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Medicine

Un modello Zebrafish di diabete mellito e di memoria metabolica

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232

Summary

Memoria metabolica è il fenomeno per cui complicanze diabetiche persistono e progredire senza ostacoli anche dopo euglicemia si ottiene farmaceutico. Qui si descrive un modello di diabete mellito zebrafish che è unica in quanto permette di esame dei componenti mitoticamente trasmissibili epigenetiche di memoria metabolica

Abstract

Il diabete mellito colpisce attualmente 346 milioni gli individui e questo si prevede un aumento a 400 milioni entro il 2030. Le prove sia dal laboratorio e ampi studi clinici scala ha rivelato che il progresso complicazioni diabetiche senza impedimenti attraverso il fenomeno della memoria metabolica, anche quando il controllo glicemico è farmaceuticamente raggiunto. L'espressione genica può essere stabilmente alterata attraverso cambiamenti epigenetici che non solo permettono cellule e organismi di rispondere rapidamente alle mutevoli stimoli ambientali ma anche conferire la capacità della cella per "memorizzare" una volta che questi incontra lo stimolo viene rimosso. Come tale, i ruoli che questi meccanismi giocano nel fenomeno memoria metabolica sono attualmente allo studio.

Abbiamo recentemente riportato lo sviluppo di un modello di zebrafish di tipo I diabete mellito e caratterizzato questo modello per dimostrare che zebrafish diabetico non solo visualizzare le note complicazioni secondarie, tra cui i cambiamenti associaticon la retinopatia diabetica, la nefropatia diabetica e la guarigione delle ferite, ma anche esporre compromessa la rigenerazione pinna caudale. Questo modello è unico in quanto il pesce zebra è in grado di rigenerare il suo pancreas danneggiato e ripristinare uno stato euglicemico simile a quello che ci si aspetterebbe in pazienti umani post-trapianto. Inoltre, vari cicli di amputazione caudale consentire la separazione e lo studio di puri effetti epigenetici in un sistema in vivo senza potenziali complicazioni dal precedente stato diabetico. Anche se euglicemia si ottiene seguendo la rigenerazione del pancreas, la complicazione diabetica secondaria di rigenerazione pinna e la guarigione delle ferite della pelle persiste indefinitamente. Nel caso di rigenerazione fin alterata, questa patologia viene mantenuta anche dopo vari cicli di rigenerazione fin nei tessuti viene indicata l'esatta figlia. Queste osservazioni indicano un sottostante processo epigenetico esistente nello stato di memoria metabolica. Qui vi presentiamo i metodi necessari per successo generazionemoderata dei gruppi di memoria diabetici e metabolici di pesce e discutere i vantaggi di questo modello.

Introduction

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Il diabete mellito (DM) è un problema di salute grave e crescente che si traduce in riduzione dell'aspettativa di vita a causa di malattia microvascolare specifica (retinopatia, nefropatia, neuropatia, la guarigione delle ferite) e macrovascolari (malattie cardiache e ictus) complicazioni 1. Una volta avviato, complicanze del diabete continuare a progredire senza interruzioni, anche quando il controllo glicemico si ottiene 2,3 e questo fenomeno è stato chiamato memoria metabolica o l'effetto legacy. La presenza di questo fenomeno è stato riconosciuto clinicamente nei primi anni 1990 come "The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)" progredito e poiché è stata sostenuta da diversi studi clinici aggiuntivi 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Modelli animali di DM sono stati critici per le scoperte relative alla fisiopatologia delle complicanze del diabete e della memoria metabolica. Infatti, la persistenza di complicanze diabetiche è documentata in un modello canino di diabeticaretinopatia che da allora è stata sostenuta da diverse linee di evidenze sperimentali utilizzando una varietà di sistemi di coltura in vitro e su modelli animali 15,16,17,18,19,20,21. Questi studi mostrano chiaramente che un primo risultato iperglicemici periodo nelle anomalie permanenti (compresa l'espressione genica aberranti) di organi bersaglio / cellule e meccanicamente suggerisce il coinvolgimento del epigenoma.

