Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Forbedret protokol for Laser mikrodissektion Of Menneskelige pancreasøer fra kirurgiske Prøver

doi: 10.3791/50231 Published: January 6, 2013

Summary

Laser mikrodissektion er en teknik, som muliggør genvinding af udvalgte celler fra små mængder af parenchym. Her beskriver vi en protokol for at erhverve de menneskelige pancreasøer fra kirurgiske enheder, der skal bruges til transkriptomisk undersøgelser. Vores protokol forbedrer den iboende autofluorescens af humane betaceller, hvilket letter deres samling.

Abstract

Laser mikrodissektion (LMD) er en teknik, der tillader inddrivelse af udvalgte celler og væv fra små mængder af parenkym 1,2. De dissekerede celler kan anvendes til forskellige undersøgelser, såsom transkriptom eller proteom undersøgelser, DNA vurdering eller kromosomanalyse 2,3. En særligt udfordrende anvendelse af LMD er transkriptomet analyse, som på grund af labiliteten af RNA 4, kan være særlig fremtrædende, når cellerne dissekeres fra væv, der er rige af RNaser, såsom pancreas. En mikrodissektion protokol, der muliggør hurtig identifikation og indsamling af målceller er afgørende i denne indstilling for at afkorte vævet håndtering tid og dermed for at sikre RNA konservering.

Her beskriver vi en protokol for at erhverve betaceller fra menneskets bugspytkirtel fra kirurgiske enheder, der skal bruges til transkriptomisk undersøgelser 5. Små stykker af pancreas fra ca 0,5 til 1 cm 3 blev udskåret fra de sunde anført tilknytning operativt fjernede pancreas prøver, indlejret i Tissue-Tek OCT-forbindelse, øjeblikkeligt nedfrosset i kølede 2-methylbutan og opbevaret ved -80 ° C indtil skæring. Fyrre serielle sektioner af 10 um tykkelse blev skåret på en kryostat i henhold til en -20 ° C indstilling, overført individuelt til glasplader, tørret inde i kryostaten i 1-2 min, og opbevaret ved -80 ° C.

Umiddelbart før laser mikrodissektion procedure blev snit fikseret i iskold, frisk fremstillet 70% ethanol i 30 sekunder, vaskes med 5-6 dyk i iskold DEPC-behandlet vand og dehydratiseret med to en-minutters inkubationer i iskoldt 100% ethanol efterfulgt af xylen (som anvendes til væv dehydrering) i 4 min; Vævssnit blev derefter lufttørret bagefter i 3-5 min. Vigtigere, alle trin med undtagelse af inkubering i xylen, udføres brugte iskolde reagenser - en modifikation i løbet af en tidligere beskrevet protokol 6. Utilization iskold reagenser resulterede i en markant stigning af den indre autofluorescens af betaceller, og lettet deres anerkendelse. Til mikrodissektion, var fire sektioner dehydrerede hver gang: to blev anbragt i en folieomviklede 50 ml glas for at beskytte vævet mod fugt og blegning, de resterende to straks blev microdissected. Denne procedure blev udført ved anvendelse af en PALM MicroBeam instrument (Zeiss) under anvendelse af Auto Laser Pressure catapulting (AutoLPC) tilstand. Færdiggørelsen af ​​beta celle / ø dissektion fra fire kryosektioner kræves ikke længere end 40-60 min. Celler blev opsamlet i en AdhesiveCap og lyseret med 10 pi lysisbuffer. Hver enkelt RNA-prøve for transkriptom analyse blev opnået ved at kombinere 10 celle microdissected prøver, efterfulgt af RNA-ekstraktion ved hjælp af Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Denne protokol forbedrer den iboende autofluorescens af humane betaceller, hvilket letter deres hurtige og præcise anerkendelse og collection. Yderligere forbedring af denne procedure kunne gøre det muligt dissektion af fænotypisk forskellige betaceller, med mulige konsekvenser for bedre at forstå de ændringer, der er forbundet med type 2 diabetes.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Frysning af humant pancreasvæv

  1. Fjern fedtvæv, blodkar, nerver og ikke-parenchymale væv med en skalpel og pincetter, og skær pankreasvæv i stykker (~ 0,5 til 1 cm terninger).
  2. Placer den ene pancreasvæv brik i midten af ​​en kryoformen, og dække det helt med koldt Tissue-Tek OCT-forbindelse. Sæt kryoformen i en krukke, hvis bund er dækket med forafkølet 2-methylbutan og snap-freeze i flydende nitrogen. Opbevares frosne prøve ved -80 ° C.

