Summary
Her præsenterer vi en elektrofysiologisk metode baseret på solide understøttede membraner med fokus på deres ansøgninger om karakterisering af elektroanalysen membran transportproteiner.
Abstract
Den elektrofysiologiske metode præsenterer vi bygger på et solidt understøttet membran (SSM) bestående af et octadecanethiol lag kemisorberes på en guldbelagt sensor chip og en phosphatidylcholin monolag på toppen. Denne er monteret i en kuvette indeholdende reference elektrode, en chloreret sølvtråd.
Efter adsorption af membranfragmenter eller proteoliposomer indeholdende membranprotein af interesse, er en hurtig løsning udveksling anvendt til at inducere transport aktivitet membranprotein. I de enkelt løsning udvekslingsregelsæt to løsninger, er en ikke-aktiverende og én aktiverende løsning nødvendig. Strømningen styres af trykluft og en ventil og slange-system inden for et Faradays bur.
Kinetikken for elektroanalysen transport aktivitet opnås via kapacitiv kobling mellem SSM og proteoliposomer eller membranfragmenter. Fremgangsmåden er derfor kun giver transient strømme. Spidsstrømmen repræsenterer den stationære transport aktivitet. De tidsafhængige transporter strømme kan rekonstrueres ved kredsløb analyse.
Denne metode er især velegnet til prokaryote transportører eller eukaryote transportører fra intracellulære membraner, som ikke kan undersøges af patch clamp eller spændingsklemme metoder.
Introduction
Her viser vi en ny elektrofysiologiske tilgang baseret på et solidt understøttet membran (SSM) til karakterisering af elektroanalysen membranproteiner.
Det faste underlag består af et tyndt lag guld på en glasplade, sensorchippen. Den hydrofile guld overflade bruges til at binde thiolgruppe af en alcanethiol reagens. Bagefter selfassembly af phosphatidylcholin monolyer fuldender dannelsen af SSM.
At måle elektrogen reaktioner membranproteiner, er proteoliposomer eller membranfragmenter adsorberet til SSM (figur 1). Proteinet indeholder membranen og SSM så danne en kapacitivt koblet membran-system. Derfor kan ladning translokation på proteinholdige membranen påvises ved kapacitiv kobling via SSM. Denne metode giver kun forbigående strømme. Spidsstrømmen repræsenterer den stationære transport aktivitet. Den tidsafhængige transportør currents kan rekonstrueres ved kredsløb analyse.
Sensorchippen er monteret i en kuvette (figur 2). Kuvetten har en cylindrisk kuvette volumen på 17 pi (nettovolumen med o-ring monteret). En fjeder kontakt pin skaber kontakten til forstærkeren. Et udløb stik er skruet til toppen af hoveddelen og bærer reference elektrode, en chloreret sølvtråd.
Kuvetten er monteret i et Faradays bur. Den er forbundet til en fluid vej, der anvendes til at inducere transport aktivitet af membranprotein i respons på en hurtig løsning udveksling (figur 3). I de enkelt løsning udvekslingsregelsæt to løsninger, er en ikke-aktiverende og én aktiverende løsning nødvendig. Strømmen styres af trykluft ved hjælp af en ventil kontrol software på en computer eller manuelle kontakter på et interface kassen.
Protocol
1.. Opsætning af en Apparater til SSM-baserede Elektrofysiologi
Detaljer er givet i to af vores tekniske publikationer, som også indeholder skematiske tegninger og fotografier af vore kuvetter og oprette 1, 2. Anden løsning udveksle konfigurationer og flow protokoller er også drøftet i vores metode papir 2.
I det følgende vil vi tilføje et par nylige forbedringer og tekniske detaljer, der er af direkte relevans for den video præsentation.