Epigenomes costituiti da tutte le modificazioni della cromatina per un dato tipo di cellula e sono responsabili profilo unico gene di una cellula espressione. Le modifiche cromosomiche sono dinamiche durante lo sviluppo, differenziamento supporto cellulare, sono sensibili agli stimoli esterni, sono mitoticamente stabilmente ereditati 22,23 e può essere modificato in malattia 24,25,26. Questi meccanismi epigenetici includono: inviare traduzionali modificazioni degli istoni, non canonico inclusione variante dell'istone in octomers, i cambiamenti di accesso cromatina tramite metilazione del DNA e genicontrollo dell'espressione attraverso RNA non codificanti micro 27,28,29,30. Nel complesso, i processi epigenetici consentono alle cellule / organismi di rispondere rapidamente alle mutevoli stimoli ambientali 31,32,33, hanno anche la possibilità di conferire alla cellula di "memorizzare" questi incontri una volta lo stimolo viene rimosso 23,22. Pertanto, come alterati profili di espressione genica derivanti da processi epigenetici sono stabili in assenza di segnale (s) che li avviato e sono ereditarie attraverso la divisione cellulare, hanno guadagnato grande interesse come base dei meccanismi molecolari di patologie umane quali memoria metabolica. I risultati che stanno emergendo nel contesto di DM e dell'epigenetica progressi paralleli in altre malattie in quanto una pletora di modifiche epigenetiche indotte da iperglicemia causare notevoli cambiamenti persistenti nelle reti trascrizionali di cellule (recensione in 34,35,36,37,38).

Il pesce zebra è stato a lungo un organismo modello premier a study sviluppo dei vertebrati tuttavia negli ultimi 15 anni ha visto una crescita esponenziale nell'utilizzo questo organismo per lo studio delle malattie umane. 39. Zebrafish modelli di malattie umane sono state stabilite coprono una vasta gamma di patologie umane quali i disordini genetici e malattie acquisite 40,41,42. I molti vantaggi del pesce zebra su altri organismi modello vertebrati comprendono alta fecondità, tempo di generazione breve, la trasparenza attraverso la prima età adulta, le spese di alloggio ridotti e una serie di strumenti per la manipolazione genetica. Inoltre, a causa della conservazione estesa di percorsi genetici e della fisiologia cellulare tra i vertebrati e la capacità di eseguire elevate proiezioni di droga di throughput, il pesce zebra è stato utilizzato con successo per la scoperta farmaceutica.

Abbiamo sviluppato un modello di zebrafish adulto di tipo I diabete mellito con il farmaco diabetogeno, streptozocina. Abbiamo caratterizzato questo modello per dimostrare che zebrafish diabetico nont visualizzare solo le note complicazioni secondarie umani, ma in aggiunta, esporre rigenerazione compromissione dell'arto (rigenerazione caudale) come conseguenza dell'ambiente iperglicemici. Inoltre, abbiamo riportato che zebrafish iperglicemico tornare alla glicemia normale entro 2 settimane dalla rimozione del farmaco a causa di rigenerazione delle cellule beta pancreatiche endogene con conseguente stato glicemico fisiologicamente normale. Tuttavia, in contrasto, rigenerazione degli arti in questi pesci resta compromessa nella stessa misura come nello stato diabetico acuto indica tale complicanza persiste ed è suscettibile di memoria metabolica. L'impulso principale per la generazione di questo modello è di fornire un sistema per studiare le componenti mitoticamente stabili epigenetici che supportano il fenomeno metabolico memoria in assenza del rumore di fondo dell'ambiente iperglicemico precedente. Alla conclusione del protocollo fornito qui i tessuti e zebrafish o selettivi possono essere elaborati da qualsiasi saggio adatto al researchers bisogno. Abbiamo utilizzato con successo questa procedura per identificare i cambiamenti persistenti genoma nella metilazione del DNA indotte da iperglicemia che sono mantenuti nello stato di memoria metabolica 21.

