Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232

Summary

זכרון מטבולית הוא התופעה שמתרחשת סיבוכי סוכרת להתמיד ולהתקדם ללא הפרעה גם לאחר euglycemia מושגת pharmaceutically. כאן אנו מתארים מודל סוכרת דג זברה שהוא ייחודי בכך שהיא מאפשרת בדיקה של רכיבי epigenetic mitotically המסירים של זיכרון מטבולים

Abstract

הסוכרת משפיעה כיום 346,000,000 אנשים וזה צפוי להגדיל עד 400 מ'עד 2030. ראיות מהמעבדה והן בניסויים קליניים בקנה מידה גדולים גילו כי התקדמות סיבוכי סוכרת ללא הפרעה דרך התופעה של זיכרון מהטבולים גם כאשר שליטה הגליקמית מושגת pharmaceutically. ביטוי גנים יכול להשתנות ביציבות באמצעות שינויי epigenetic שלא רק מאפשרים לתאים ואורגניזמים כדי להגיב במהירות לשינויים בגירויים סביבתיים, אלא גם העניק לו את היכולת של התא כדי "לזכור" מפגשים אלו פעם הגירוי מוסר. ככזה, את התפקידים שמנגנונים אלה לשחק בתופעת הזיכרון מהטבולים כעת, נבדקים.

יש לנו דיווח לאחרונה הפיתוח של מודל דג זברה מסוג אני סוכרת ומאופיינת במודל זה כדי להראות שדג זברה הסוכרתי להציג את הסיבוכים מהשניים הידועים, כולל שינויים הקשורים לא רקעם רטינופתיה סוכרתית, נפרופתיה סוכרתית וריפוי פצעים לקוי אלא גם תערוכת התחדשות סנפיר זנב נפגע. מודל זה הוא ייחודי בכך שדג הזברה הוא מסוגל להתחדש הלבלב הפגוע שלה ולשקם את מדינת euglycemic דומה למה שניתן היה לצפות בחולים אנושיים שלאחר ההשתלה. יתר על כן, סבבים רבים של קטיעת סנפיר זנב לאפשר הפרדה ומחקר על השפעות epigenetic טהורות במערכת vivo ללא גורמי סיבוך פוטנציאליים מהמצב הסוכרתי הקודם. למרות euglycemia מושגת בעקבות התחדשות לבלב, הסיבוך מהשני של התחדשות הסוכרתית סנפיר וריפוי פצעי עור נמשך ללא הגבלה זמן. במקרה של התחדשות סנפיר לקויה, פתולוגיה זו נשמרה גם לאחר סבבים רבים של התחדשות סנפיר ברקמות הסנפיר בת. תצפיות אלו מצביעות על תהליך epigenetic בסיסי הקיים במדינת הזיכרון מהטבולים. כאן אנו מציגים את השיטות הדרושות להצלחת genקרוא את קבוצות זכרון סוכרת וחילוף חומרים של דגים ולדון ביתרונות של מודל זה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

סוכרת (DM) היא בעיה בריאותית רצינית, וצמיחתו, שגורם לקיצור תוחלת חיים בשל כלי דם מחלה ספציפיים (רטינופתיה, נפרופתיה, נוירופתיה ריפוי, ליקוי פצע) וmacrovascular (מחלות לב ושבץ) סיבוכים 1. סיבוכי סוכרת, ברגע שיזמו ממשיכים להתקדם ללא הפרעה גם כאשר שליטה הגליקמית מושגת 2,3 ותופעה זו זכתה לכינוי זיכרון מטבולים או השפעת המורשת. נוכחותה של תופעה זו הוכרה קלינית בתחילת 1990 כ" לשלוט בסוכרת וסיבוכי המשפט (DCCT) "התקדם ומאז כבר נתמך על ידי ניסויים קליניים נוספים מרובים 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. מודלים של בעלי חיים של DM היו קריטיים לתגליות הקשורים לפיזיולוגית פתים-של סיבוכי סוכרת וזיכרון מטבולים. למעשה, ההתמדה של סיבוכי סוכרת תועדה לראשונה במודל של כלבים סוכרתייםרטינופתיה שמאז נתמכת על ידי מספר קווים של ראיות ניסיוניות תוך שימוש במגוון מערכות בתרבות מבחנה ומודלים של בעלי חי 15,16,17,18,19,20,21. מחקרים אלו מראים בבירור כי תוצאות תקופת hyperglycemic ראשוניות בהפרעות קבע (כולל ביטוי גנים חריג) של איברי המטרה / תאים ומכאניים מרמזות על המעורבות של epigenome.