2. Fremstilling af frosne snit

  1. Brug handsker overalt i foranstaltninger for at undgå denaturering af RNA.
  2. Rengør kryostat kniv, prøveholder og pensel med kold 100% ethanol og RNase Away. Placer frosne væv inde i kryostaten.
  3. Vent, indtil vævet, kniv og pensel nå -20 ° C. Mærk SuperFrost Plus dias og præ-cool dem inde i kryostatkammeret, mens du ventertil vævet til at nå -20 ° C.
  4. Påfør Tissue-Tek OCT-forbindelse på prøveholderen og læg det frosne væv på toppen.
  5. Når Tissue-Tek OCT-forbindelse er frosset trimme cryoblock og fjerne ethvert overskud af Tissue-Tek OCT-forbindelse med et barberblad.
  6. Skær i alt 40 på hinanden følgende 10 um skiver fra pancreasvæv blokken. Derudover anbefaler vi at skære et første og midterste skive, der skal gemmes til oversigt tegninger af bugspytkirtlen sektionen, der kan lette identifikationen af ​​øer i skiverne under mikrodissektion processen.
  7. Overfør afsnittene fra knivsbladet til midten af ​​en SuperFrost Plus dias ved at trykke på bagsiden af ​​objektglasset med fingeren (dækket med en handske) til at varme op kun den region, som sektionen skal overholde.
  8. Tør sektioner 1-2 min inde i kryostaten ved -20 ° C, hvorefter du lægger dem i et dias kasse placeret på tøris. Gemme sektionerneved -80 ° C.
  9. Rengør om nødvendigt knivsbladet med papirservietter og kold 100% ethanol.

3. Dehydratisering af frosne snit

  1. Forberede Reagenser: Hæld 30 ml frisk fremstillet 70% ethanol, 30 ml DEPC-behandlet vand, 2x30 ml 100% ethanol og 30 ml xylen i 50 ml Cellstar rør (Falcon), chill og holde alle reagenser (undtagen xylen) på is.
  2. Rengør arbejdsområdet under kølerhjelmen med 100% ethanol og RNaseZAP.
  3. Behandle to kryosektioner som følger: fastsætte i iskold 70% ethanol i 30 sek, vaskes med 5-6 hurtige dyk i iskoldt DEPC-behandlet vand, tørrer to gange i 1 min i iskold 100% ethanol, inkuberes i 4 min i xylen ved stuetemperatur (25 ° C), og lufttørres i 3-5 min. Gentag dette trin med et andet par kryosektioner.
  4. Sæt to tørrede kryosektioner ryg mod ryg i en 50 ml Cellstar rør omviklet med aluminiumfolie for at beskytte dem mod lys og fugt.
<p class = "jove_title"> 4. Laser mikrodissektion af beta-celler med PALM MicroBeam, Zeiss

  1. Rengør mikroskop med RNaseZAP og montere den selvklæbende Cap i RoboMover.
  2. Indstil følgende indstillinger: Filter sæt 09 (excitation: 450-490 nm, emission> 515 nm), AutoLPC mode, 50% laser energi, 65% laser fokus, 100% laser hastighed, 5 um afstand mellem AutoLPC skud, 6 um afstand -10.100: til linje, højde arbejder.
  3. Sæt ét dias ind i scenen.
  4. Find de autofluorescerende betaceller ved mikroskopisk visualisering (5x eller 10x objektiv).
  5. Skift til 40x linse, vælge de betaceller med "Freehand" markeringsværktøjet og microdissect dem ved hjælp af laser.
  6. Fang væv af fire dehydrerede kryosektioner i én AdhesiveCap.
    Kommentar 1: tid til at dissekere betacellerne i en dehydreret kryosektion bør ikke være længere end 10-20 min for at undgå rehydrering af vævssnit, som ville resultere iRNA-nedbrydning.
    Kommentar 2: kontrollere vellykket mikrodissektion proces ved visuel inspektion efter at have flyttet scenen til checkpointet.