Riteniamo che questo modello zebrafish di tipo I diabete mellito ha diversi vantaggi rispetto ai sistemi innovativi altri modelli per l'esame della memoria metabolica. 1) Tutti i nostri studi possono essere condotti in vivo e come il pesce iperglicemico precedente tornare euglicemia attraverso la rigenerazione della produzione di insulina endogena, non richiedono iniezioni di insulina esogena. Pertanto, questo evita i picchi e le valli complicanti controllo glicemico che possono verificarsi negli animali richiedono insulina esogena. 2) Come descritto sopra, la stimolazione sfondo dallo stato diabetico precedente (cioè la presenza continua di glicazione avanzata prodotti finali e specie di ossigeno reattive marcatori) sono eliminati e quindi si può esaminare l'puramente epigfattori enetic della memoria metabolica. 3) Gli esperimenti possono essere eseguiti rapidamente come ci vogliono circa 80 giorni dalla induzione di diabete fino al momento dell'analisi della memoria metabolica. 4) la rigenerazione pinna caudale è sperimentalmente molto accessibile e permette un facile manipolazione genetica e sperimentale per i quali ci sono una vasta gamma di strumenti. 5) rigenerazione Pinna caudale fornisce un metodo molto semplice e quantificabili per valutare la memoria metabolica e quindi permetterà la scoperta di farmaci futuro.

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Protocol

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Tutte le procedure vengono eseguite seguendo le indicazioni riportate in "Principi di cura degli animali da laboratorio" (National Institutes of pubblicazione Sanità n. 85-23, riveduta 1985) e approvato Rosalind Franklin per la cura degli animali dell'Università istituzionale e uso degli animali Comitato protocollo 08-19.

Ci sono 2 sigle importanti che vengono utilizzati in questo manoscritto. 1) DM: si riferisce a pesci che si trovano in una acuta (300 mg / dl) stato iperglicemico e sono stati per almeno 3 settimane. 2) MM: si riferisce al pesce che sono stati 21 giorni (vedi protocollo) pesce DM e ha permesso di ripristinare il controllo glicemico attraverso la rigenerazione del pancreas. Questo viene raggiunto entro (14) giorni dalla rimozione del farmaco. I pesci sono considerati pesci MM da questo punto in avanti. E 'anche importante notare che il pesce che sono indicati come controllo vengono trattati nello stesso come pesci DM o MM in termini di numero di iniezioni (soluzione salina solo), i tempi di incubazione a temperature diverse e il numero ei tempidelle amputazioni della pinna caudale.

