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Medicine

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

doi: 10.3791/50231 Published: January 6, 2013

Summary

Lasermikrodissektion ist eine Technik, die die Gewinnung von ausgewählten Zellen aus winzigen Mengen von Parenchym ermöglicht. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Erfassen menschlicher Pankreasinseln aus chirurgischen Proben für transkriptomischen Studien verwendet werden. Unser Protokoll verbessert die intrinsische Autofluoreszenz der menschlichen Beta-Zellen und erleichtert so ihre Sammlung.

Abstract

Lasermikrodissektion (LMD) ist eine Technik, die die Rückgewinnung ausgewählter Zellen und Geweben von winzigen Mengen von Parenchym 1,2 ermöglicht. Die präparierten Zellen können für eine Vielzahl von Untersuchungen, wie transkriptomischen oder Proteom-Studien, DNA Beurteilung oder Chromosomenanalyse 2,3 verwendet werden. Eine besonders anspruchsvolle Anwendung von LMD Transkriptomanalyse ist, die aufgrund der Labilität der RNA 4, besonders ausgeprägt, wenn die von Geweben, die reich von RNasen, wie der Bauchspeicheldrüse sind seziert kann. Ein Protokoll, das Mikrodissektion schnelle Identifikation und Erfassung von Zielzellen ermöglicht ist in dieser Einstellung, um das Gewebe Handhabung zu verkürzen und damit zu RNA-Konservierungsmedien zu gewährleisten.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Erfassen menschlichen Pankreas-Beta-Zellen aus chirurgischen Proben für transkriptomischen Studien 5 verwendet werden. Kleine Stücke der Bauchspeicheldrüse von etwa 0,5-1 cm 3 wurden von den gesunden erscheinenden Rande der resezierten Bauchspeicheldrüse Proben, in Tissue-Tek OCT Compound eingebettet, sofort gekühlt 2-Methylbutan zerteilt gefroren und bei -80 ° C bis zum Schneiden. Vierzig Serienschnitten von 10 um Dicke wurden auf einem Kryostaten bei -20 ° C eine Einstellung geschnitten, individuell auf Glasobjektträgern im Kryostat für 1-2 Minuten getrocknet, und bei -80 ° C überführt

Unmittelbar vor der Lasermikrodissektion Verfahrens wurden die Schnitte fixiert in eiskaltem, frisch zubereitete 70% Ethanol für 30 sec. gewaschen, um 5-6 Dips in eiskaltem DEPC-behandeltem Wasser und entwässert durch zwei einminütigen Inkubationen in eiskaltem 100% Ethanol gefolgt von Xylol (welches zum Gewebe Dehydratisierung verwendet) für 4 min; Gewebeschnitte wurden dann luftgetrocknet anschließend für 3-5 min. Wichtig ist, dass alle Schritte, mit Ausnahme der Inkubation in Xylol, wurden mit eiskaltem Reagenzien - eine Änderung über einen zuvor beschriebenen Protokoll 6. Utilization eiskaltem Reagenzien führte zu einem deutlichen Anstieg der intrinsischen Autofluoreszenz der Beta-Zellen, und erleichtert ihre Anerkennung. Für Mikrodissektion wurden vier Abschnitte dehydratisiert jeweils erneut beiden wurden in einer Folie umwickelte 50 ml Röhrchen gegeben, um das Gewebe vor Feuchtigkeit schützen und Bleichen; die verbleibenden zwei wurden sofort mikrodissezierten. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung eines PALM MicroBeam Instrument (Zeiss) unter Verwendung der Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) Modus. Der Abschluss der Beta-Zell-/ Insel Dissektion von vier Kryoschnitten nicht länger als 40-60 min benötigt. Zellen wurden in ein AdhesiveCap gesammelt und lysiert mit 10 ul Lysepuffer. Jede einzelne RNA Probe für Transkriptom-Analyse wurde durch die Kombination von 10-Zellen mikrodissezierten Proben, gefolgt von RNA Extraktion mit dem Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus) erhalten. Dieses Protokoll verbessert die intrinsische Autofluoreszenz der menschlichen Beta-Zellen, um so ihren schnellen und präzisen Erkennung und collection. Weitere Verbesserung dieses Verfahrens konnte ermöglichen die Dissektion der phänotypisch unterschiedlichen Beta-Zellen, mit möglichen Folgen für ein besseres Verständnis der Veränderungen mit Typ 2 Diabetes.