5. Lyse af Microdissected Beta Cell beriget Tissue

  1. Fjern AdhesiveCap fra RoboMover.
  2. Pipette 10 pi ekstraktionsbuffer (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) i låget af AdhesiveCap og inkuber det på hovedet ved 42 ° C i 30 minutter.
  3. Spin ned ved 10.000 x g og sætte lysatet på tøris. Opbevares ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion foretages.
  4. Gentag trin 3.) Til 5). Med alle andre sektioner.

6. RNA-ekstraktion

  1. Kombiner alle ti 10 gl lysater
  2. Fortsæt med RNA isolation ved at arbejde ved stuetemperatur ifølge protokollen af ​​PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus, ved hjælp af et 1:1 forhold Extraction Buffer (XB) til 70% Ethanol (inklusive DNase Treatment).

7. RNA analyse

  1. Brug 1 gl RNA til analyse af kvalitet og mængde ved hjælp af en Agilent 2100 Bioanalyser (PicoChip). Kvantitative evaluering sker i forhold til en standard RNA loaded parallelt på chippen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som vist i figur 1, den modificerede dehydratiserende protokol førte til en forbedring af beta-celler autofluorescens forhold til den tidligere offentliggjort protokol 6. Anvendelse den beskrevne protokol, blev hver af 39 kirurgiske pancreas prøver anvendes til at generere 40 serielle kryosektioner til et gennemsnit på 31'544'704 um 3 væv / pancreas prøve (interval: 8'742'390 - 81'522'153 um 3) som vist i tabel 1. Dette svarer til det volumen omkring 18 pancreasøer på 150 um diameter, eller af 35000 β-celler. Vævet stammede fra et gennemsnit på 38 forskellige øer / pancreas prøver (område: 19-80 øer), blev hver især typisk observeres i to eller flere på hinanden følgende sektioner. Den store variation i udbyttet af holme blandt forskellige prøver afspejler heterogenitet af vævet kilde, enten pancreas hoved eller hale, samt den gradvise forbedring af de erhvervsdrivende i opdageion af øerne inden for 10 min tid, der medgår til inspektion af hver sektion.

Totalt RNA fra hver microdissected og lyseret væv blev oprenset med Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit fra Applied Biosystems og elueret i 11 ul, ifølge protokollen fra producenten. Efterfølgende 1 pi RNA fra hver prøve blev analyseret ved Agilent 2100 Bioanalyser. Vi opnåede gennemsnit 42 ng RNA / prøve (område: 5 til 229 ng / prøve) med en gennemsnitlig RNA-integritet nummer (RIN) på 5,8 (område: 3,4 til 7,2). Figur 2 viser et eksempel på RNA-analyse. Uanset hvilken RIN værdien alle analyserede RNA-prøver blev med held anvendt til transkriptom undersøgelser. Vi kunne ikke finde en direkte sammenhæng mellem mængden af ​​microdissected væv og RNA udbytte. Forskelle i tidsintervallet mellem høst af kirurger og indefrysning af pancreas prøver efter sin undersøgelse og frigivelse af patologen kunne forklare i p kunst for varierende kvalitet og kvantitet af nyttiggjorte RNA. Andre vigtige faktorer at overveje, er laserenergien ansøgte mikrodissektion med lavere energi opnåelse af højere RNA-integritet, samt laser fokus og afstanden for LPC punkter. Fokus er ideelt indstilles, når en lille "effekt" af laser på glasoverfladen af ​​objektglasset, danner en lille sort prik, kan ses. I vore hænder de bedste resultater opnås med en laserenergi på 50%, en laser fokuseres på 65%, omend tilpasset til at kompensere for forskelle i tykkelsen af ​​sektionerne, og en afstand på LPC punkter 5 um. Derudover kan RNA-mængde optimeres ved at holde arbejdshøjden af RoboMover, dvs afstanden mellem det klæbende hætte og sektionen, så lavt som muligt at undgå tab af microdissected væv under indfangningsprocessen. I vores opsætning arbejdshøjden er på -10.100 arbitrære PALM enheder.