Epigenomes כולל את כל השינויים שהכרומטין לסוג תא נתון והם אחראים לפרופיל ביטוי הגנים הייחודיים של תא. שינויי כרומוזום הם דינמיים במהלך התפתחות, התמיינות תאי תמיכה, מגיבים לגירויים חיצוניים, mitotically עוברים בירושה ביציבות 22,23 וניתן לשנות במחלה 24,25,26. מנגנוני epigenetic אלה כוללים: לפרסם שינויי translational היסטון, הכללת גרסת היסטון הלא קנוניה בoctomers, שינויי גישת הכרומטין באמצעות מתילציה DNA, וגניםביטוי שליטה באמצעות קידוד הלא RNAs מייקר 27,28,29,30. בסך הכל, תהליכי epigenetic לאפשר לתאים / אורגניזמים כדי להגיב במהירות לשינויים בגירויים סביבתיים 31,32,33, הם גם העניקו לו את היכולת לתא כדי "לזכור" מפגשים אלו פעם הגירוי מוסר 23,22. לכן, כמו פרופילי ביטוי גנים שעברו שינוי כתוצאה מתהליכי epigenetic הם יציבים בהיעדר האות (הים) שיזם אותם והם תורשתיים באמצעות חלוקת תא, שהם צברו עניין רב כבסיס מנגנונים מולקולריים של מחלות אנושיות, כולל זיכרון מטבולים. את התוצאות כי הם מתעוררים בהקשר של DM ואפיגנטיקה התקדמות מקבילה במחלות אחרות שבשפע של שינויים הנגרמים על ידי epigenetic היפרגליקמיה גורם לשינויים קבועים מדהימים ברשתות תעתיק של תאים (שנסקר ב34,35,36,37,38).

דג הזברה כבר זמן רב אורגניזם מודל מוביל לסטופיתוח חוליות dy זאת 15 השנים האחרונות ראה צמיחה המעריכית בניצול אורגניזם זה למחקר של מחלות אנושיות. 39. מודלים של מחלות אנושיות דג זברה כבר הוקמו פורשים מגוון רחב של פתולוגיות אדם כולל הפרעות גנטיות ומחלות נרכשות 40,41,42. את היתרונות הרבים של דג הזברה על אורגניזמים מודל חוליות אחרים כוללים פוריות גבוהה, זמן דור קצר, שקיפות דרך הבגרות מוקדמת, צומצמו הוצאות שכר דירה ומערך של כלים למניפולציה גנטית. יתר על כן, בשל השימור הנרחב של מסלולים גנטיים ופיזיולוגיה סלולרית בקרב בעלי החוליות והיכולת לבצע הקרנות סמי קצב העברת נתונים גבוהות, דג הזברה שמש בהצלחה לגילוי תרופות.

פתחנו מודל דג זברה בוגר בסוכרת מסוג I המשתמשת בסמי diabetogenic, streptozocin. יש לנו מאופיין במודל זה כדי להראות שדג זברה סוכרתי לאלא להציג רק את הסיבוכים משניים האדם הידועים, אך בנוסף, הם מציגים החייאת איברים לקויה (התחדשות סנפיר זנב) כתוצאה מסביבת hyperglycemic. בנוסף, יש לנו דיווח שדג זברת hyperglycemic לחזור glycemia הנורמלי בתוך 2 שבועות של הסרת תרופה בשל התחדשות של תאים בטאו בלבלב וכתוצאה מכך אנדוגניים מדינת גליקמי פיסיולוגי נורמלית. עם זאת, בניגוד לכך, החייאת איברים בדגים אלה נותרת לקויים באותה המידה כמו במצב הסוכרתי החריף המציין סיבוך זה נמשך והוא רגיש לזיכרון מטבולים. הדחיפה העיקרית ליצירת מודל זה הייתה לספק מערכת כדי ללמוד את מרכיבי mitotically היציבים epigenetic התומכים בתופעת הזיכרון מהטבולים בהעדר רעש רקע סביבת hyperglycemic הקודמת. בסיומו של הפרוטוקול המסופק כאן את רקמות דג הזברה וסלקטיבית או יכולות להיות מעובד על ידי כל בדיקה מתאימה לresearchers צריך. אנחנו השתמשנו בהצלחה בהליך זה כדי לזהות את שינויי הגנום המתמשכים במתילציה DNA הנגרמים על ידי היפרגליקמיה שנשמרים בזיכרון מטבולי המדינה 21.