1. Generazione di Zebrafish con diabete mellito, Pesce DM

  1. Preparare sia di recupero e serbatoi d'acqua anestetici. Il recupero è acqua pesci di acqua normale. Per l'acqua anestetico sufficiente aggiungere 2-fenossietanolo in modo che un 1:1000 diluizione in pesci di acqua normale è raggiunto.
  2. Preparare una soluzione di 0,3% (sotto cappa) di streptozocina (STZ) con l'aggiunta di 6 mg di STZ a 2 ml di cloruro di sodio 0,09% e collocare immediatamente la soluzione su ghiaccio. Ciò fornirà soluzione iniettabile sufficiente per l'iniezione di circa 20 pesci in 20 min. Se si supera il segno di 20 minuti, fermarsi, e fare una nuova soluzione STZ prima di procedere. In un altro soluzione aliquota tubo abbastanza salina per pesci di controllo. Una volta che il STZ viene solubilizzato tutti i passaggi successivi non richiedono l'uso dei fumi cappa.
  3. Riempire una siringa da cc ½ dotata di un ago calibro 27 1/2 con le soluzioni STZ o di controllo che garantiscano l'assenza di bolle d'aria intrappolate.
  4. AnestesiaTize ogni pesce individualmente mettendo il pesce in acqua anestesia, e attendere che il loro movimento nuoto cessa (1-2 min).
  5. Una volta brevemente anestetizzato luogo il pesce su un tovagliolo di carta per assorbire l'acqua in eccesso, collocare il pesce in peso dell'imbarcazione e misurare la massa del pesce.
  6. Mettere il pesce su una superficie stabile (coperchio scatola Petri) per iniezione.
  7. Iniettare la soluzione di controllo STZ o nella cavità peritoneale del pesce inserendo l'ago passato lo smusso nella faccia posteriore del peritoneo ventrale.
  8. 0,35 mg / g (350 mg / kg) di STZ dovrebbe essere consegnato a ciascun pesce e il volume della soluzione di 0,3% necessario può essere calcolato nel modo seguente.
    1. Moltiplicare massa di pesce (g) da 0,35 a produrre la quantità di STZ in mg richiesto.
    2. dividere il prodotto generato sopra del 3 per ottenere il volume della soluzione di 0,3% necessaria per iniezione in microlitri.
      Esempio: Per un pesce 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0,058 ml= 58 microlitri.
      Lo stesso volume senza STZ sarebbe iniettato per un pesce controllo. Un foglio per volumi da iniettare per massa pesci dovrebbero essere generati e utilizzati per una rapida consultazione.
  9. Dopo l'iniezione mettere il pesce nel serbatoio dell'acqua di recupero e il monitoraggio per l'attività di nuotare normalmente. Una volta che questo è stato raggiunto il pesce viene trasferito in un serbatoio vita normale che viene mantenuta alla temperatura minore di 22 ° C - 24 ° C. Questa temperatura ridotta è critico per l'induzione efficiente di iperglicemia (diabete mellito, DM).
  10. Sebbene l'iperglicemia viene rilevato entro 24 ore della prima iniezione, al fine di indurre uno stato di iperglicemia prolungata molto elevato il zebrafish richiedono una frequente fase di induzione iniezione seguita da iniezioni settimanali di manutenzione come mostrato di seguito.

Settimana 1: 3 iniezioni (giorno 1, 3, 5), Settimana 2: 1 iniezione (giorno 12), Settimana 3: 1 iniezione (giorno 19),
Settimana 4: (Giorno 21) Eseguiresaggio di interesse.

A questo punto il pesce zebra sono considerati di essere stato in un prolungato stato di iperglicemia e di esporre le complicanze del diabete di retinopatia, nefropatia e la rigenerazione della pinna anche compromessa. Questi sono indicati come pesci DM. Inoltre, se si desidera il pesce può essere mantenuta allo stato iperglicemico con iniezioni settimanali di manutenzione. Circa il 5% la morte nel corso di questo processo dovrebbe essere previsto.

2. Il prelievo di sangue e digiuno livello di glucosio nel sangue (FBGL) Determinazione

  1. Ogni gruppo di pesci DM e controllo deve essere composto di pesce sufficiente per determinare con precisione la FBGL media del gruppo in quanto questo test richiede questi pesci per essere sacrificato.
  2. Preparare una provetta PCR per ciascun campione di sangue contenente 5 ml di soluzione fisiologica sterile.
  3. Per la raccolta del sangue, anestetizzare i pesci come sopra, togliere tutta l'acqua, mettere il pesce su un vetrino da microscopio e con un bisturi, rimuovere la testa del pescealla base dell'opercolo.
  4. Raccogliere il sangue (fino a 2 microlitri) che viene rilasciato dal pesce sulla slitta e rapidamente aggiungere al 5 microlitri di soluzione salina normale pipettando su e giù per assicurarsi che il sangue non si intasa. Porre immediatamente il campione in ghiaccio.
  5. Determinare il volume del campione di sangue misurando il volume totale del liquido (soluzione salina + sangue) e sottraendo il 5 microlitri di soluzione salina.
  6. Trasferire 5 pl di sangue diluito da ogni provetta PCR in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml e determinare la concentrazione di glucosio nel sangue con il QuantiChrome Assay Kit glucosio. Questo viene eseguito seguendo il protocollo del produttore senza eccezione. Risultati attesi: normale / controllo di pesce 60 mg / dl e DM pesce 310 mg / dl.

3. Pinna caudale Rigenerazione Studi

  1. Anestetizzare i pesci come descritto nella 1,0-1,4.
  2. Mettete i pesci su un coperchio piastra di Petri e amputare la pinna caudale in linea retta utilizzando una dimensione sterile10 bisturi prossimale al primo punto lepidotrichia ramificazione durante la visualizzazione della pinna attraverso un microscopio da dissezione.
  3. Permettere il pesce di recuperare in 1,10 ma posizionare il pesce a 33 ° C per la fase di crescita e la rigenerazione del dosaggio. Questa è una temperatura stabilita per l'analisi accelerata rigenerazione pinna.
  4. Le alette possono essere ripreso in qualsiasi momento dopo amputazione tuttavia abbiamo routinariamente esaminare la crescita e la rigenerazione a 24, 28 e 72 ore dopo trans-sezione.
  5. Anestetizzare i pesci come prima (vedi 1,0-1,4), posizionare il pesce sotto un microscopio da dissezione dotato di una fotocamera (si usa una Nikon SMZ-1500 dotato di un Q-imaging telecamera) e raccogliere tutte le immagini finali con ingrandimento 1X con il software NIS elementi . La pinna deve essere diffuso per l'imaging in modo che sia completamente esteso senza tirare o danneggiare il tessuto e deve essere esente da eventuali gocce d'acqua. Per motivi di coerenza è necessario posizionare il lato dorsale a destra.
  6. Stampa di immagini e misurare la GRO rigenerativaArea wth utilizzando software Image J e l'uso di un foglio da disegno. Tracciare tutta la zona di nuova crescita e determinare l'area. Ogni misurazione deve essere eseguita cinque volte e una media per garantire la precisione di tracciamento. È importante che le immagini utilizzate non hanno ombre o d'acqua da questi errori nella misurazione della superficie outgrowth.
  7. Misurare la lunghezza del sito amputazione lungo l'asse dorso-ventrale e dividere la superficie determinata in 3,6 da questa misura. Questo permette pesci di diverse dimensioni per essere confrontati direttamente.

4. Generazione di memoria metabolica (MM) Zebrafish

  1. Avviare un gruppo di pesci DM e dei loro controlli appropriati come descritto al punto 1.
  2. A 21 giorni per determinare la FBGL un sottoinsieme del gruppo e dividere il pesce DM in 2 sottogruppi. Continua settimanale STZ iniezioni per uno dei gruppi come controlli DM per la durata dell'esperimento. Cessate iniezione STZ per il secondo gruppo e incubate il pesce a temperatura normale. Entro 14 giorni questi zebrafish ripristinerà il normale insulina nel sangue e il controllo del glucosio attraverso la rigenerazione del pancreas. Questi pesci sono ora chiamati MM (pesce memoria metabolica).
  3. Al 30 ° giorno dopo la rimozione del farmaco amputare le pinne caudali di controllo, DM e MM pesce tramite il metodo descritto al punto 3.2.
  4. Ritorno pesce alle condizioni dell'acqua normali per la rigenerazione pinna per 30 giorni. Questo permette la crescita di ciò che chiamiamo, tessuto della memoria metabolica.
  5. Al giorno 60 eseguire una seconda amputazione (come descritto in 3.2) all'interno del tessuto che è stato rigenerato nel periodo 30-60 giorni ed eseguire la rigenerazione pinna caudale dosaggio (3,1-3,7) Figura 1.
  6. Isolare tessuto ed eseguire analisi di interesse. Vedi Tabella 1 per una sintesi protocollo.

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Representative Results

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Diabetico di tipo I zebrafish non solo visualizzare le complicazioni note secondarie di retinopatia e nefropatia, ma anche, mostrano un ulteriore complicazione: ridotta rigenerazione pinna caudale. Questa complicanza in seguito persiste a causa della memoria metabolica nei pesci che hanno ripristinato il controllo normale di glucosio dopo un periodo di iperglicemia. In Figura 2A (controllo) e Figura 2B (memoria metabolica) immagini rappresentative di pinne rigenerazione catturate a 72 ore post-amputazione sono presentati. Il deficit può essere quantificata e come mostrato in Figura 2C DM e MM zebrafish presentano un deficit di circa 40% a 72 ore rispetto ai controlli pesci. Sebbene i dati inclusi in Figura 2C termina a 90 giorni questa insufficienza stesso è stato osservato lontano come 150 giorni.

Tabella 1. Protocollo Riepilogo.

Figura 1
Figura 1. Vignetta raffigurante siti amputazione per esperimenti memoria metabolica. Il colore blu rappresenta il tessuto che è stato esposto allo stato iperglicemico precedente. Il colore verde indica il tessuto che è stato coltivato 30-60 dopo iperglicemia giorni. La linea nera tratteggiata indica il sito di amputazione prima volta al 30 ° giorno e il rosso indica un potenziale sito di amputazione che si verificherebbe a 60 giorni.

Figura 2
Figura 2. Rigenerazione pinna caudale è ridotta nei pazienti diabetici (DM) e memoria metabolica (MM) Zebrafish. A. Una immagine rappresentativa pinna caudale da un controllo iniettato pesci che presentano una quantità normale di regenerative crescita 72 ore dopo l'amputazione. La linea bianca tratteggiata rappresenta il piano di amputazione e la linea rosa solido demarks la conseguenza rigenerativa. La quantità di rigenerazione è determinato tracciando l'area contenuta all'interno delle linee rosa e bianco diviso per la lunghezza della linea bianca per normalizzare le differenze dimensioni finali. B. Una immagine rappresentativa caudale sia da DM o MM illustrante una quantità ridotta di crescita rigenerativa 72 ore dopo l'amputazione. Le linee e le misure dell'area sono le stesse di presentazione del pannello A. C. grafica del tasso di rigenerazione relativo di zebrafish DM e MM rispetto ai controlli. La percentuale relativa (ai controlli di cui al 100%) di DM e MM conseguenza zebrafish rigenerante a 72 ore viene visualizzato. Il tempo in giorni raffigurati è relativo a quando STZ somministrazione è stata interrotta per il gruppo memoria metabolica. Questi dati dove generano da diversi ricercatori e di integrare oltre 1.000 pesci per gruppo. <strong> Figura 2A e 2B Figura sono stati adattati con il permesso di Olsen et al 43.

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Discussion

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Il diabete mellito è una malattia di alterazioni metaboliche, inizialmente diagnosticati come l'iperglicemia, che in ultima analisi, i danni dei vasi sanguigni che porta a molte complicazioni che tutti persistono anche dopo euglicemia è ottenuta mediante intervento farmaceutico. Tale persistenza di complicazioni è chiamata memoria metabolica e diversi studi recenti hanno esaminato il ruolo che meccanismi epigenetici svolgere in questo fenomeno. Qui abbiamo descritto un protocollo che permette la generazione di entrambe diabetica acuta e memoria metabolica (controllo glicemico restaurata) zebrafish. Abbiamo descritto la metodologia che può essere impiegato per separare contributi epigenetici dai componenti potenzialmente complicando dello stato diabetico precedente. Teniamo a sottolineare che i pesci possono essere verificate in ogni punto con qualsiasi dosaggio di interesse per il ricercatore particolare e quindi le applicazioni a valle per la scoperta futuro sono infinite.