ll "> prøve <td> 30
antal øer / prøver opsamlet vævsvolumen / prøve [um 3] RIN koncentration [ng / ul] total RNA [ng]
DP002 34 24'947'696 5,2 1,149 10,34
DP003 30 41'141'488 5,5 1,677 15,09
DP005 23 27'024'264 3,5 8,259 66,07
DP006 25 45'900'848 3,4 7,399 59,19
DP007 23'936'048 6,5 0,595 4,76
DP008 22 68'248'432 6,2 1,559 14,03
DP010 34 33'156'752 5,6 1,750 19,25
DP011 29 31'339'152 6,0 1,365 15,02
DP012 34 57'594'360 6,3 3,025 33,28
DP017 35 28'212'256 6,0 1,292 14,21
DP030 35 48'007'530 5,6 2,180 23,98
DP013 36 34'371'045 6,9 1,350 14,85
DP014 35 21'360'060 7,2 1,270 13,97
DP015 33 20'923'488 4,1 4,000 44,00
DP019 40 35'431'704 7,0 1,670 18,37
DP025 19 15'329'844 6,6 0,496 5,46
DP034 19 81'522'153 6,4 4,260 46,86
DP039 32 19'074'410 6,5 1,270 13,97
DP040 44 31'565'630 5,4 2,300 25,30
DP042 52 40'333'840 7,0 2,510 27,61
DP021 65 33'996'260 6,3 2,830 31,13
DP023 19 19'513'310 5,6 8,250 90,75
DP024 32 24'125'140 6,3 20,780 228,58
DP038 23 18'306'040 6,6 11,700 128,70
DP045 35 36'345'620 6,3 1,100 12,10
DP033 42 26'078'550 6,5 15,380 169,18
DP022 49 33'535'460 6,8 7,590 83,49
DP041 56 34'899'830 5,7 3,350 36,85
DP049 38 18'521'230 6,8 1,020 11,22
DP028 32 16'410'670 5,6 1,720 18,92
DP056 36 19'737'580 5,7 1,130 12,43
DP059 52 23'376'180 3,6 7,880 86,68
DP047 41 20'658'370 6,4 1,040 11,44
DP036 23 8'742'390 3,5 0,950 10,45
DP027 42 29'150'480 5,1 3,410 37,51
DP046 54 16'800'070 5,3 8,210 90,31
DP055 57 32'340'270 6,2 1,280 14,08
DP064 74 41'896'460 6,5 2,440 26,84
DP067 80 46'388'540 6,3 5,200 57,20
gennemsnit 38 31'544'704 5,8 3,965 42,14
antal øer / prøver opsamlet vævsvolumen / prøve [um 3] RIN total RNA [ng]
rækkevidde 19-80 8'742'390 - 81'522'153 3,4-7,2 4,76 til 228,58
gennemsnit 38 31'544'704 5,8 42,14

Tabel 1. Oversigt over mængden af microdissected væv og kvaliteten og mængden af de ekstraherede RNA. De prøver vises i kronologisk rækkefølge. Den indsamlede væv volumen beregnes som følger: tykkelse kryosektion (10 um) x microdissected område [um 2]. 1 pi RNA fra hver prøve blev analyseret på Agilent 2100 Bioanalyser PicoChip.

"Figur Figur 1. Intrinsic autofluorescens af humane betaceller autofluorescens af betaceller efter dehydrering af pancreas kryosektioner med reagenser, som enten blev opbevaret ved stuetemperatur (A), eller iskold (B) (excitation 450 til 490 nm, emission> 515 nm. 400 x forstørrelse). Beta-celler forekommer gul, hvorimod pancreas kanaler, fartøjer og kollagen viser en grøn farve. Målestok: 75 pm.