Ventil kontrol og dataopsamling
Interfacet boks indeholder en kommerciel USB digital udgang / analog indgang interface (NI USB 6009 National Instruments) og ventil drivere. Den styrer løsningen flow og er ansvarlig for dataindsamling. Ventiler normalt køres med 12 V. Men for hurtigt at skifte ventilerne kan køres med en spænding på op til 18 V. I videoen bruger vi en 12 V strømforsyning. </ P>
Ventilen driver kredsløb kan betjene fire ventiler. Den blev produceret af værkstedet for Max Planck Institut for Biofysik. Ventiler kan styres af computeren eller manuelt via kontakter på frontpanelet. Sidstnævnte er bekvemt for skylning-og rengøring-procedurer. Under målingen, er grænsefladen box computer-kontrollerede ved hjælp af en ventil kontrol og dataopsamling software (SURFE 2 R-software, IonGate Biosciences).
2.. Forberedelser
I dette afsnit de forskellige protokoller til fremstilling af en SSM-baserede elektrofysiologiske eksperiment er nævnt.
2.1 Gøre Lipid løsning til dannelse af SSM
- Bland 25 gl octadecylamin (5 mg / ml i chloroform) og 375 pi Diphytanoylphosphatidylcholine (20 mg / ml i chloroform) i en glas hætteglas.
- Anvendelse af en rotationsfordamper og kontinuerlig nitrogengasstrøm, chloroformen fordampe foromkring 30 min.
- Fjern lipid fra væggene i hætteglas ved omrystning med 500 pi af n-decan. Den endelige lipidkoncentration er 15 mg / ml med 1:60 (w / w) octadecylamin.
- Opløsningen overføres til glasset opbevaring hætteglasset. Opbevar lipid opløsning ved -20 ° C.
2.2 Chlorering af referenceelektroden
De referenceelektroder skal chloreres med regelmæssige mellemrum på grund slid.
- Fjerne resten af den gamle silverchloride lag med fint sandpapir før chloreringsprocessen.
- Placer sølvtråd sammen med en platinelektrode i en 1 M saltsyreopløsning og chlorinate i 15 minutter ved 0,5 mA. Efter endt chlorering, ændrer sølvtråd sin farve til en homogen mørk grå.
2.3 Fremstilling af polyacrylamidgel bro
- Der fremstilles en opløsning indeholdende 100 mM KPi ved pH = 7, 100 mM KCI og 6% Acrylamid.
- Tilføj 0,3% APS (10% Lager) og 0,6% TEMED og kort blande opløsningen med en pipette.
- Umiddelbart efter blanding løsningen, brug en pipette til at injicere 30 ul af blandingen i den tomme gel bro container. Det er vigtigt at undgå luftbobler under injektionen.
- Under en inkubationstid på 20 minutter gelen polymeriserer.
- Efter polymerisation gel bro lagres i opløsning (100 mM KPi pH 7, 100 mM KCI). At forlænge levetiden af gelen broen opløsningen opbevares ved 4 ° C.
2.4 Fremstilling af måleopløsningerne
På grund af den stærke vekselvirkning af opløste stoffer med SSM, er elektriske artefakter genereres, når opløsninger af forskellig sammensætning udveksles. Derfor udarbejdelsen af løsningerne er et afgørende skridt. Tag følgende forholdsregler under løsningen forberedelsesprocessen for at minimere løsning udveksle artefakter.
- Gør ikke-aktivering og aktivering løsninger fra én batch, justere pH og ionstyrke.
- High salt baggrund hjælper med at reducere løsning udveksle artefakter.
- Opdel batch-løsning i to bind.
- Tilsæt aktiverende forbindelse til den aktiverende opløsning. Brug en kompenserende forbindelse i ikke-aktiverende løsning til at holde osmolariteten og ionstyrken af begge opløsninger så ens som muligt.
- Hvis opløsninger opbevares ved 4 ° C, så sørg for, at alle løsninger nået stuetemperatur, før du starter en måling, fordi selv små forskelle i temperatur kan producere artefakter.
3.. En SSM-baserede Elektrofysiologi Experiment
Her præsenterer vi en typisk protokol for en SSM-baseret elektrofysiologisk eksperiment.
3.1 Klargøring af SSM Setup
Mens SSM Setup ikke er i brug rørene er fyldt med en 30% ethanol/ Vand-opløsning for at undgå bakterievækst.