There sono diversi passaggi del protocollo che meritano un po 'di ulteriore discussione e l'enfasi. Nella nostra esperienza la STZ 0,3% in soluzione si deteriora e perde la sua efficacia dopo circa 20 minuti. Pertanto suggeriamo che un timer da utilizzare e una soluzione fresca essere effettuata ad intervalli di 20 minuti. Durante i nostri primi tentativi di generare zebrafish diabetica eravamo solo utilizzando uno di iniezione durante la prima settimana e hanno avuto successo con circa il 40% dei pesci. Come tale, non è un requisito rigoroso per tre iniezioni, tuttavia, quando vengono eseguite tre il tasso di successo superiore al 95%. In secondo luogo, quando si inietta STZ nel zebrafish è importante che l'ago è inserito in modo tale che la smussatura dell'ago è completamente all'interno del pesce per consentire l'erogazione corretta della soluzione, tuttavia, bisogna fare attenzione che non penetri troppo per evitare danni interni. Una volta che la soluzione STZ o il controllo viene somministrato il pesce vengono incubate a una temperatura ridotta (22 ° C - 24 & dad esempio, C). Non possiamo più di sottolineare l'importanza della temperatura ridotta, senza di esso il pesce zebra di rigenerare le cellule beta (STZ iniettata) e iperglicemia non può essere efficacemente indotto. Infine, nel nostro zebrafish sangue coagula mani molto rapidamente che impedisce l'azione necessaria capillare necessaria per l'utilizzo glucometro efficiente e quindi noi non sosteniamo il loro uso. Abbiamo trovato che il saggio QuantiChrome descritto non è solo il più affidabile, ma la più facile da eseguire e per insegnare personale di laboratorio. Collettivamente le tecniche descritte nel protocollo non sono difficili e se le dovute precauzioni sono prese con i passi descritti sopra la generazione di zebrafish diabetica è quasi assicurato.

Ci sono limitazioni molto pochi all'interno della procedura descritta in questo manoscritto, per quanto tutti i modelli di malattia indotta da farmaci sempre la critica degli effetti fuori bersaglio mosse contro di loro. Rimandiamo il lettore al nostro detailin manoscritto inizialeg questo modello come abbiamo fornito 5 linee indipendenti di prove (tra cui l'iniezione diretta STZ in pinne) documentano che non ci sono effetti di destinazione fuori della STZ 43. Un'altra potenziale limitazione non proviene dalla stessa procedura, ma dal fatto che i reagenti per la ricerca zebrafish non sono ancora al livello di altri organismi modello come topi. Fortunatamente, come il pesce zebra è sempre più utilizzato come organismo modello per le malattie umane questa carenza viene rapidamente rimedio.

In sintesi, come descritto nell'introduzione, il modello zebrafish di diabete mellito qui descritto presenta diversi vantaggi rispetto ad altri organismi modello. Importante, permette per l'esame dei componenti puramente epigenetici che supportano il fenomeno metabolico memoria. Poiché si prevede che 400 milioni di persone sarà afflitto da questo disturbo riteniamo che il contributo da studi che utilizzano questo modello potrebbe avere un impatto significativo sulla salute umana.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio dalla Fondazione Famiglia Iacocca, Rosalind Franklin University di start-up dei fondi, e la National Institutes of Health di Grant DK092721 (a RVI). Gli autori desiderano ringraziare Nikki Intine di aiuto nella preparazione del manoscritto.

Materials

GIORNO PROCEDURA
1
3 DM = STZ di iniezione (350 mg / dl), di controllo = iniezione di soluzione salina
5 DM = STZ di iniezione (350 mg / dl), di controllo = iniezione di soluzione salina
12 DM = STZ di iniezione (350 mg / dl), di controllo = iniezione di soluzione salina
19 DM = STZ di iniezione (350 mg / dl), di controllo = iniezione di soluzione salina
21 O eseguire test di interesse per i pesci DM o procedere a fare gruppi di MM per asportazione di pressione STZ.
51 Amputare Fins 30 giorni dopo l'ultima iniezione di STZ controlli, DM e gruppi STZ, al fine di generare tessuto MM.
81 Re-amputare pinne di tutti i gruppi nel tessuto che è stato coltivato tra il giorno 51 e 81 per effettuare uno studio di rigenerazione. In alternativa, il trattamento di pesce / tessuto con il saggio di interesse.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un modello Zebrafish di diabete mellito e di memoria metabolica
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Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).More

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

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