Figur 2
Figur 2. Kvaliteten og mængden af ekstraheret ø-RNA. Profil af et humant ø-RNA-prøve opnået med denne LMD-protokol (B) sammenlignet med en standard-RNA-prøve (A). 1 pi RNA fra hver prøve blev påført på en PicoChip og analyseret for quantity og kvalitet med Agilent 2100 Bioanalyser. (A): RIN (RNA-integritet nummer) 7.7 [rRNA Ratio (28S/18S): 1.3)], (B): RIN 7,2 [rRNA Ratio (28S/18S): 1.1)]. Koncentrationen af holmen RNA var 1,3 ng / ul, til et samlet beløb på 10,3 ng fra 21'360'060 um 3 pancreasvæv. Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi beskriver en pålidelig metode til laser mikrodissektion (LMD) af humane øer fra kirurgisk pancreas prøve. Forudsat at en LMD mikroskop er tilgængelig, kan denne procedure gennemføres på ethvert forskningsinstitution udfører delvise pancreatectomies og derved øge adgangen til menneskelig ø materiale fra både ikke-diabetiske og type 2-diabetikere. Dette er især relevant i betragtning af knapheden på pancreas udbydes til ø-isolation. Gunstige aspekter af LMD sammenlignet med ø-isolering ved collagenasefordøjelse er den reducerede tid mellem eksplantation af vævet og behandling af øerne til RNA-ekstraktion 7 berigelse af betaceller 7, såvel som undgåelse af hårde mekaniske og enzymatisk manipulation 8, 9,10, hvilket kan ændre genekspression profil. I tilfælde af delvist pancreatectomized patienter mere klinisk og metabolisk information er typisk tilgængelige end i tilfælde af organ-donorer. På den anden side, sammenlignet isolering af øer fra LMD udbytte minus RNA med lavere RIN-værdier, som blev observeret efter collagenasefordøjelse og giver ikke levende øer til funktionelle undersøgelser. Endvidere kan pancreatisk sygdom, der fører til kirurgi påvirke ø ekspressionsprofil. En afbalanceret evaluering af disse fordele og ulemper vil kunne opnås gennem sammenlignende undersøgelser af et stort antal af ø isolationer udført af collagenasefordøjelse og LMD enten fra organdonorer eller delvis pancreatectomized patienter, såsom dem i gang i multicenter Innovative Medicine Initiative for Diabetes (IMIDIA) med det mål at "Forbedring af beta-celle funktion og identifikation af diagnostiske biomarkører for behandling overvågning i Diabetes" ( http://www.imidia.org ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke alle vores kolleger, der har givet hjælp, råd og kritiske input på forskellige trin i dette projekt. Produktion af denne video artikel blev støttet med midler fra IMIDIA ( http://www.imidia.org ), det tyske ministerium for Uddannelse og Forskning (BMBF) til det tyske Centre for Diabetes Research (DZD, http://www.dzd -ev.de ) og University Hospital Carl Gustav Carus på University of Technology Dresden. Arbejdet har resulteret i denne publikation har modtaget støtte fra initiativet om innovative lægemidler fællesforetagende under tilskudsaftale nr. 155.005 (IMIDIA), ressourcer, som er sammensat af tilskud fra Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA virksomheders naturalier bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (isopentane) ROTH 3927.1
AdhesiveCap (opaque, 500 μl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 210 261 with support skirt
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 227.261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Dry ice
Ethanol absolute VWR 20821.310
Liquid nitrogen
Paint brush
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top internal 22x22 mm, depth 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Plastic clamp
Razor
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel / surgical blade Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus adhesion microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura 4583 or 0807000022
Tweezers BRAUN BD168R
Xylene VWR 28975.291

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26, (2), 328-3235 (1999).
  3. Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
  4. Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33, (1), 176-179 (2002).
  5. Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
  6. Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  7. Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
  8. Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53, (10), 2559-2568 (2004).
  9. Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53, (11), 2815-2823 (2004).
  10. Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7, (1), e30415 (2012).
Forbedret protokol for Laser mikrodissektion Of Menneskelige pancreasøer fra kirurgiske Prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).More

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter