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Medicine

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

doi: 10.3791/50231 Published: January 6, 2013

Summary

레이저 microdissection은 실질의 미세한에서 선택한 셀의 복구를 할 수있는 기술입니다. 여기 transcriptomic 연구에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 섬을 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 따라서 자신의 컬렉션을 촉진 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상시킵니다.

Abstract

레이저 microdissection (LMD)는 실질 1,2의 미세한에서 선택한 셀과 조직의 복구를 할 수있는 기술입니다. 해부 세포는 이러한 transcriptomic 또는 proteomic 연구, DNA 평가 나 염색체 분석 2,3 등 조사의 다양한 사용할 수 있습니다. LMD의 특히 어려운 응용 프로그램은 RNA (4)의 lability로 인해 셀이 같은 췌장 등의 RNases의 풍부 조직 분석하던 때 특히 눈에 띄는 될 수 transcriptome 분석이다. 대상 세포의 빠른 식별 및 수집을 가능하게 microdissection 프로토콜은 조직 처리 시간을 단축 할 수 있으며, 결과적으로, RNA의 보존을 보장하기 위해이 설정에 필수적입니다.

여기 transcriptomic 연구 5에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 베타 세포를 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 0.5-1에 대한 C의 췌장의 작은 조각m 3 sectioning 때까지 즉시 2 Methylbutane 차가운에 냉동 조직 - 테크 10월 컴파운드에 포함 resected의 췌장의 표본의 건강 나타나는 여백,에서 절단하고, -80에 저장 ° C 있었다. 10 μm 두께의 40 시리얼 섹션은 1-2 분의 그라 이오 스탯 내부 건조하고, -80에 저장 유리 슬라이드, ° C.에 개별적으로 전송, -20 ° C 설정에 따라 그라 이오 스탯을 삭감했다

즉시 레이저 microdissection 절차 전에 섹션은 얼음 차가운 백퍼센트에서 두 1 분 incubations하여 얼음처럼 차가워에서 수정 갓 30 초에 70 %의 에탄올을 준비, 얼음 차가운 DEPC - 처리 물에 5-6 딥으로 세척하고, 건조 된 에탄올은 4 분 동안 크실렌 (조직 탈수에 사용되는)에 의해 다음, 조직 섹션 3-5 분 동안 나중에 한 후 공기 건조했다. 중요한 것은, 모든 단계는 크실렌의 부화를 제외하고 얼음처럼 차가운 시약을 사용하여 수행되었습니다 - 이전에 설명 된 프로토콜을 6 이상 수정. UT얼음 차가운 시약의 ilization는 베타 세포의 고유 autofluorescence의 발음 증가로 이어진, 그들의 인정을 촉진. microdissection를 들어, 4 개의 섹션은 각 시간 건조했다 : 두 수분과 표백에서 조직을 보호하기 위해 호일로 싼 50 ML 튜브에 배치 된, 나머지 두 사람은 즉시 microdissected되었습니다. 이 절차는 (AutoLPC) 모드를 Catapulting 자동 레이저 압력을 채용 PALM MicroBeam 악기 (Zeiss)를 사용하여 수행되었습니다. 40-60 분보다 더 이상 필요 넷 cryosections에서 베타 세포 / 작은 섬의 해부의 완성. 셀은 한 AdhesiveCap으로 수집, 10 μl 용해 버퍼로 lysed되었습니다. transcriptomic 분석을 위해 각 단일 RNA 시료는 10 셀 microdissected 샘플, 피코 순수 RNA 절연 키트 (악튜러스)를 사용하여 RNA 추출 다음을 조합하여 얻은 것입니다. 이 프로토콜은 따라서 자신의 신속하고 정확한 인식과 C을 촉진, 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상ollection. 이 절차의 추가 개선 2 형 당뇨병과 관련된 변경 사항을보다 잘 이해 가능한 의미와 함께, phenotypically 다른 베타 세포의 절개를 사용하도록 설정할 수도 있습니다.

Protocol

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1. 인간 췌장 조직의 동결

  1. 지방 조직, 혈관, 신경 및 메스와 핀셋과 비 parenchymal 조직을 제거하고 조각 (~ 0.5-1 cm 조각)로 췌장 조직을 잘라.
  2. Cryomold의 중심에 하나 췌장 조직 조각을 놓고, 차가운 조직 - 테크 10월 컴파운드로 완전히 커버. 그의 아래 액체 질소에 미리 냉각 2 Methylbutane와 스냅 - 동결로 덮여 있습니다 병에 Cryomold을 놔. -80 ° C.에있는 냉동 샘플을 저장

2. 냉동 섹션의 작성

  1. RNA의 변성을 피하기 위해 모든 단계에 걸쳐 장갑을 착용한다.
  2. 멀리 차가운 100 % 에탄올과 RNase와 그라 이오 스탯 나이프, 표본 홀더와 붓를 청소합니다. 그라 이오 스탯 내부의 냉동 조직을 배치합니다.
  3. 조직, 칼과 붓 -20 ° C.에 도달 할 때까지 기다리 기다리는 동안 그라 이오 스탯 챔버 내부 SuperFrost 플러스 슬라이드와 사전 시원한 그들을 레이블을조직 -20 ° C.에 도달 할 수에 대한
  4. 표본 홀더에있는 조직 - 테크 10월 컴파운드를 적용하고 상단에 고정 된 조직을 배치합니다.
  5. 조직 - 테크 10월 컴파운드이 고정되면 cryoblock을 다듬과 면도날과 조직 - 테크 10월 컴파운드의 초과를 제거합니다.
  6. 췌장 조직 블록에서 40 연속 10 μm 슬라이스 총 자른다. 또한 우리는 microdissection 과정에서 조각 안에 섬의 식별을 용이하게 할 수있는 췌장 섹션의 개요 도면에 저장되는 제 1 및 중간 조각을 절단하는 것이 좋습니다.
  7. 칼 블레이드의 섹션 준수하여야 할 만 지역을 따뜻하게하기 위해 손가락 (장갑으로 덮여)으로 슬라이드의 뒷면을 터치하여 SuperFrost 플러스 슬라이드의 중앙에 섹션을 전송합니다.
  8. -20에서 그라 이오 스탯 내부의 섹션 1-2 분 ° C, 당신이 드라이 아이스에 배치 슬라이드 상자에 넣어 그 이후에 말린다. 섹션을 저장-80에서 ° C.
  9. 필요한 경우, 종이 수건과 차가운 100 % 에탄올로 칼 블레이드를 청소.

3. 냉동 섹션 탈수

  1. 시약 준비 : 30 ML 신선하게 조리 된 70 % 에탄올, 30 ML DEPC - 처리 물, 2x30 ML 100 % 에탄올과 50 ML Cellstar 튜브 (팔콘)로 30 ML의 크실렌을 흘려, 오한과 얼음에있는 모든 시약을 (크실렌 제외) 유지.
  2. 100 % 에탄올과 RNaseZAP와 후드 작업 공간을 청소하십시오.
  3. 다음과 같은 과정이 cryosections가 : 얼음 차가운 DEPC - 처리 물에 5-6 빠른 딥을 씻고, 30 초에 얼음 차가운 70 % 에탄올에 해결, 크실렌의 4 분에 품다, 얼음 차가운 100 % 에탄올에 1 분에 두 번 탈수 실내 온도 (25 ° C), 3 ~ 5 분에 대한 건조 공기에서. cryosections 또 한 쌍의로이 단계를 반복합니다.
  4. 빛과 습기에서 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싼 50 ML Cellstar 관으로 백업 뒤로 두 건조 cryosections를 삽입합니다.
<P 클래스 = "jove_title"> 4. PALM MicroBeam, Zeiss와 베타 세포의 레이저 Microdissection

  1. RNaseZAP과 현미경을 청소하고 RoboMover의 접착제 모자를 탑재합니다.
  2. 필터 세트 09 (여기 : 450-490 nm의, 방출> 515 nm 정도), AutoLPC 모드, 50 %의 레이저 에너지 65 %, 레이저 초점, 100 % 레이저 속도, AutoLPC 샷 사이에 5 μm 거리, 6 μm 거리 다음 설정을 설정합니다 -10,100 : 선에 높이를 작동.
  3. 무대에 하나의 슬라이드를 삽입합니다.
  4. 미세 시각화 (5 배 또는 10 배 렌즈) 아래 autofluorescent 베타 세포를 찾습니다.
  5. 40x 렌즈로 전환, "자유형"선택 도구를 사용하여 베타 세포를 선택하고 레이저를 사용하여 사진을 microdissect.
  6. 한 AdhesiveCap로 4 탈진 cryosections의 조직을 캡처합니다.
    1 주석 : 한 건조 cryosection의 베타 세포를 해부 할 수있는 시간이 될 것입니다 조직 섹션의 rehydration을 피하​​기 위해 10-20 분 이상이 아니어야합니다저하 RNA.
    2 의견 : 검사 점으로 무대를 이동 한 후 육안 검사에 의해 성공적으로 microdissection 프로세스를 확인합니다.

5. Microdissected 베타 세포 농축 조직의 용해

  1. RoboMover에서 AdhesiveCap를 제거합니다.
  2. AdhesiveCap의 뚜껑과 42에서 거꾸로을 길러 ° C를 30 분에에 Pipet 10 μl 추출 버퍼 (XB, PicoPure RNA 분리 키트, 악튜러스).
  3. 10,000 XG에서 스핀 다운 및 드라이 아이스에 lysate를 넣어. RNA 추출이 수행 될 때까지 -80 ° C에 저장합니다.
  4. 반복 3 단계를 반복합니다.) 5.) 다른 모든 섹션과.

6. RNA 추출

  1. 10 개의 10 μl lysates을 결합
  2. 70 % 에탄올 (DNase 처리 포함)에 1:1 비율 추출 버퍼 (XB)를 사용하여 PicoPure RNA 분리 키트, 악튜러스의 프로토콜에 따라 실온에서 협력하여 RNA 격리와 함께 진행합니다.

7. RNA 분석

  1. 애질런트 2100 Bioanalyser (PicoChip)을 사용하여 품질과 수량의 분석에 대해 1 μl RNA를 사용합니다. 정량 평가는 칩 병렬로로드 표준 RNA를 참조로 이루어집니다.

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Representative Results

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그림 1에 도시 된 바와 같이, 수정 건조 프로토콜은 이전의 게시 된 프로토콜 6에 비해 베타 세포의 autofluorescence의 개선을 이끌었다. 설명 프로토콜 적용, 39 수술 췌장 표본의 각 31'544'704 μm 조직 / 췌장 표본의 평균 (: - 81'522'153 μm 3 8'742'390 범위) 40 시리얼 cryosections를 생성하는 데 사용 된 표 1에 표시된. 이 150 μm의 직경, 또는 35,000 β-세포의 약 18 췌장 섬의 볼륨을 나타냅니다. 38 다른 섬 / 췌장 표본의 평균 (범위 : 19-80 섬)에서 유래 조직은 각각의는 일반적으로 두 개 이상의 연속 섹션에서 관찰되었다. 다른 표본 간의 섬의 수율에 큰 변화는 감지의 조직 소스, 췌장 머리 나 꼬리하거나,뿐만 아니라 운영자의 진보적 인 개선의 이질성을 반영각 섹션의 검사에 투신 한 10 분 시간 내에 섬의 이온.

각 microdissected와 lysed 조직의 총 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라, 응용 Biosystems의 악튜러스 PicoPure 냉동 RNA 절연 키트와 함께 정화 및 11 μl에 용출되었다. 각 샘플의 그 후 1 μl RNA는 애질런트 2100 Bioanalyser에 의해 분석되었다. 5.8의 평균 RNA 무결성 번호 (린) (범위 : 3.4-7.2)로 - : 우리는 평균 42 NG RNA / 표본 (229 NG / 시편 5 범위)에 취득 하였다. 그림 2는 RNA 분석의 예를 보여줍니다. 어느 쪽을 선택할 린 값을 모두 분석 RNA 샘플이 성공적으로 transcriptomic 연구에 사용되었다. 우리는 microdissected 조직의 금액과 RNA 수율 사이의 직접적인 관계를 찾을 수 없습니다. 외과 의사에 의해 수확과 병리학에 의한 심사 출시 된 이후 췌장 표본의 동결 사이의 시간 간격의 차이는 P의 계정 수 복구 RNA의 변수 품질과 수량에 대한 예술. 고려해야 할 다른 중요한 요소는 높은 R​​NA 무결성을 항복 낮은 에너지뿐만 아니라 레이저 초점 LPC 점의 거리와 함께 microdissection 신청 레이저 에너지입니다. 작은 검은 점을 형성 슬라이드의 유리 표면에 레이저의 약간의 "영향"가, 볼 수있는 때 초점은 이상적으로 설정되어 있습니다. 우리 손에 가장 좋은 결과는 섹션의 두께의 차이에 대해 보상하도록 구성에도 불구하고 50 % 레이저 에너지, 65 %의 레이저 초점, 5 μm의 LPC 지점의 거리를 달성하고 있습니다. 또한, RNA 수량이 RoboMover의 작업 높이를 유지하여 최적화 할 수 있습니다, 캡처 과정에서 microdissected 조직의 손실을 피하기 위해 가능한 한 낮은 접착제 캡과 섹션 사이의 거리를 즉. 우리 집합에서 작업 높이를 백업 -10,100 임의 PALM 단위에 있습니다.

붙인다 "> 표본 <TD> 30
섬 / 표본의 수 수집 조직 볼륨 / 시편 [μm 3] 농도 [μl / NG] 총 RNA [NG]
DP002 34 24'947'696 5.2 1.149 10.34
DP003 30 41'141'488 5.5 1.677 15.09
DP005 23 27'024'264 3.5 8.259 66.07
DP006 25 45'900'848 3.4 7.399 59.19
DP007 23'936'048 6.5 0.595 4.76
DP008 22 68'248'432 6.2 1.559 14.03
DP010 34 33'156'752 5.6 1.750 19.25
DP011 29 31'339'152 6.0 1.365 15.02
DP012 34 57'594'360 6.3 3.025 33.28
DP017 35 28'212'256 6.0 1.292 14.21
DP030 35 48'007'530 5.6 2.180 23.98
DP013 36 34'371'045 6.9 1.350 14.85
DP014 35 21'360'060 7.2 1.270 13.97
DP015 33 20'923'488 4.1 4.000 44.00
DP019 40 35'431'704 7.0 1.670 18.37
DP025 19 15'329'844 6.6 0.496 5.46
DP034 19 81'522'153 6.4 4.260 46.​​86
DP039 32 19'074'410 6.5 1.270 13.97
DP040 44 31'565'630 5.4 2.300 25.30
DP042 52 40'333'840 7.0 2.510 27.61
DP021 65 33'996'260 6.3 2.830 31.13
DP023 19 19'513'310 5.6 8.250 90.75
DP024 32 24'125'140 6.3 20.780 228.58
DP038 23 18'306'040 6.6 11.700 128.70
DP045 35 36'345'620 6.3 1.100 12.10
DP033 42 26'078'550 6.5 15.380 169.18
DP022 49 33'535'460 6.8 7.590 83.49
DP041 56 34'899'830 5.7 3.350 36.85
DP049 38 18'521'230 6.8 1.020 11.22
DP028 32 16'410'670 5.6 1.720 18.92
DP056 36 19'737'580 5.7 1.130 12.43
DP059 52 23'376'180 3.6 7.880 86.68
DP047 41 20'658'370 6.4 1.040 11.44
DP036 23 8'742'390 3.5 0.950 10.45
DP027 42 29'150'480 5.1 3.410 37.51
DP046 54 16'800'070 5.3 8.210 90.31
DP055 57 32'340'270 6.2 1.280 14.08
DP064 74 41'896'460 6.5 2.440 26.84
DP067 80 46'388'540 6.3 5.200 57.20
평균 38 31'544'704 5.8 3.965 42.14
섬 / 표본의 수 수집 조직 볼륨 / 시편 [μm 3] 총 RNA [NG]
범위 19-80 8'742'390 - 81'522'153 3.4-7.2 4.76-228.58
평균 38 31'544'704 5.8 42.14

표 1. microdissected 조직의 금액과 추출 된 RNA의 품질과 수량의 개요. 표본은 시간적으로 나열되어 있습니다. 수집 된 조직 볼륨은 다음과 같이 계산됩니다 cryosection의 두께 (10 μm) × microdissected 지역 [μm 2]. 각 샘플 1 μl RNA는 애질런트 2100 Bioanalyser의 PicoChip에 분석되었다.

1 그림. 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence 중 실내 온도 (A), 또는 얼음처럼 차가운 (B) (여기 450으로 유지되었습니다 시약과 췌장 cryosections의 탈수 후 베타 세포의 Autofluorescence - 490 나노 미터, 방출> 515 nm의,. 400 X 확대). 췌장 덕트, 선박 및 콜라겐는 녹색 색상을 표시하는 반면 베타 세포가 노란색 표시됩니다. 규모 바 : 75 μm.

그림 2
그림 2. 표준 RNA 샘플 (A)에 비해이 LMD 프로토콜 (B)를 얻은 사람의 작은 섬 RNA 샘플의 추출 RNA 작은 섬. 프로필의 품질 및 수량. 각 샘플 1 μl RNA는 PicoChip에 적용 quantit에 대한 분석되었다애질런트 2100 Bioanalyser와 y 및 품질. (A) : 린 (RNA 무결성 번호) 7.7 [rRNA 비율 (28S/18S) : 1.3)], (B) : 린 7.2 [rRNA 비율 (28S/18S) : 1.1)]. 작은 섬 RNA의 농도는 21'360'060 μm 췌장 조직에서 10.3 NG 총 금액에 대해 1.3 NG / μl이었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

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우리는 수술 췌장 표본의 인간 섬의 레이저 microdissection (LMD)에 대한 신뢰할 수있는 접근 방법을 설명합니다. LMD 현미경을 사용할 수 있다고합니다,이 절차는이를 모두 비 당뇨병과 2 형 당뇨병 환자 과목에서 인간의 작은 섬 소재에 대한 액세스를 증가, 부분 pancreatectomies를 수행하는 연구 기관에서 구현 될 수 있습니다. 이 작은 섬 고립에 제공 pancreata의 소수 주어진 특히 해당됩니다. 의 Favourable 관점이 collagenase의 소화에 의해 작은 섬 고립에 비해 LMD하면 조직의 explantation 및 RNA 추출 7 베타 세포의 농축 7뿐만 아니라 거칠고 기계 및 효소 조작 (8)의 소지를 없애기 위해 섬의 처리 사이의 감소 시간이며, 유전자 발현 프로필을 변경 할 수 9,10. 부분적으로 pancreatectomized 환자의 경우 더 많은 임상 및 신진 대사 정보 기관의 경우보다 일반적으로 사용할 수 있습니다기증자. 한편, 낮은 린 값과 LMD 수율 적은 RNA의 섬의 고립은 collagenase를 소화 한 후 관찰들에 비해 및 기능 연구를위한 생활 섬을 제공하지 않습니다. 또한, 수술로 이어지는 췌장 질환 췌장 표현 프로파일에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 찬반 양론의 균형 잡힌 평가 collagenase의 소화에 의해 수행하고있는가 multicenter 혁신적인 의료 사업에 지속적으로 장기 기증자 또는 부분적으로 pancreatectomized 환자에서 두 LMD 작은 섬 isolations의 큰 숫자에 비교 연구를 통해 달성 될 것입니다 ( "당뇨병의 치료 모니터링에 대한 진단 생체의 개선 베타 세포 기능과 식별"의 목적으로 당뇨병 (IMIDIA) http://www.imidia.org ).

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리는이 프로젝트의 여러 단계에 도움, 조언과 중요한 입력을 제공하는 모든 동료에게 감사하고 싶습니다. 이 비디오 문서의 생산은 IMIDIA (의 자금이 지원 된 http://www.imidia.org ), 교육 및 당뇨병 연구 독일 센터 (DZD로 연구 (BMBF)에 대한 독일의 성 http://www.dzd - ev.de ) 기술 드레스덴 (Dresden)의 대학에서 대학 병원 칼 구스타프 이카루스 호. 이 책자에 이르는 작품 부여 계약을 N ° 155005 (IMIDIA), 유럽 연합 (EU)의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)와 EFPIA에서 금전적 인 기부로 구성되어있는 자원을 아래에 혁신적인 의약품 사업 공동 인수의 지원을 받고 있습니다 회사의 종류 기여 인치

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (isopentane) ROTH 3927.1
AdhesiveCap (opaque, 500 μl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 210 261 with support skirt
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 227.261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Dry ice
Ethanol absolute VWR 20821.310
Liquid nitrogen
Paint brush
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top internal 22x22 mm, depth 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Plastic clamp
Razor
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel / surgical blade Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus adhesion microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura 4583 or 0807000022
Tweezers BRAUN BD168R
Xylene VWR 28975.291

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References

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Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).More

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).

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