אנו חשים כי מודל דג זברה זה מסוג שהסוכרת יש מספר יתרונות על פני מערכות חדשניים מודל אחרות לבחינת זיכרון מטבולים. 1) כל המחקרים שלנו יכול להתנהל בvivo וכדגי hyperglycemic הקודמים לחזור לeuglycemia דרך התחדשות של ייצור האינסולין אנדוגני, הם אינם דורשים הזרקת אינסולין חיצונית. לכן, זה ימנע את הקוצים המסבכים ועמקים בשליטה הגליקמית שעלולות להתרחש בבעלי החיים הזקוקים לאינסולין אקסוגני. 2) כפי שתואר לעיל, גירוי הרקע מהמצב הסוכרתי הקודם (כלומר המשך נוכחותם של מוצרים סופיים glycation המתקדם וסמני מיני חמצן תגובתי) בוטל ולכן ניתן לבחון טהור epigגורמי enetic של זיכרון מטבולים. 3) הניסויים יכולים להתבצע במהירות כפי שהוא לוקח כ 80 ימים מאינדוקצית סוכרת עד בדיקת זיכרון מטבולים. 4) התחדשות סנפיר זנב היא ניסוי מאוד נגישה ומאפשרת מניפולציה גנטית וניסיונית קלה עבורה יש מגוון רחב של כלים. 5) התחדשות סנפיר זנב מספקת שיטה פשוטה מאוד וכמותיים להערכת זיכרון מטבולים, ולכן יאפשר לגילוי סמים בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל ההליכים מתבצעים בעקבות ההנחיות המתוארות ב" עקרונות טיפול בבעלי חי מעבדה "(המכונים הלאומיים לבריאות אין פרסום. 85-23, מתוקן 1985) והטיפוח אושר רוזלינד פרנקלין האוניברסיטה המוסדי בעלי החיים והשתמשו ועדת חית פרוטוקול 08-19.

יש 2 קיצורים חשובים המשמשים בכתב היד הזה. 1) DM: מתייחס לדגים שנמצאים באקוטית (300 מ"ג / ד"ל) מדינת hyperglycemic והיו לפחות 3 שבועות. 2) MM: מתייחס לדגים שהיו 21 יום (ראה פרוטוקול) דגי DM ואפשרו לשחזר שליטה הגליקמית באמצעות התחדשות לבלב. זו מושגת בתוך (14) ימים של הסרת תרופה. הדגים נחשבים דגי MM מנקודה זו ואילך. כמו כן, חשוב לציין כי דגים המכונים שליטת מטופלים באופן זהה כדגי DM או MM במונחים של מספר הזריקות (מלח בלבד), זמני הדגירה בטמפרטורות השונות ואת המספר ועיתויקטיעות סנפיר זנב.

1. דור של דג זברה עם סוכרת, דגי DM

  1. הכן הן התאוששות ומכלי מי הרדמה. מים הם מי שחזור דגים נורמלים. למי הרדמה להוסיף מספיק 2-phenoxyethanol כך ש1:1,000 דילול במי דגים רגילים מושג.
  2. הכן את פתרון 0.3% (במנדף) של streptozocin (STZ) על ידי הוספת 6 מ"ג של STZ עד 2 מ"ל של 0.09% נתרן כלורי ולהציב את הפתרון באופן מיידי על קרח. זה יספק פתרון הזרקה דיו להזרקה של כ 20 דגים ב20 דקות. אם תחרוג הסימן 20 דקות, לעצור, ולהפוך את פתרון STZ טרי לפני שתמשיך. בפתרון צינור נפרד aliquot מספיק מלח לדגי שליטה. ברגע שהוא STZ solubilized כל השלבים הבאים אינם דורשים שימוש במנדף.
  3. מלא מזרק סמ"ק ½ המצויד במחט 27 1/2 מד עם פתרוני STZ או שליטה להבטיח כי אין בועות אוויר כלואות.
  4. Anesthetize כל דג בנפרד על ידי נחת הדג במי הרדמה, ולחכות עד שתנועת השחייה שלהם מפסיקה (1-2 דק ').
  5. לאחר זמן קצר הרדים למקם את הדגים במגבת נייר כדי לספוג את עודפי מים, הנח את הדג במשקל סירה ולמדוד את המסה של הדגים.
  6. מניח את הדגים על משטח יציב (מכסת צלחת פטרי) להזרקה.
  7. הזרק פתרון שליטה STZ או לתוך חלל הצפק של הדגים על ידי החדרת מחט עבר פוע להיבט האחורי של הצפק הגחון.
  8. 0.35 מ"ג / g צריך להיות מועבר (350 מ"ג / ק"ג) של STZ לכל דג והנפח של 0.3% נדרש הפתרון יכול להיות מחושב באופן הבא.
    1. הכפל המוני של דגים (ז) ב -0.35 להניב כמות STZ במ"ג הנדרשת.
    2. לחלק את המוצר שנוצר על ידי מעל 3 להניב הנפח של פתרון 0.3% נדרש הזרקה בμl.
      לדוגמה: לדגים 0.5 גרם:) 0.5 x 0.35 = 0.175 ב) .0175 / 3 = 0,058 מ"ל= 58 μl.
      אותו הנפח ללא STZ הייתי להיות מוזרק לדגי שליטה. גיליון לכרכים להזריק למסת דג צריך להיות שנוצר ומשמש להתייחסות מהירה.
  9. הזריקה הבאה למקם את הדגים במכל מי ההתאוששות ולפקח עליהם לפעילות שחייה רגילה. ברגע שזה הושג הדגים מועברים למכל חיים נורמלי שנשמר בטווח הטמפרטורות המופחתת של 22 ° C - 24 ° C. טמפרטורה מופחתת זו היא קריטית עבור אינדוקציה יעילה של היפרגליקמיה (סוכרת, DM).
  10. למרות היפרגליקמיה מזוהית בתוך 24 שעות מהזריקה הראשונה, כדי לגרום למצב ממושך של היפרגליקמיה גבוהה מאוד דג הזברה דורש שלב אינדוקצית הזרקה תכופה אחרי זריקות תחזוקה שבועיות, כמוצג להלן.