- Vask systemet med rent vand for at fjerne ethanol fra slangen før montering kuvetten. Udskift ethanol beholdere med vandbeholdere. Brug højt tryk (0,6-1,0 bar) rense systemet med 20-30 ml vand.
- Gentag rengøringen procedure ved hjælp af en 100 mM KPi buffer ved pH 7,6 eller ikke-aktiverende løsning.
- Sørg for, at der ikke er luftbobler tilbage i væsken system.
3.2 Montering af kuvetten
- Vedhæfte en O-ring til reference elektrode
- Tag gel broen fra lagerløsning og tilslut reference elektrode.
- Prefill udløbet stik med ikke-aktiverende puffer, indsætte en O-ring og tilslut gelen bro for at fuldføre henvisningen elektrodekonstruktion. Vær særlig forsigtig, at der ikke er luftbobler i krydset af gelen broen og udløbet vaskemiddeltilførselssystemet vej.
- Preassemble den vigtigste del af cuvette ved tilsætning fjederen kontaktstift (forbindelsen til forstærkeren), indløbsrøret (tilslutning til terminalen ventil), at O-ringen (forsegling for SSM) og skruerne.
- Ved hjælp af en pincet, sensorchippen tage ud af lagringen opløsning (10 mM octadecanethiol i ethanol).
- Ved hjælp af en pipette, afvaskes den resterende opløsning med ca. 5 ml ren ethanol.
- Tør elektroden under nitrogengas.
- Placer føleren chippen på bunddelen af kuvetten således at indløbshullet for den vigtigste del af kuvetten er rettet mod det cirkulære aktive område af sensoren.
- Tilsæt 1 pi af lipidopløsningen til det aktive område af sensoren chip. Sørg, at guldet lag er fuldt dækket af lipid.
- Umiddelbart efter tilsætning af lipidopløsning, lukke kuvetten ved at tilføje den færdigsamlede vigtigste del.
- Før montering af kuvetten ind i Faradays bur, være sikker på at alle overflader er helt tørre.
- Connect forstærkeren til foråret kontaktstift og indløbsrøret til terminalen ventilen. Så fix kuvetten med skruerne inde i Faradays bur.
- Skru tilslutningsstykke til toppen af kuvetten. Endelig forbinde udløbsrøret til outlet konnektoren og spænding generatoren til referenceelektroden.
- Umiddelbart efter monteringen på kuvetten vaskes systemet med buffer ved 0,6 bar. Dette fører til spontan SSM dannelse.
3.3 Måling membran parametre
For at kontrollere kvaliteten af SSM, er kapacitans og ledningsevne målt ved hjælp af funktionen generator.
- Brug af funktionen generator, 100 mV DC spænding gælder at måle ledningsevne.
- Beregn ledningsevne: Den aktuelle forfald viser opladning af membranen kondensator. Når kondensatoren er fuldt opladet de målte løbende afkast membranen ledningsevne ved hjælp Ohms lov. For nemheds skyld bruger vi cut aktuelle 1 sek efter spændingen anvendes til at beregne ledeevne G = I / U.
- Påfør et trekantet vekselspænding på 50 mV spids til spids amplitude og en frekvens på 0,5 Hz til måle kapacitans.
- Beregn kapacitans: Amplituden af den resulterende firkantbølge strøm repræsenterer ladestrømme i kondensatoren. Den kapacitans C er lig med den overførte ladning Q = IΔt divideret med Au = 100 mV. (Au er dobbelt påtrykt spænding på 50 mV fordi jeg er forskellen nuværende positive minus negativ hældning på trekantet spænding.)
- Overvåge de elektriske parametre af membranen flere gange hver 10 min til ca. 30 og 40 minutter, indtil konstante værdier er opnået. Vask i mellem med KPi buffer ved højt tryk i området fra omkring 0,6 til 1 bar.
- Estimere kvaliteten af SSM: Optimale parametre er i området fra 0,1 til 0,2 ns og 2 og 3,5 nF. En høj konduktans over 0,8 ns og lav kapacitans under 1 nF angiverat SSM ikke er korrekt udformet. En høj kapacitans over 4 nF kan betyde, at den aktive zone ikke er dækket helt af SSM.
- Hvis parametrene ikke er i det optimale område, bør membranen kasseres og en anden SSM fremstilles ved hjælp af en frisklavet elektrode chip.
3.4 Kontrol til opløsning udveksling artefakter
Efter membran parametre er blevet kontrolleret, bør måle buffere testes for løsning udveksling artefakter.
- Indsæt de respektive opløsningsbeholdere til væskesystemet.
- Fjerne luftbobler fra væskesystemet, ved hjælp af manuelle ventiler.
- Brug af dataopsamlingssoftware valgte flow protokol, du vil bruge i dit eksperiment.
- Justere trykket til 0,6 bar og start målingen.
- Bortset fra de mekaniske ventil omskiftningsartefakter, bør ideelt ingen artefakt strømme måles eller de bør være meget smaller end de forventede protein transport signaler. Hvis løsningen udveksle artefakter overholdes, så prøv at optimere puffersammensætninger og / eller forberedelse procedure, før du fortsætter eksperimentet.
3.5 Tilføjelse proteinet prøven
Normalt proteoliposomer eller membranfragmenter opbevares nedfrosset ved -80 ° C. For en måling en portion på ca 30 pi er nødvendig.
- Skyl SSM med ikke-aktiverende løsning.
- Tø proteinet prøven på is.
- Tre 10-sec lydbehandling cykler vekslede med 10 sek køling mellemrum på is. Proteoliposomer er sonikeres ved hjælp af en bad-sonikator. For membranfragmenter et tip sonikator (50W, 30 kHz, 1 mm sonotrode diameter, intensitet 20%, cykle 0.5) anvendes. Efter det sidste lydbehandlingstrin ikke sætte prøven igen på is, men injicere det straks i kuvetten.
- Skru udgangskonnektor sammen med henvisningen elektrode Assembly.
- Ved hjælp af en pipette, sug 30 ul af proteinet prøven og montere pipettespidsen udløbsboringen.
- Åbn den manuelle ventil i den ikke-aktiverende vej til affaldsbeholderen og injicere proteoliposomer i kuvetten volumen. Vær forsigtig med ikke at injicere luft ind i kuvetten volumen med sensoren.
- Før du fjerner pipettespidsen, luk manuelle ventil for at forhindre yderligere løsning flow.
- Lad proteoliposomer at adsorbere til SSM for en inkubationstid på 1 til 2 timer. Det er også muligt at inkubere natten over.
3.6 Generel fremgangsmåde for et SSM-baseret eksperiment
- Varm op måle-buffere i gang, hvis opbevaret ved 4 ° C. Alle måleteknik buffere nødt til at være ved stuetemperatur, før du starter målingen for at undgå artefakter.
- Når du skifter løsninger først rense rørene inde i opløsningsbeholdere med en ikke-fnugdannelse væv, derefter indsætte de nye flasker.
- Før du starter målingen, skal du bruge den manuelle ventiler for at fjerne luftbobler, som kunne have udviklet sig fra det skiftende procedure.
- Justere trykket lige før du starter en måling. Vi anvender rutinemæssigt et tryk på 0,6 bar, hvilket på vores specifikke ventil og rør konfiguration giver en strømningshastighed på ca 1,0 ml / sek.
- De første få målinger kan udføres lige efter hinanden og bør forkastes indtil spidsstrømmen forbliver konstant. Hvis løsninger afviger i pH en inkubationstid på mindst 3 minutter er nødvendig for at justere den indre pH proteoliposomer før målingen.
- Nu opsætningen er klar til måling. For at reducere støjen mindst 3 målinger bør foretages og beregnes.
3.7 kontrolmålinger
Et signal nedslidt i løbet af en række målinger kan opstå på grund af protein nedbrydning eller tab af adsorption. Hver SSM eksperiment skal jegnclude et nedslidt kontrol. Dette gøres ved gentagne målinger med identiske løsninger. Den minimale nedslidt kontrol betyder én måling i begyndelsen og en i slutningen af forsøget, med den samme løsning.
Vi anbefaler at gøre nedslidt under forhold, hvor du forventer den højeste top amplitude i eksperimentet. Dette gør det lettere at kvantificere nedtrapning af signalet.
Signalet nedslidt kan kvantificeres ved en sammenligning af størrelsen af udsvingene i de to nedslidte kontrol. Den resulterende procentvise værdi kan anvendes til at korrigere de målte signaler ved at antage en lineær tidsafhængighed nedslidt.
3.8 Artifact kontrol
Hvis det er muligt forsøge at validere dine resultater ved at hæmme proteinet af interesse efter forsøget. Resterende signaler er formentlig løsning udveksling artefakter. De signaler så skal korrigeres for de målte artefakter.
- Vask systemet med 20-30 ml rent vand og 20-30 ml 30% ethanol / vand. Den ethanolopløsning undgår bakterievækst, når systemet ikke er i brug.
- Efter denne rengøring procedure, slipper trykket fra systemet og sluk for alle instrumenter.
- Tag kuvetten fra Faradays bur og afmontere det. Alle dele af kuvetten kan rengøres med vand og ren ethanol, om nødvendigt ved hjælp af en bad-sonikator.
- Placer sensoren chip i et glas bæger med ren ethanol. Sonikeres bægerglasset i ca 1 til 2 min ved hjælp af en bad-sonikator.
- Tør sensorchippen under nitrogengas.
- Opbevar sensorchippen væk fra lys i en 10 mM Octadecanthiol ethanolopløsning. Efter en inkubationstid på omkring 30 min sensorchippen er klar til genbrug.
Representative Results
Indtil nu blev SSM-baserede elektrofysiologi anvendes til at karakterisere mere end 20 transportører, overvejende af prokaryot oprindelse, f.eks Melb 3, NhaA 4 og PutP 5 (opsummeret i 6). Men også eukaryote transportvirksomheder fra intracellulære membraner, fx ClC7 7 samt ionkanaler, f.eks nikotinacetylcholinreceptoren 8 er blevet undersøgt.
Her præsenterer vi et eksempel målinger af sukker / H + cotransporter LACY fra Escherichia coli ved hjælp proteoliposomer med mindst 85% højre side ud orienteret lacy ved en LPR af 5 9, 10. Vi fokuserer på de vigtigste skridt, der fører til en minimal kinetisk model af denne transport protein.
1.. Elektrofysiologisk karakterisering af vildtype lacy
Det første trin er en generel karakterisering af elektroanalysen reaktion ved at måle forskellige pH-værdier (
PH afhængighed af LACY viser to forskellige elektrogen reaktioner. De kapacitivt koblede strøm stiger mellem pH 5 og pH 8,5, men også ændrer sin form. Under alkaliske forhold steady state transport overholdes, mens det for surt pH-værdier kun en hurtig elektroanalysen reaktion tilbage. At skelne steady state signaler fra de hurtige elektrogen reaktioner vi brugte kredsløb analyse at rekonstruere transportør strømme (figur 6).
Ved pH 7 er monofasiske signalet bliver bifasisk. Dette indikerer også, at der er to forskellige elektrogen reaktioner. Estimeret fra den overførte ladning (integral af signalerne), de to reaktioner har omkring 6% og 94% af den samlede electrogenicity af transporten cyklus.
ove_step "> 2.. Tildeling af elektroanalysen reaktionerAt tildele de to elektrogen reaktioner på bestemte trin i reaktionen cyklus af Lacy blev E325A LACY variant måles (figur 7). Denne variant viser kun laktose udveksling men er mangelfuld for alle aktive transportformer, på grund af hæmning af proton frigivelse. Signalet af E325A LACY repræsenterer en hurtig forbigående og er konstant for alle målte pH-værdier. Formen og amplituden af signalet svarer til signalet fra vildtype LACY under sure betingelser. Derudover observerer vi en lille negativ fase efter den faldende spidsstrøm, som er karakteristisk for hurtige forbigående strømme målt i kapacitivt koblede systemer. Fordi laktose binding og frigivelse ikke er elektrogen, skal hurtig transient korrelerer med en elektrogen konformational overgang efter laktose bindende.
Det er kendt, at proton frigivelse trin er sats limiting for lacy omsætning på laktose koncentrationsgradient drevet transportform. I dette tilfælde forventer vi en stigning i transport sats med alkalisk pH, fordi proton release er begunstiget. Dette er tilfældet for steady state transport korreleret signal af vild LACY. Desuden det kunne påvises ved pH-gradient måling at kun den indre pH påvirker steady state transport af LACY (upubliceret). Derfor den store elektroanalysen reaktion kunne tildeles proton frigivelse trin.
3.. Målinger for kinetisk analyse
Efter identificering af elektroanalysen reaktioner på og uden transportpriser blev bestemt ved hjælp af en SSM Setup med en høj tidsopløsning på omkring 4,5 msek. Dette er kun muligt under forhold, hvor den ene reaktion dominerer signalet. I dette tilfælde ratekonstanter kan udledes forbigående strømninger under hensyntagen til den tid, opløsning af signalerne ved hjælp af en iterativ mindste kvadraters de convolution algoritme (figur 8). De fastlagte ratekonstanter samt den foreslåede minimale kinetiske model (figur 9) Endelig blev anvendt til simulering af transportvirksomheden kinetik. De simulerede kurver reproducere SSM data, som desuden beviser den kinetiske model.
Figur 1. Adsorption geometri proteoliposomer på SSM. Den SSM er dannet på en sensor-chip, en struktureret guld belagt glas dias. At måle elektrogen reaktioner membranproteiner, er proteoliposomer eller membranfragmenter adsorberet til SSM. De to membraner danner et kapacitivt koblet system. Dette er grunden kun forbigående strømme detekteres.
tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg "/>
Figur 2. SSM kuvetten bærer sensoren chip og reference elektrode. Sensorchippen er klemt inde mellem kuvetten base og cuvetten hoved. Henvisningen elektrode er isoleret fra strømmen vej ved en polyacrylamidgel saltbro.
Figur 3. Fluid Pathway og elektriske kredsløb i SSM Setup. I den eneste løsning udvekslingsregelsæt kun én ikke-aktiverende (NA) og en aktiverende (A) løsning er påkrævet. Strømningen styres af to 2-vejs ventiler (V1) og en terminal ventil (V2). Terminalen Ventilen skifter mellem ikke-aktiverende og aktiverende løsninger, lede en af løsningerne til kuvetten, og den anden løsning på en affaldsbeholder (W). Sensorchippen (SSM) er forbundet til forstærkeren (I / U), mens henvisningen elektrode (AgCl) er forbundet til den funktion generator (F) i det eksterne elektriske kredsløb. En computer (PC) og en grænseflade box bruges til ventil drift og dataopsamling.
Figur 4.. Forbigående strømme målt med vildtype LACY proteoliposomer efter 100 mM lactose koncentration hopper ved forskellige pH-værdier. Den ikke-aktiverende opløsning indeholdt 100 mM glucose, mens den aktiverende opløsning indeholdt 100 mM lactose. Alle opløsninger blev fremstillet i 100 mM kaliumphosphatpuffer ved den angivne pH-værdi med 1 mM DTT. For nærmere oplysninger om måleforhold i denne og de følgende figurer henvises til 9 og 10.
ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg "/>
Figur 5. Midlede normaliserede spidsstrømme målt med vildtype LACY proteoliposomer efter laktose koncentration hopper ved forskellige koncentrationer og pH-værdier. K-M værdier indhentet fra de hyperbolske passer.
Figur 6.. Rekonstruktion af transportproteiner strømninger. De forbigående strømme (A), der anvendes til at rekonstruere The Transporter strømme (B) blev målt med vildtype LACY proteoliposomer efter 100 mM laktose koncentration hopper ved pH 8,5 (blå trace) og pH 5,2 (rød trace). Ved pH 8,5 kontinuerlig omsætning iagttaget, mens ved pH 5,2 en hurtig elektroanalysen reaktion. Dette er klart observeret i rekonstruerede strøm (B).
files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg "alt =" Figur 7 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg "/>
Figur 7. Spændingsvariationen målt med E325A LACY proteoliposomer efter en 100 mM lactose koncentration hoppe ved pH 5,2. Denne LACY variant hæmmes i proton frigivelse trin af transporten cyklus og derfor transport-mangelfuld. Den lille negative observerede komponent er karakteristisk for hurtige forbigående strømme målt i kapacitivt koblede systemer og er forårsaget af udledning af membranen kapacitans efter en hurtig elektroanalysen reaktion. Dens tidskonstant π0 bestemmes af kapaciteterne og konduktanser af systemet (figur 1).
Figur 8. Forbigående strømme målt med vildtype lacy proteoliposomer after forskellige laktose koncentration hopper ved pH 5.2. Under disse betingelser ikke steady state transport overholdes, men en elektrogen konformationel overgang på laktose binding. Den stiplede linie viser overføringsfunktionen repræsenterer tidsopløsning af systemet. Det indsatte viser bestemmelse af og slukkes hastighedskonstanter fra de observerede hastighedskonstanter kobs med en hyperbolsk fit til data. Den observerede hastighedskonstant blev bestemt ud fra forbigående strømninger med en iterativ mindste kvadraters deconvolution algoritme 10..
Figur 9. En kinetisk model for reaktionen cyklus af LACY. To elektrogen trin kan identificeres og karakteriseres ved SSM målinger. Et stærkt elektroanalysen reaktion repræsenterer ~ 94% af den totale ladning forskydning i reaktionencyklus er kun observeret ved neutrale og basiske pH-værdier. Det kan henføres til proton frigivelse trin (blå pil). Et svagt elektroanalysen trin er observeret ved sur pH når kontinuerlig omsætning af vildtype LACY hæmmes. Vi tildelt denne reaktion til en elektrogen konformationel overgang på lactose binding, som udgør 6% af den totale ladning forskydning i reaktionen cyklus.
Discussion
1.. Fordele ved SSM-baserede elektrofysiologi sammenlignet med konventionelle metoder
SSM-baserede elektrofysiologi har vist sig som et værdifuldt redskab for elektrofysiologiske værktøjskasse. Det er især nyttigt i tilfælde, hvor konventionen elektrofysiologi, nemlig patch clamp og spænding clamp metoder ikke kan anvendes: Bortset fra nogle få undtagelser bakterielle transportører kan ikke undersøgt ved hjælp spænding klemme eller patch clamp metoder på grund af den lille størrelse af bakterier, og fordi de er vanskelige at udtrykke i mammale celler eller oocyter. Men også fysiologisk relevante pattedyr transportører kan undersøges. I dette tilfælde SSM-baserede elektrofysiologi er attraktivt for transportvirksomheder fra intracellulære membraner og til screening applikationer i lægemiddelforskning på grund af dens robusthed og dens potentiale for automatisering.
SSM-basedUsing konventionelle elektrofysiologi, tidsopløst karakterisering af transporters er udfordrende. Da omsætningen af transportvirksomheder er lav et "kæmpe patch« eller en »hel celle 'konfiguration er nødvendig, som har en iboende lav tidsopløsning i en opløsning udveksling eksperiment. Komplikation kan overvindes ved hjælp af fotolytisk substrat frigivelse. Det er dog kun et begrænset antal substrater velegnet til denne fremgangsmåde. Her hurtig løsning udveksling på SSM giver en unik mulighed for at udføre elektrofysiologiske studier med en høj tidsopløsning hjælp vilkårlige substrater.
2.. Begrænsninger og kritiske trin
I modsætning til patch clamp og spændingsklemme teknikker, kan SSM-baserede elektrofysiologi ikke anvendes til at påføre et potentiale. Transporter karakterisering er derfor begrænset til transportformer, der ikke er afhængige af en membran potentiale.
Generelt har SSM-baserede elektrofysiologi ingen begrænsninger vedrørende type (elektrogen) transportvirksomheden. Men spænding clamp eller patch clamp metoder kan have fordele, hvis intracellulære komponenter som bindende proteiner er nødvendige for protein funktionalitet.
Begrænsninger kan opstå, hvis løsning udveksling skaber store artefakt strømme. Dette sker, når substratet vekselvirker kraftigt med SSM ligesom i tilfælde af lipofile forbindelser. Artifact kontroller kan bruges til at korrigere de målte signaler. Desuden højt saltindhold baggrund i alle måle buffere kan anvendes til at reducere artefakter. Men i tilfælde, hvor størrelsen af den artefakt er sammenlignelig med det protein-signalet, er det næsten umuligt at isolere proteinet relaterede signal fra artefakt. Heldigvis høje artefakter er usædvanligt i en optimeret løsning udveksling.
Der er et par skridt, der er afgørende for en succesfuld realisering af en SSM-baserede elektrofysiologi eksperiment. Fremstillingen af proteinet prøven er den vigtigste del. Hvis proteoliposomer er brugt, skal du sørge for reconsprostitution processen giver en ren, reproducerbar prøve af en tilstrækkelig LPR og transportøren er orienteret på den rigtige måde. LPR kan kontrolleres ved fryse fraktur elektronmikroskopi og orientering ved en ELISA-eksperiment hvis antistoffer er tilgængelige.
Brug kun en SSM der viser optimale parametre for inkubere protein prøven. Indsprøjtning af proteinet er endnu et vigtigt skridt. Lydbehandling er afgørende og luftbobler bør undgås under injektionen. Efter Prøveinkubation målingerne selv er kritisk, fordi luftbobler vil fjerne den adsorberede protein prøven fra sensoren chip. Derfor altid fjerne luftbobler efter skift løsninger. Alligevel et signal nedtrapning kan forekomme. For at rette en mulig signal nedslidt, er det vigtigt at udrette nedslidte kontrol under eksperimentet.
3.. Specialiserede systemer
SSM-opsætning, kan ændres i henhold til dens anvendelse. Desuden ther er helt forskellige, højt specialiserede opsætninger til rådighed.
Der er mulighed for at måle protein signaler under asymmetriske forhold, f.eks under en pH-gradient. At etablere asymmetriske puffersammensætninger i og uden for proteoliposomer en tredje løsning, den hvilende løsning, der skal indføres, og dette kræver en dobbelt udveksling konfiguration. Her yderligere trevejsventil skifte mellem ikke-aktiverende og hvilende løsninger er påkrævet.
At øge den tid resolution af systemet udviklede vi et alternativt flow vej mangler terminalen ventil, men ved hjælp af en anden type kuvette. Her krydset af aktiverende og ikke-aktiverende opløsning er placeret inde i kuvetten, 3 mm foran SSM. Denne opsætning er velegnet til kinetisk analyse af hurtige transportprocesser. Det kunne påvises, at en tidsopløsning så lav som 2 msek er mulig.
Kommerciel fully automatiserede systemer er tilgængelige sigte på et væsentligt højere gennemløb for narkotika screening. En bevægelig enhed indsamler løsninger og sprøjter dem på sensorens overflade i plader med 96 brønde i en standard mikrotiterplade format.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker J. Garcia-Celma jeg Smirnova og R. Kaback for bidrag til lacy målinger og E. Bamberg for støtte og nyttige diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
| Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
| 2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
| Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
| Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
| Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| 100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
| O-rings | Seal Science Inc. | ||
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
| Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
| Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
| Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Amplifier | Keithley | 427 | |
| Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
| USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
| Regeants | |||
| 1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
| Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
| n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
| Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
| Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
| α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 | |
References
- Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes. Biophys. J. 64, 384-391 (1993).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
- Garcia-Celma, J. J., et al. Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).
- Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study. J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).
- Zhou, A., et al. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli. J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).
- Ganea, C., Fendler, K. Bacterial transporters: charge translocation and mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).
- Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect. PLoS ONE. 5, e12585 (2010).
- Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. Measuring ion channels on solid supported membranes. Biophys. J. 97, 388-396 (2009).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).
- Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport. Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).
