vildtyp Lacy proteoliposomer after olika laktoskoncentration hoppar vid pH 5,2. Under dessa förhållanden ingen steady state transporter observeras, men en electrogenic konformationsanalys övergång vid laktos bindning. Den streckade linjen visar överföringsfunktionen representerar tidsupplösningen av systemet. Den infällda bilden visar bestämningen av på och av hastighetskonstanterna från de observerade hastighetskonstanter Kobs med en hyperbolisk passning till data. Den observerade Hastighetskonstanten bestämdes från de transienta strömmar med en iterativ minsta kvadrat deconvolution algoritm 10.
Figur 9. En kinetisk modell för reaktionen cykel av Lacy. Två electrogenic steg kunde identifieras och karakteriseras av SSM mätningar. Ett starkt electrogenic reaktion representerar ~ 94% av den totala avgiften förskjutning i reaktionencykeln endast observeras vid neutrala och basiska pH-värden. Det skulle kunna tilldelas proton frisättning steget (blå pil). En svagt electrogenic steg observeras vid surt pH när kontinuerlig omsättning av vildtyp Lacy inhiberas. Vi tilldelas denna reaktion till en electrogenic konformationell övergång vid laktos bindning, vilket motsvarar 6% av den totala avgiften förskjutning i reaktionen cykeln.
Discussion
Ett. Fördelar med SSM-baserade elektrofysiologi jämfört med konventionella metoder
SSM-baserade elektrofysiologi har visat sig vara ett värdefullt verktyg i den elektrofysiologiska verktygslådan. Det är särskilt användbart i fall där konventionen elektrofysiologi, nämligen patch clamp och spänning metoder klämma, inte kan tillämpas: Bortsett från några få undantag bakteriella transportörer inte kan undersökas med hjälp av spänning klämma eller patch metoder klämma på grund av den lilla storleken av bakterier och eftersom de är svåra att uttrycka i däggdjursceller eller oocyter. Men också fysiologiskt relevanta däggdjurs transportörer kan undersökas. I detta fall SSM-baserade elektrofysiologi är attraktivt för transportörer från intracellulära membran och sålla bort ansökningar inom läkemedelsforskning på grund av dess robusthet och dess potential för automation.
SSM-basedUsing konventionell elektrofysiologi, tidsupplöst karakterisering av transporters är utmanande. Eftersom omsättningen av transportörer är låg en "gigantisk lapp" eller en "hel cell konfiguration behövs, vilket har en inneboende låg tidsupplösning på en lösning utbyte experiment. Den komplikation kan övervinnas med hjälp fotolytiska substrat release. Emellertid är endast ett begränsat antal substrat lämpade för detta tillvägagångssätt. Här snabb lösning utbyte vid SSM erbjuder en unik möjlighet att utföra elektrofysiologiska studier med hög tidsupplösning med godtyckliga substrat.
2. Begränsningar och kritiska stegen
I motsats till patch clamp-och spännings-tekniker klämma, kan SSM-baserad elektrofysiologi inte användas för att applicera en potential. Transporter karakterisering begränsas därför på transporter som inte är beroende av ett membran potential.
I allmänhet, har SSM-baserade elektrofysiologi inga begränsningar för den typ av (electrogenic) transportör. Men spänning clamp eller patch clamp metoder kan ha fördelar, om intracellulära komponenter som bindande proteiner krävs för proteiner fungerar.
Begränsningar kan uppstå, om lösningen utbyte skapar stora artefakt strömmar. Detta händer när substratet interagerar starkt med SSM som i fallet med lipofila föreningar. Artifact kontroller kan användas för att korrigera de uppmätta signalerna. Dessutom hög salt bakgrund i alla mät buffertar kan användas för att reducera artefakter. Men i fall där storleken av artefakten är jämförbar till proteinet signalen är det nästan omöjligt att isolera proteinet relaterade signalen från artefakt. Lyckligtvis höga artefakter är ovanligt i en optimerad lösning utbyte.
Det finns några steg som är avgörande för ett framgångsrikt genomförande av en SSM-baserade elektrofysiologi experiment. Framställningen av proteinet provet är den viktigaste delen. Om proteoliposomer används, vara säker på reconstitution förfarande ger en ren, reproducerbar prov av en tillräcklig LPR och transportören är orienterad på rätt sätt. LPR kan kontrolleras genom frys fraktur elektronmikroskopi och orientering genom en ELISA-experiment om antikroppar är tillgängliga.
Använd endast en SSM som visar optimala parametrar för inkubering av proteinet provet. Injektionen av proteinet är ett kritiskt steg. Sonikering är viktigt och luftbubblor bör undvikas under injektionen. Efter provet inkubation mätningarna själv är kritisk, eftersom luftbubblor kommer att ta bort den adsorberade proteinprovet från sensorchipet. Därför alltid bort luftbubblor efter byte lösningar. Icke desto mindre en signal nedsliten kan förekomma. För att korrigera en eventuell signal nedsliten, är det viktigt att åstadkomma nedslitna kontroller under experimentet.
Tre. Specialiserade system
SSM-Setup kan modifieras enligt sin ansökan. Dessutom var THär är helt olika, högt specialiserade inställningar tillgängliga.
Det finns möjlighet att mäta protein signaler enligt asymmetriska förhållanden, t.ex. inom ramen för en pH-gradient. Att etablera asymmetriska buffertkompositioner inom och utanför proteoliposomer en tredje lösning, den vilande lösningen, måste införas och detta kräver en dubbel utbyte konfiguration. Här ytterligare trevägsventil växling mellan icke-aktiverande och vila lösningar krävs.
För att öka tiden upplösningen av det system vi utvecklat ett alternativt flöde bana saknar terminalen ventilen, men använder en annan typ av kyvetten. Här korsningen av aktiverande och icke-aktiverande lösningen ligger inne i kyvetten, 3 mm framför SSM. Denna inställning är väl lämpad för kinetisk analys av snabba transportprocesser. Det kunde visas att en tidsupplösning så lite som 2 ms är möjlig.
Kommersiell fUlly automatiserade system finns tillgängliga som syftar till en betydligt högre genomströmning för narkotika screening. En rörlig enhet samlar lösningar och sprutar dem på sensorytan i 96-brunnars plattor i en standard mikrotiterplattformat.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar J. Garcia-Celma, jag Smirnova och R. Kaback för bidrag till de Lacy mätningar och E. Bamberg för stöd och bra diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
| Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
| 2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
| Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
| Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
| Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| 100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
| O-rings | Seal Science Inc. | ||
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
| Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
| Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
| Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Amplifier | Keithley | 427 | |
| Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
| USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
| Regeants | |||
| 1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
| Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
| n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
| Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
| Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
| α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 | |
References
- Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes. Biophys. J. 64, 384-391 (1993).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K.
- Garcia-Celma, J. J., et al. Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).
- Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study. J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).
- Zhou, A., et al. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli. J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).
- Ganea, C., Fendler, K. Bacterial transporters: charge translocation and mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).
- Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect. PLoS ONE. 5, e12585 (2010).
- Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. Measuring ion channels on solid supported membranes. Biophys. J. 97, 388-396 (2009).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K.
- Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport. Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).