שבוע 1: 3 זריקות (יום 1, 3, 5), שבוע 2: הזרקה 1 (יום 12), שבוע 3: זריקה 1 (יום 19),
שבוע 4: (יום 21) בצעבדיקה של עניין.

בשלב זה דג הזברה נחשב להיה במצב ממושך של היפרגליקמיה ולהציג את סיבוכי הסוכרת של רטינופתיה, נפרופתיה והתחדשות סנפיר גם נפגעה. אלה מכונים כמו דגי DM. בנוסף אם רוצה את הדג יכול להישמר במצב hyperglycemic עם זריקות תחזוקה שבועיות. כ 5% מוות במהלך תהליך זה צריך להיות צפוי.

2. איסוף דם ורמת הגלוקוז בדם בצום (FBGL) קביעה

  1. כל קבוצה של דגי DM ובקרה חייבת לכלול מספיק דגים לקבוע במדויק FBGL הממוצע של הקבוצה כassay זה מחייב את הדגים כדי להיות קורבן.
  2. הכן את צינור PCR מתויג לכל דגימת דם המכילה 5 μl של תמיסת מלח הרגיל סטרילי.
  3. לאיסוף דם, להרדים דגים כאמורים לעיל, להסיר את כל המים, הנח את הדג בשקופית מיקרוסקופ ובאמצעות אזמל, הסר את הראש של הדגבבסיס operculum.
  4. איסוף הדם (עד 2 μl) כי הוא שוחרר מהדגים לשקופית ולהוסיף אותו במהירות ל5 μl של תמיסת מלח הרגיל סטרילי pipetting למעלה ולמטה כדי לוודא שהדם לא סותם. מייד למקם את המדגם על קרח.
  5. לקבוע את נפח דם מדגם על ידי מדידת הנפח הכולל של הנוזל (תמיסת המלח + דם) ולאחר מכן את ההפחתה 5 μl של תמיסת מלח.
  6. העברת 5 μl של הדם המדולל מכל צינור PCR לתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge ולקבוע את ריכוז הסוכר בדם באמצעות ערכת Assay גלוקוז QuantiChrome. זה מבוצע על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן ללא יוצא מן הכלל. תוצאות צפויות: דגים רגילים / שליטת 60 מ"ג / ד"ל ודגי 310 DM מ"ג / ד"ל.

3. זנב סנפיר מחקרי התחדשות

  1. הרדם דגים כמתואר ב1.0-1.4.
  2. דג מניח על מכסה צלחת הפטר ולקטוע סנפיר הזנב בקו ישר באמצעות גודל סטרילי10 אזמל הפרוקסימלי לנקודת הסתעפות lepidotrichia הראשונה תוך צפיית הסנפיר באמצעות מיקרוסקופ לנתח.
  3. אפשר דגים להתאושש כמו ב1.10 אבל למקם את הדגים על 33 מעלות צלזיוס במשך שלב צמיחת המשובים של assay. זו טמפרטורה שהוקמה לניתוח סנפיר התחדשות מואץ.
  4. הסנפירים ניתן הדמיה בכל קטיעת הודעת זמן זאת אנו שגרתי לבחון את צמיחת רגנרטיבית ב24, 28 ו 72 שעות לאחר סעיף טראנס.
  5. הרדם דגים כמו קודם (ראה 1.0-1.4), הצב את הדגים תחת מיקרוסקופ לנתח מצוידים במצלמה (אנו משתמשים בניקון SMZ-1500 מצוידים במצלמה ש-הדמיה) ולאסוף את כל התמונות בהגדלת סנפיר 1X עם תוכנת אלמנטי ש"ח . הסנפיר צריך להתפשט להדמיה כך שהוא הוארך באופן מלא ללא מתיחה או לפגוע ברקמה וצריך להיות חופשי מכל טיפי מים. לעקביות תמיד שם בצד הגבה מהימין.
  6. הדפסת תמונות ולמדוד את משובי groאזור wth באמצעות תוכנת J תמונה ושימוש במשטח ציור. עקוב הקיף את כל השטח של צמיחה חדשה ולקבוע את האזור. כל מדידה צריכה להיעשות חמש פעמים ועמדו בממוצע על מנת להבטיח דיוק העקיבה. חשוב שהתמונות ששמשו אין לי צללים או טיפי מים כמו אלה תורמים לטעויות במדידת שטח התולדה.
  7. מדוד את אורכו של אתר הקטיעה לאורך הציר הגבה-הגחון ולחלק את השטח שנקבע ב3.6 על ידי מדידה זו. זה מאפשר דגים בגדלים שונים להשוואה ישירה.

4. דור של זיכרון מטבולים (MM) דג זברה

  1. ליזום קבוצה של דגי DM והבקרה הנאותה שלהם כמפורט בסעיף 1.
  2. ב 21 ימים לקבוע את FBGL לקבוצת משנה של הקבוצה ולחלק את דגי DM ל 2 קבוצות. המשך STZ זריקות שבועיות לאחת מהקבוצות כפקדי DM, במשך תקופת הניסוי. להפסיק הזרקת STZ לקבוצה וincubat 2דואר הדגים בטמפרטורה נורמלית. תוך 14 ימי דג זברה אלה יהיה לשחזר אינסולין בדם נורמלי ושליטה באמצעות התחדשות הלבלב גלוקוז. דגים אלה נקראים עכשיו MM (דגי זיכרון מטבולים).
  3. ביום הסרת תרופת הודעה 30 לקטוע את סנפירי הזנב של שליטה, DM וMM דגים באמצעות שיטה המתוארת ב3.2.
  4. להחזיר דגים לתנאי מים רגילים להתחדשות סנפיר במשך 30 ימים. זה מאפשר צמיחה של מה שאנו מכנים רקמות, חילוף חומרי זיכרון.
  5. ב60 יום לבצע קטיעה שנייה (כמתואר ב3.2) בתוך הרקמה שיוצרת מחדש בתקופה מ30-60 ימים ולבצע את assay זנב סנפיר ההתחדשות (3.1-3.7) איור 1.
  6. מבודד את הרקמות ולבצע בדיקה של עניין. ראה בטבלת 1 סיכום פרוטוקול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הקלד דג זברה סוכרתי לא רק להציג את הסיבוכים משניים הידועים של רטינופתיה ונפרופתיה, אלא גם, מפגין סיבוך נוסף: התחדשות סנפיר זנב לקויה. סיבוך מאוחר יותר זה נמשך בשל זיכרון מטבולים בדגים ששוחזרו בקרת סוכר נורמלית לאחר תקופת hyperglycemic. באיור 2 א (שליטה) והתרשים 2B (זיכרון מטבולים) תמונות מייצגות של סנפירים מתחדשים שנלכדו בפוסט קטיעת 72 שעות מוצגים. הגירעון ניתן לכמת וכפי שמוצג באיור 2C DM וMM דג הזברה מציג גירעון של כ 40% ב 72 שעות בהשוואה לשליטת דגים. למרות הנתונים הכלולים באיור 2C מסתיימים בשעת 90 יום אותה פגיעה זו נצפתה כרחוקה כ150 ימים.

טבלת 1. סיכום פרוטוקול.