Protocol

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Ein. Freezing of Human Pankreasgewebe

  1. Entfernen Fettgewebe, Blutgefäße, Nerven und nicht Parenchymgewebe mit einem Skalpell und Pinzette, und schneiden Sie das Pankreasgewebe in Stücke (~ 0,5-1 cm große Würfel schneiden).
  2. Legen Sie eine Pankreasgewebe Stück in der Mitte eines Cryomold, und decken Sie es komplett mit kaltem Tissue-Tek OCT Compound. Legen Sie die Cryomold in ein Gefäß, dessen Boden mit vorgekühlten 2-Methylbutan und Snap-freeze in flüssigem Stickstoff bedeckt. Bewahren Sie die gefrorene Probe bei -80 ° C.

2. Herstellung von Gefrierschnitten

  1. Tragen Sie Handschuhe bei allen Schritten zur Denaturierung der RNA zu vermeiden.
  2. Reinigen Sie den Kryostaten Messer, Probenhalter und Pinsel mit kaltem 100% Ethanol und RNase Away. Legen Sie die gefrorenen Gewebe im Inneren des Kryostaten.
  3. Warten Sie, bis das Gewebe, Messer und Pinsel zu erreichen -20 ° C. Beschriften Sie die SuperFrost Plus Objektträger und pre-cool sie innerhalb der Kryostatkammer während der Wartezeitfür das Gewebe zu erreichen -20 ° C.
  4. Übernehmen Sie die Tissue-Tek OCT Compound auf dem Probenhalter und legen Sie die gefrorenen Gewebe an der Spitze.
  5. Sobald das Tissue-Tek OCT Compound eingefroren trimmen cryoblock und entfernen Sie über Tissue-Tek OCT Compound mit einer Rasierklinge.
  6. Schneiden Sie insgesamt 40 aufeinanderfolgende 10 um Scheiben aus dem Pankreasgewebe Block. Zusätzlich empfehlen wir das Schneiden eines ersten und mittleren Scheibe für Übersichtszeichnungen des Pankreas Abschnitt, der die Identifizierung von Inseln innerhalb der Scheiben erleichtern kann während der Mikrodissektion eingespart werden.
  7. Übertragen Sie die Abschnitte aus der Messerklinge in die Mitte eines SuperFrost Plus Objektträger berühren die Rückseite der Folie mit dem Finger (abgedeckt mit einem Handschuh) zum Aufwärmen nur die Region, in die der Abschnitt einzuhalten haben.
  8. Trocknen Sie die Abschnitte 1-2 min innerhalb des Kryostaten bei -20 ° C, nach denen Sie steckte sie in eine Folie Box auf Trockeneis gelegt. Bewahren Sie die Abschnittebei -80 ° C.
  9. Falls notwendig, reinigen Sie das Messer mit Papiertüchern und kalt 100% Ethanol.

3. Dehydratisierung von Gefrierschnitte

  1. Bereiten Sie die Reagenzien: pour 30 ml frisch zubereitet 70% Ethanol, 30 ml DEPC-behandeltem Wasser, 2x30 ml 100% Ethanol und 30 ml Xylol in 50 ml CELLSTAR Röhren (Falcons); Kälte und halten alle Reagenzien (außer Xylol) auf Eis.
  2. Reinigen Sie den Arbeitsbereich unter der Haube mit 100% Ethanol und RNaseZAP.
  3. Prozess zwei Kryoschnitten wie folgt: in eiskaltem 70% Ethanol fix für 30 sec, waschen mit 5-6 schnelle Dips in eiskaltem DEPC-behandeltem Wasser, zweimal austrocknen für 1 min in eiskaltem 100% Ethanol inkubieren 4 min in Xylol bei Raumtemperatur (25 ° C), und an der Luft trocknen für 3-5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einem anderen Paar von Kryoschnitten.
  4. Legen Sie zwei getrocknete Kryoschnitten zurück in eine 50 ml CELLSTAR Rohr mit Aluminiumfolie eingewickelt, um sie vor Licht und Feuchtigkeit zu schützen sichern.
<p class = "jove_title"> 4. Laser Mikrodissektion der Beta-Zellen mit PALM MicroBeam, Zeiss

  1. Reinigen Sie das Mikroskop mit RNaseZAP und montieren Sie die Adhesive Cap im RoboMover.
  2. Legen Sie die folgenden Einstellungen: Filter-Set 09 (Anregung: 450-490 nm, Emission> 515 nm), AutoLPC-Modus, 50% Laserenergie, 65% Laserfokus, 100% Laser-Geschwindigkeit, 5 mm Abstand zwischen AutoLPC Schüsse, 6 um Abstand die Linie, Arbeitshöhe: -10.100.
  3. Legen Sie ein Abgleiten in die Bühne.
  4. Suchen Sie die autofluoreszierenden Beta-Zellen unter dem Mikroskop Visualisierung (5x oder 10x Objektiv).
  5. Wechseln Sie zu dem 40x Objektiv, wählen Sie die Beta-Zellen mit dem "Freehand" Auswahl-Werkzeug und microdissect sie mit dem Laser.
  6. Nehmen Sie das Gewebe von vier dehydrierte Kryoschnitten in einem AdhesiveCap.
    Kommentar 1: Die Zeit, um die Beta-Zellen ein dehydrierte Kryoschnitt sezieren sollte nicht länger als 10-20 min Rehydratation der Gewebeschnitte, die dazu führen würde, zu vermeidenRNA-Abbau.
    Bemerkung 2: überprüfen Sie die erfolgreiche Mikrodissektionsverfahren durch visuelle Inspektion nach dem Umzug von der Bühne zum Checkpoint.

5. Lyse von mikrodissezierten Beta-Zellen Enriched Tissue

  1. Entfernen Sie die AdhesiveCap aus dem RoboMover.
  2. Pipet 10 ul Extraktionspuffer (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) in den Deckel des AdhesiveCap und inkubieren sie auf den Kopf bei 42 ° C für 30 min.
  3. Spin-Down bei 10.000 xg und legte das Lysat auf Trockeneis. Speichern sie bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion durchgeführt wird.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 3.) Bis 5.) Mit allen anderen Abschnitten.

6. RNA-Extraktion

  1. Kombinieren Sie alle zehn 10 ul Lysaten
  2. Verfahren mit der RNA-Isolierung durch Arbeiten bei Raumtemperatur gemäß dem Protokoll des PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus, unter Verwendung eines 1:1-Verhältnis Extraktionspuffer (XB) zu 70% Ethanol (einschließlich DNase Behandlung).

7. RNA-Analyse

  1. Verwenden Sie 1 ul RNA für die Analyse von Qualität und Quantität mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer (picoChip). Quantitative Auswertung ist in Bezug auf eine Standard-RNA parallel auf dem Chip geladen getan.

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Representative Results

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Wie in 1 gezeigt, führte die modifizierte Dehydratisieren Protokoll zu einer Verbesserung der Betazellen Autofluoreszenz im Vergleich zum vorherigen veröffentlichten Protokoll 6. Aufbringen der beschriebenen Protokolls wurde jedes der 39 Proben verwendet chirurgischen Pankreas bis 40 serielle Kryoschnitten für einen Durchschnitt von 3 31'544'704 um Gewebe / Probe Pankreas (Bereich: 8'742'390 - 81'522'153 um 3) zu erzeugen wie in Tabelle 1 gezeigt. Dies stellt das Volumen von etwa 18 Pankreasinseln von 150 Mikrometer Durchmesser, oder von 35.000 β-Zellen. Das Gewebe von durchschnittlich 38 verschiedenen Inseln / Pankreas Probe (Bereich: 19-80 Inselchen) entstand, wurde die typischerweise jeweils in zwei oder mehreren aufeinanderfolgenden Abschnitten beobachtet. Die große Variabilität der Ausbeute von Inseln zwischen verschiedenen Proben spiegelt die Heterogenität des Gewebes Quelle, entweder Pankreas Kopf oder Schwanz, sowie die fortschreitende Verbesserung der Betreiber in der Erkennungion der Inseln innerhalb der 10 min Zeit, sich mit der Inspektion von jedem Abschnitt.

Gesamt-RNA aus jeder mikrodissezierten und lysiert Gewebe wurde mit dem Arcturus PicoPure Gefrorene RNA Isolation Kit of Applied Biosystems gereinigt und in 11 ul eluiert, gemäß dem Protokoll des Herstellers. Anschließend 1 ul RNA jeder Probe wurde von der Agilent 2100 Bioanalyzer analysiert. Wir erhalten im Durchschnitt 42 ng RNA / Probe (Bereich: 5 bis 229 ng / Probe) mit einer mittleren RNA Integrity Number (RIN) von 5,8 (Bereich: 3,4 - 7,2). Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für die RNA-Analyse. Unabhängig davon, welche der RIN-Wert alle untersuchten RNA-Proben wurden erfolgreich für transkriptomischen Studien verwendet. Wir haben nicht eine direkte Beziehung zwischen der Menge des mikrodissezierten Gewebe und der RNA-Ausbeute. Unterschiede in dem Zeitintervall zwischen der Ernte durch den Chirurgen und das Einfrieren der Pankreas-Proben nach der Prüfung und Freigabe durch den Pathologen könnte p ausmachen Technik für die variable Qualität und Quantität der wiedergewonnen RNA. Andere wichtige Faktoren zu berücksichtigen sind die Laserenergie für die Mikrodissektion aufgebracht, wobei das untere Energieniveau Nachgeben der höheren RNA-Integrität, sowie dem Laserfokus und der Abstand der LPC Punkten. Der Fokus ist optimal eingestellt, wenn eine leichte "impact" des Lasers auf der Glasoberfläche des Schiebers bildet einen kleinen schwarzen Punkt, gesehen werden kann. In unseren Händen die besten Ergebnisse werden mit einer Laserenergie von 50%, einem Laserfokus von 65%, wenn auch angepasst, um Unterschiede in der Dicke der Abschnitte zu kompensieren, und ein Abstand von LPC-Punkten von 5 um erzielt. Zusätzlich kann die RNA-Menge, indem die Arbeitshöhe der RoboMover optimiert werden, dh der Abstand zwischen dem Klebstoff Kappe und dem Abschnitt, so niedrig wie möglich, Verlust von mikrodissezierten Gewebe während der Erfassung zu vermeiden. In unserem Set up der Arbeitshöhe ist -10.100 willkürliche PALM Einheiten.

ll "> specimen <td> 30
Anzahl der Inseln / Probe gesammelte Gewebe Volumen / Probe [um 3] RIN Konzentration [ng / ul] Gesamt-RNA [ng]
DP002 34 24'947'696 5,2 1,149 10,34
DP003 30 41'141'488 5,5 1,677 15,09
DP005 23 27'024'264 3,5 8,259 66,07
DP006 25 45'900'848 3,4 7,399 59,19
DP007 23'936'048 6,5 0,595 4,76
DP008 22 68'248'432 6,2 1,559 14,03
DP010 34 33'156'752 5,6 1,750 19,25
DP011 29 31'339'152 6,0 1,365 15,02
DP012 34 57'594'360 6,3 3,025 33,28
DP017 35 28'212'256 6,0 1,292 14,21
DP030 35 48'007'530 5,6 2,180 23,98
DP013 36 34'371'045 6,9 1,350 14,85
DP014 35 21'360'060 7,2 1,270 13,97
DP015 33 20'923'488 4,1 4,000 44,00
DP019 40 35'431'704 7,0 1,670 18,37
DP025 19 15'329'844 6,6 0,496 5,46
DP034 19 81'522'153 6,4 4,260 46,86
DP039 32 19'074'410 6,5 1,270 13,97
DP040 44 31'565'630 5,4 2,300 25,30
DP042 52 40'333'840 7,0 2,510 27,61
DP021 65 33'996'260 6,3 2,830 31,13
DP023 19 19'513'310 5,6 8,250 90,75
DP024 32 24'125'140 6,3 20,780 228,58
DP038 23 18'306'040 6,6 11,700 128,70
DP045 35 36'345'620 6,3 1,100 12,10
DP033 42 26'078'550 6,5 15,380 169,18
DP022 49 33'535'460 6,8 7,590 83,49
DP041 56 34'899'830 5,7 3,350 36,85
DP049 38 18'521'230 6,8 1,020 11,22
DP028 32 16'410'670 5,6 1,720 18,92
DP056 36 19'737'580 5,7 1,130 12,43
DP059 52 23'376'180 3,6 7,880 86,68
DP047 41 20'658'370 6,4 1,040 11,44
DP036 23 8'742'390 3,5 0,950 10,45
DP027 42 29'150'480 5,1 3,410 37,51
DP046 54 16'800'070 5,3 8,210 90,31
DP055 57 32'340'270 6,2 1,280 14,08
DP064 74 41'896'460 6,5 2,440 26,84
DP067 80 46'388'540 6,3 5,200 57,20
Durchschnitt 38 31'544'704 5,8 3,965 42,14
Anzahl der Inseln / Probe gesammelte Gewebe Volumen / Probe [um 3] RIN Gesamt-RNA [ng]
Reichweite 19 bis 80 8'742'390 - 81'522'153 3,4 bis 7,2 4,76 bis 228,58
Durchschnitt 38 31'544'704 5,8 42,14

Tabelle 1. Übersicht über die Höhe der mikrodissezierten Gewebe und die Qualität und Quantität der extrahierten RNA. Die Proben werden chronologisch aufgelistet. Die gesammelten Gewebevolumen wird wie folgt berechnet: Dicke Kryoschnitt (10 um) x mikrodissezierten Fläche [um 2]. 1 ul RNA jeder Probe wurde auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer picoChip analysiert.

"Abbildung Abbildung 1. Intrinsische Autofluoreszenz menschlicher Betazellen Autofluoreszenz der Betazellen nach der Dehydratisierung von Pankreas Kryoschnitten mit Reagenzien, die entweder bei Raumtemperatur (A), oder eiskaltem (B) (Anregung 450 gehalten wurden - 490 nm, Emission> 515 nm;. X 400 Vergrößerung). Beta-Zellen gelb erscheinen, während Bauchspeicheldrüsengänge, Gefäße und Kollagen eine grüne Farbe an. Maßstab: 75 um.

Abbildung 2
Abbildung 2. Qualität und Quantität der extrahierten Insel RNA. Profil eines menschlichen Inselzellen RNA-Probe mit diesem LMD-Protokoll (B) im Vergleich zu einer Standard-RNA-Probe (A) erhalten. 1 ul RNA jeder Probe wurde auf einer picoChip aufgebracht und analysiert quantity und Qualität mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer. (A): RIN (RNA-Integrität Anzahl) 7,7 [rRNA-Ratio (28S/18S): 1,3)], (B): 7,2 RIN [rRNA-Ratio (28S/18S): 1,1)]. Die Konzentration der Insel RNA betrug 1,3 ng / ul, für einen Gesamtbetrag von 10,3 ng von 21'360'060 um 3 Pankreasgewebe. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Discussion

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Wir beschreiben einen zuverlässigen Ansatz für die Laser-Mikrodissektion (LMD) der menschlichen Inselzellen von chirurgischen Pankreas Probe. Sofern ein LMD Mikroskop zur Verfügung steht, könnte dieses Verfahren an irgendeiner Forschungseinrichtung Ausführung partieller Pankreatektomien umgesetzt werden, wodurch sich Zugang zu menschlichen Inseln Material aus beiden Nicht-Diabetiker und Typ 2 Diabetikern. Dies ist besonders relevant in Anbetracht der Mangel an Bauchspeicheldrüsen für Inselisolierung angeboten. Vorteilhafte Aspekte der LMD zu Inselisolierung durch Kollagenaseverdau Vergleich sind die verringerte Zeit zwischen Explantation des Gewebes und Verarbeitung der Inseln für die RNA-Extraktion 7 die Anreicherung von Betazellen 7 sowie die Vermeidung von harten mechanischen und enzymatischen Manipulationen 8, 9,10, die das Genexpressionsprofil verändern könnten. Im Falle von teilweise pancreatectomized Patienten mehr klinische und metabolische Information ist typischerweise als bei der Organ verfügbarenSpendern. Auf der anderen Seite, Isolierung von Inselzellen von LMD Ausbeuten weniger RNA mit niedrigeren Werten RIN wie nach Kollagenaseverdau beobachtet verglichen und bietet keine lebenden Inseln für funktionelle Untersuchungen. Darüber hinaus kann die Pankreaserkrankung was zu beeinflussen die Chirurgie islet Expressionsprofil. Eine ausgewogene Beurteilung dieser Vor-und Nachteile werden durch vergleichende Untersuchungen an einer großen Zahl von Insel Isolierungen durchgeführt durch Kollagenaseverdau und LMD entweder von Organspendern oder teilweise pancreatectomized Patienten, wie sie laufen in der multizentrischen Innovative Medicine Initiative für erreichbare Diabetes (IMIDIA) mit dem Ziel der "Verbesserung der Beta-Zell-Funktion und Identifizierung von diagnostischen Biomarkern für die Behandlung Überwachung in Diabetes" ( http://www.imidia.org ).

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir wollen alle unsere Kollegen, die Hilfe, Rat und kritischen Input auf verschiedenen Stufen des Projektes bedanken. Die Produktion dieses Video Artikel wurde aus Mitteln IMIDIA (unterstützt http://www.imidia.org ), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) mit dem Deutschen Zentrum für Diabetesforschung (DZD, http://www.dzd -ev.de ) und das Universitätsklinikum Carl Gustav Carus an der Technischen Universität Dresden. Die Arbeiten, die zu dieser Veröffentlichung wird unterstützt von der Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking erhalten unter Finanzhilfevereinbarung n ° 155005 (IMIDIA), Ressourcen, von denen die finanzielle Beteiligung Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (FP7/2007-2013) und EFPIA bestehen Unternehmen in Form von Sachleistungen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (isopentane) ROTH 3927.1
AdhesiveCap (opaque, 500 μl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 210 261 with support skirt
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 227.261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Dry ice
Ethanol absolute VWR 20821.310
Liquid nitrogen
Paint brush
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top internal 22x22 mm, depth 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Plastic clamp
Razor
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel / surgical blade Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus adhesion microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura 4583 or 0807000022
Tweezers BRAUN BD168R
Xylene VWR 28975.291

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References

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Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).More

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