איור 1
איור 1. קריקטורת אתרי קטיעה לניסויי זיכרון מטבוליים. הצבע הכחול מייצג רקמה שנחשפה למדינת hyperglycemic הקודמת. הצבע הירוק מציין רקמה שגדלה מהיפרגליקמיה הודעת ימים 30-60. הקו המקווקו השחור מציין את אתר הקטיעה היא הועלתה לראשונה ביום 30 והאדומים מציין אתר קטיעת פוטנציאל שיתרחש ב 60 ימים.

איור 2
איור 2. התחדשות סנפיר זנב מצטמצמת בסוכרת (DM) וזיכרון מטבולים (MM) דג זברה. א תמונת סנפיר זנב נציג משליטה הזריק דגים מראה כמות נורמלית של רג72 קטיעת הודעה enerative צמיחת שעות. הקו המקווקו הלבן מייצג את המטוס וקטיעת הקו המוצק הוורוד demarks תולדת רגנרטיבית. הסכום של התחדשות נקבע על ידי התחקות האזור הכיל בתוך קווים והרודים ולבנים מחולקים באורכו של הקו הלבן לנרמל את ההבדלים בגודל סנפיר. ב תמונת נציג זנב סנפיר משני DM או MM ממחישה כמות מופחתת של צמיחת רגנרטיבית 72 קטיעת הודעת שעות. הקווים והמדידות באזור זהה למצגת פנל א ג הגרפית של קצב ההתחדשות היחסית של דג זברת DM ומ"מ בהשוואה לקבוצת ביקורת. האחוז היחסי (לבקרות שנקבעו ב 100%) של דג זברת תולדת משובי DM וMM ב 72 שעות שהיא מוצגת. הזמן בימים המתוארים הוא ביחס לכאשר STZ הממשל הופסק לקבוצת הזיכרון מהטבולים. נתונים אלה בי ליצור על ידי מספר חוקרים ולשלב מעל 1,000 דגים לכל קבוצה. <> 2A חזק ואיור 2B האיור הותאמו באישור אולסן ואח' 43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

סוכרת היא מחלה של חוסר ויסות חילוף חומרים, אובחנה בתחילה כיפרגליקמיה, שסופו של דבר גורמת לניזק כלי דם שמוביל לסיבוכים רבים שנמשכים גם לאחר כל euglycemia המושגת למרות התערבות תרופות. התמדה זה של סיבוכים המכונית זיכרון מטבולים וכמה מחקרים שנערכו לאחרונה בחנו את התפקיד שמנגנוני epigenetic לשחק בתופעה זו. כאן יש לנו מפורט בפרוטוקול המאפשר לדור של שתי סוכרתיים חריפים ודג זברת זיכרון מטבולים (גלוקוז שליטה שוחזרה). אנחנו עוד תארנו את המתודולוגיה שיכולה להיות מועסקות על מנת להפריד בין תרומות epigenetic מהמרכיבים פוטנציאליים מסבכים של המדינה הסוכרתית הקודמת. ברצוננו להדגיש כי דגים ניתן לבחון בכל נקודה עם כל בדיקה של עניין לחוקר המסוים, ולכן את היישומים במורד הזרם לגילוי עתיד הם אינסופיים.

Therדואר כמה שלבים בפרוטוקול דיון כי צו כלשהו והדגיש עוד יותר. מניסיוננו STZ 0.3% בפתרון מתדרדר ומאבדת את האפקטיביות שלו אחרי כ 20 דקות. לכן אנו מציעים שטיימר ולשמש פתרון טרי להיעשות במרווחי 20 דקות. במהלך הניסיונות הראשוניים שלנו ליצירת דג זברה סוכרתי אנחנו רק באמצעות זריקה אחת בשבוע הראשון והיו מוצלחים עם כ 40% מהדגים. ככזה, אין דרישה קפדנית לשלוש זריקות, עם זאת, כאשר שלוש מבוצעים שיעור ההצלחה עולה על 95%. שנית, כאשר הזרקת STZ לדג הזברה חשובה שהמחט מוחדרת באופן שפוע של המחט הוא באופן מלא בבטן הדג, כדי לאפשר מחלק נכון של הפתרון, עם זאת, יש להיזהר שזה רחוק מדי כדי לחדור למנוע ניזק פנימי. ברגע שהפתרון STZ או שליטה מנוהל דגים מודגרת בטמפרטורה מופחתת (22 ° C - 24 & dלדוגמה: C). אנחנו לא יכולים מעל להדגיש את החשיבות של הטמפרטורה המופחתת כבלי זה דג הזברה יהיה לחדש את תאי הבטא שלהם (STZ המוזרק) והיפרגליקמיה לא יכולים להיגרם ביעילות. לבסוף, בדם דג זברת ידינו נקרש מהר מאוד שמונע פעולת נימים הנדרשת לשימוש Glucometer יעיל ולכן איני ממליץ על השימוש בם. אנחנו גילינו שassay QuantiChrome תאר הוא לא רק אמין ביותר, אבל הכי הקל לביצוע וללמד אנשי מעבדה. באופן קולקטיבי את הטכניקות המתוארות בפרוטוקול הן לא קשות ואם באמצעי הזהירות נלקח עם השלבים שתוארו לעיל הדור של דג זברה סוכרתי היא מובטח.

יש מעט מאוד מגבלות בתוך ההליך המתואר בכתב היד הזה, עם זאת כל דגמי התוצאה של התרופות למחלות תמיד יש להם ביקורת על תופעות לא לעניין שהוטחו בם. אנו מפנים את הקורא לdetailin כתב היד הראשונית שלנוגרם זה מודל כפי שספקנו 5 קווים עצמאיים של ראיות (כולל הזרקה ישירה STZ לסנפירים) המתעדים שאין תופעות יעד off של STZ 43. מגבלה אפשרית נוספת לא באה מההליך עצמו, אלא מהעובדה שריאגנטים למחקר דג הזברה הם עדיין לא ברמה של אורגניזם מודל אחר, כגון עכברים. למרבה המזל, כדג זברה משמש יותר ויותר כאורגניזם מודל למחלה אנושית חסר זה מתבצע תיקון במהירות.

לסיכום, כמפורט במבוא, מודל דג הזברה של סוכרת תואר כאן יש מספר יתרונות על פני אורגניזמים מודל אחרים. חשוב מכך, הוא מאפשר בחינה של הרכיבים טהורים epigenetic שתומכים בתופעת הזיכרון מהטבולים. כפי שזה צפוי כי 400 מיליון אנשים יהיו נגועים בהפרעה זו אנו חשים שהתרומה ממחקרי ניצול מודל זה יכול להיות השפעה משמעותית על בריאות אדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של קרן משפחת איאקוקה, רוזלינד פרנקלין האוניברסיטה הזנק כספים, והמכונים הלאומיים לבריאות גרנט DK092721 הלאומי (לRVI). המחברים מבקשים להודות לניקי Intine לסיוע בהכנת כתב יד.

Materials

יום נוהל
1
3 DM = STZ הזרקה (350 מ"ג / ד"ל), שליטה = הזרקה מי מלח
5 DM = STZ הזרקה (350 מ"ג / ד"ל), שליטה = הזרקה מי מלח
12 DM = STZ הזרקה (350 מ"ג / ד"ל), שליטה = הזרקה מי מלח
19 DM = STZ הזרקה (350 מ"ג / ד"ל), שליטה = הזרקה מי מלח
21 כך או לבצע בדיקה של עניין לדגי DM או להמשיך לעשות קבוצות MM ידי הסרת לחץ STZ.
51 לקטוע סנפירי 30 ימים לאחר הזרקת STZ האחרונה של פקדים, DM וקבוצות STZ על מנת ליצור רקמות MM.
81 סנפירים מחדש לקטוע של כלל הקבוצות ברקמה שגדלה בין היום 51 ו 81 לבצע מחקר התחדשות. לחלופין לטפל בדגים / רקמות עם assay של ריבית.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).
  2. Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia. 50, 1523-1531 (2007).
  3. Ceriello, A., Ihnat, M. A., Thorpe, J. E. Clinical review 2: The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 94, 410-415 (2009).
  4. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N. Engl. J. Med. 329, 977-986 (1993).
  5. Turner, R. C., Cull, C. A., Frighi, V., Holman, R. R. Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. JAMA. 281, 2005-2012 (1999).
  6. Gaede, P. H., Jepsen, P. V., Larsen, J. N., Jensen, G. V., Parving, H. H., Pedersen, O. B. The Steno-2 study. Intensive multifactorial intervention reduces the occurrence of cardiovascular disease in patients with type 2. 165, 2658-2661 (2003).
  7. Holman, R. R., Paul, S. K., Bethel, M. A., Matthews, D. R., Neil, H. A. 10-year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 359, 1577-1589 (2008).
  8. Nathan, D. M., Cleary, P. A., et al. Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes. N. Engl. J. Med. 353, 2643-2653 (2005).
  9. Retinopathy and nephropathy in patients with type 1 diabetes four years after a trial of intensive therapy. The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. N. Engl. J. Med. 342, 381-389 (2000).
  10. Ismail-Beigi, F., Craven, T., et al. Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial. Lancet. 376, 419-430 (2010).
  11. Duckworth, W. C., McCarren, M., Abraira, C. Glucose control and cardiovascular complications: the VA Diabetes Trial. Diabetes Care. 24, 942-945 (2001).
  12. Skyler, J. S., Bergenstal, R., et al. Intensive glycemic control and the prevention of cardiovascular events: implications of the ACCORD, ADVANCE, and VA diabetes trials: a position statement of the American Diabetes Association and a scientific statement of the American College of Cardiology Foundation and the American Heart Association. Diabetes Care. 32, 187-192 (2009).
  13. Riddle, M. C. Effects of intensive glucose lowering in the management of patients with type 2 diabetes mellitus in the Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes (ACCORD) trial. Circulation. 122, 844-846 (2010).
  14. Patel, A., Macmahon, S., et al. Intensive blood glucose control and vascular outcomes in patients with type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 358, 2560-2572 (2008).
  15. Engerman, R. L., Kern, T. S. Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control. Diabetes. 36, 808-812 (1987).
  16. Hammes, H. P., Klinzing, I., Wiegand, S., Bretzel, R. G., Cohen, A. M., Federlin, K. Islet transplantation inhibits diabetic retinopathy in the sucrose-fed diabetic Cohen rat. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2092-2096 (1993).
  17. Kowluru, R. A. Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats. Diabetes. 52, 818-823 (2003).
  18. Kowluru, R. A., Chakrabarti, S., Chen, S. Re-institution of good metabolic control in diabetic rats and activation of caspase-3 and nuclear transcriptional factor (NF-kappaB) in the retina. Acta Diabetol. 41, 194-199 (2004).
  19. Roy, S., Sala, R., Cagliero, E., Lorenzi, M. Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose: phenomenon with a memory. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 404-408 (1990).
  20. Li, S. L., Reddy, M. A., et al. Enhanced proatherogenic responses in macrophages and vascular smooth muscle cells derived from diabetic db/db mice. Diabetes. 55, 2611-2619 (2006).
  21. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. (2012).
  22. Dolinoy, D. C., Jirtle, R. L. Environmental epigenomics in human health and disease. Environ. Mol. Mutagen. 49, 4-8 (2008).
  23. Morgan, D. K., Whitelaw, E. The case for transgenerational epigenetic inheritance in humans. Mamm. Genome. 19, 394-397 (2008).
  24. Ho, L., Crabtree, G. R. Chromatin remodelling during development. Nature. 463, 474-484 (2010).
  25. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  26. Jirtle, R. L., Sander, M., Barrett, J. C. Genomic imprinting and environmental disease susceptibility. Environ. Health Perspect. 108, 271-278 (2000).
  27. Blomen, V. A., Boonstra, J. Stable transmission of reversible modifications: maintenance of epigenetic information through the cell cycle. Cell Mol. Life Sci. (2010).
  28. Bogdanovic, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118, 549-565 (2009).
  29. Mosammaparast, N., Shi, Y. Reversal of histone methylation: biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases. Annu. Rev. Biochem. 79, 155-179 (2010).
  30. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  31. Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Beedle, A. S. Non-genomic transgenerational inheritance of disease risk. Bioessays. 29, 145-154 (2007).
  32. Bjornsson, H. T., Fallin, M. D., Feinberg, A. P. An integrated epigenetic and genetic approach to common human disease. Trends Genet. 20, 350-358 (2004).
  33. Whitelaw, N. C., Whitelaw, E. Transgenerational epigenetic inheritance in health and disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 273-279 (2008).
  34. Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetic mechanisms in diabetic vascular complications. Cardiovasc. Res. (2011).
  35. Villeneuve, L. M., Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetics: deciphering its role in diabetes and its chronic complications. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 38, 401-409 (2011).
  36. Pirola, L., Balcerczyk, A., Okabe, J., El-Osta, A. Epigenetic phenomena linked to diabetic complications. Nat. Rev. Endocrinol. 6, 665-675 (2010).
  37. Cooper, M. E., El-Osta, A. Epigenetics: mechanisms and implications for diabetic complications. Circ. Res. 107, 1403-1413 (2010).
  38. Intine, R. V., Sarras, M. P. Jr Metabolic Memory and Chronic Diabetes Complications: Potential Role for Epigenetic Mechanisms. Curr. Diab. Rep. (2012).
  39. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  40. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  41. Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31, 171-179 (2009).
  42. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  43. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb regeneration is impaired in an adult zebrafish model of diabetes mellitus. Wound. Repair Regen. 18, 532-542 (2010).
דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).More

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter