Summary
Denna video demonstrerar de förfaranden som används för att odla primära kulturer av embryonala
Abstract
Mycket information om koppling av presynaptiska jonströmmar med lanseringen av signalsubstansen har erhållits från ryggradslösa preparat, främst bläckfisk jätten synaps 1. Men med undantag för framställning som beskrivs här, några ryggradsdjur beredningar existerar, i vilket det är möjligt att göra samtidiga mätningar av neurotransmittorfrisättning och presynaptiska jonströmmar. Embryonala Xenopus motoneuroner och muskelceller kan odlas tillsammans i enkla odlingsmedium i rumstemperatur, de kommer att bilda funktionella synapser inom 12-24 timmar och kan användas för att studera nerv-och muskelceller utveckling och synaptiska interaktioner i flera dagar (tills överväxt sker). Några fördelar med dessa samkulturer över andra ryggradsdjur preparat inkluderar enkelhet beredningen, möjligheten att bibehålla kulturer och arbete vid rumstemperatur, och den färdiga tillgängligheten av synapserna bildade 2-4. Beredningen har används i stor utsträckning för att studera de biofysiska egenskaperna hos presynaptiska jonkanaler och reglering av transmittorfrisättning 5-8. Dessutom har beredningen lånat sig till annan användning, inklusive studier av neuritutväxt och synaptogenes 9-12, molekylära mekanismer neurotransmitterfrisättning 13-15, roll diffunderbara budbärare i neuromodulering 16,17, och in vitro synaptisk plasticitet 18 - 19.
Protocol
1. Pre-experimentell beredning
- Bered följande lösningar (se tabell 1 för kompositioner): (a) 1 liters NFR (normal Frog Ringer), (b) 100 ml 10% saltlösning, (c) 100 ml CMF (Ca 2 + / Mg 2 +-fri lösning ), (d) 1 ml ITS (insulin-transferrin-Selen, Sigma I1884), (e) 100 ml L-15-odlingsmedium, (f) 10 ml HCG (humant koriongonadotropin Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-intern lösning, (h) 100 ml K +-intern lösning för amfotericin B. osmotiska styrka lösning 1 bör kontrolleras för att säkerställa att den är ungefär 260 mOsM med en ångtrycksosmometer (t.ex. Wescor modell # 5100C) .
- Filtersterilisera lösningar (b) och (c). Lösningar (a) (b) och (c) kan lagras upp till tre månader vid 4 ° C. Bered (d) genom att tillsätta 1 ml avjoniserat H 2 O till injektionsflaskan med frystorkat pulver via en 25 gauge injektionsnål och spruta filter. Denna slutliga lösning Cen lagras vid 4 ° C under 30 dagar.
- Bered (e) i ett dragskåp med laminärt flöde genom att kombinera samtliga komponenter i en bägare eller kolv. Filtersterilisera den slutliga lösningen och överför 10 ml alikvoter i sterila centrifugrör. Förvara vid -20 ° C.
- Förbered HCG (lösning (f)) genom att tillsätta 10 ml avjoniserat H 2 0 till injektionsflaskan med frystorkat pulver via en 25 gauge injektionsnål och spruta filter. Denna slutliga lösning kan förvaras vid 4 ° C under 30 dagar.
- Tillverka minst två mikrodissektion verktyg genom limning en Minutien stift (26.002-10, Fine Science Tools) i slutet av ett glas pasteurpipett med cyanoakrylatlim. Låt den vassa änden av stiftet att sträcka sig förbi änden av pipetten approximativt 0,5 cm.
- Två dagar innan förbereda kulturer, inducerar avel med följande procedur. Identifiera en avel-ready par Xenopus genom att observera en framträdande rödaktig kloak på honan och mörk pigmentering på den plana Surface av de främre tassarna av det manliga. En i taget, netto varje groda och håll den ventrala sidan nedåt på ett handfat med nätet så att den inte kan fly. Injicera 1 ml lösning (f) genom nätet och subkutant i en av de dorsala lymfan säckar.
- Placera avelspar tillsammans i en täckt tio liters tank med vatten. För att säkerställa att djuren inte kommer trampa de nyligen som och befruktade ägg, installera en skärmad golv med en maskstorlek på ca ½ "monterade cirka 1-2 inches ovanför botten av tanken (Figur 1A).
- Låt grodor orörd under 12-48 timmar tills djuren är i amplexus och befruktade ägg observeras på golvet nedanför skärmen (Figur 1B).
- Ta bort djuren från tanken, men lämna äggen ostörda i minst 24 timmar längre. Detta par av grodor kan återanvändas uppfödda efter sex veckor.
- Lossa embryon från botten av tanken och överföra dem till fyra eller fem 60x15 mm kulture rätter innehållande 10% saltlösning (lösning B). Sortera embryon genom steg enligt schemat i Niewkoop och Faber (ref. 20). Användbara embryon kommer att vara de i steg 22-24. Figur 2A visar ett embryo på ungefär steg 22, medan Figur 2B visar ett embryo som är för långt fram i utvecklingen för att vara användbar (ungefär steg 28). Det är viktigt att välja embryon som är hälsosamma: de som är jämn i utseende med ljusbrun och vit marmorering är idealiska. Embryon som har stora svarta eller vita fläckar är i allmänhet ohälsosamma och oanvändbar.
2. Mikrodissektion av Xenopus embryon
- Inuti ett laminärt flöde huva, etikett och fyll ungefär halvvägs tre 60x15 mm sterila odlingsplattor med 10% saltlösning, och ett med CMF.
- Med hjälp av en steril, glas pasteurpipett överföring 09:55 steg 22-24 embryon i en av skålar innehållande 10% salin. Med hjälp av en stereo zoom dissekeraning mikroskop inuti huven (0,6-5x med 10 x okular), ta bort gelé päls och vitellinmembranet från varje embryo med två par av sterila # 5 pincett (11.251-30, Fine Science Tools). (Se figurerna 3A och 3B.)
- Tvätta de nakna embryon genom passerar dem, en i taget, genom de återstående två skålar med 10% saltlösning och slutligen in i skålen som innehåller CMF. Använd en ny, steril pipett för varje överföring och minimera volymen av lösning överförs från skålen till skålen.
- I sin tur håller varje embryo försiktigt men bestämt med en pincett och använd mikrodissektion verktyget formas i steg 1,5, bort neuralröret och associerade myotomes vilka är belägna på den mest dorsala aspekten av djuret. Gör detta genom att göra tre skivor, en i vardera änden av platsen för neuralrörsdefekter och en tredje bara ventralt till det (Figur 4A). Flytta varje dissekerade neuralröret / myotome till en ren del av skålen från äggula granules och annat skräp (figur 4B). Den dorsala-ventrala axeln, och placeringen av det neurala röret och myotomes anges i figur 4.
- Efter cirka femton minuter i denna lösning (CMF) använder pincett för att lyfta pigmenterad hud fri från dissekerade vävnaden och kasta. Efter ytterligare 30-60 min, kommer cellerna bildar en "sand högen" när de blir dissocieras från varandra (figur 4C).
3. Beredning av Nerve-muskel samkulturer
- Tina en 10 ml rör odlingsmedium och tillsätt aseptiskt 70 pl ITS och 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795).
- Etikett och fylla sterila 35 mm odlingsskålar (FD35-100 World precisionsinstrument) ungefär halvvägs med L-15 odlingsmedium (lösning (e)), en för varje dissekeras embryot.
- Framställ en plätering pipett genom att gripa varje ände av en glas pasteurpipett medan du håller den avsmalnande delen över en låga. Dra ändarna isär till ca 10 cm och sedan bryta av änden för att ge en spets på ca 0,2 mm.
- Använd bordläggningen pipetten att suga upp "sanden högen" från ett embryo minimerar mängden lösning dras. Driva ut cellerna på botten av en odlingsskål. Platta cellerna i flera rader. Observera pläterade odifferentierade celler (figur 5A och 5B).
- Lämna rätter pläterade celler ostörda i minst femton minuter så att cellerna tid att fästa skålen.
4. Patch Spännverktyg Nerve-muskel Synapser
- Efter 12-24 timmar i kultur, pläterade celler tar på olika morfologiska egenskaper: muskelceller blir spolformad och spinal nervceller sträcker långa processer (Figur 6). Funktionell synaptisk kontakt mellan neurit varicosities och muskelceller kan bekräftas med samtidig parade elektrofysiologiska inspelningar. "M", "S" och "V" avser respektive muskelcellen, neuronalsoma och presynaptiska varicosity.
- Förbered två lappelektroder för inspelning: en för presynaptiska varicosity och en för muskelcellen.
- För det presynaptiska elektroden, förbereda en amfotericin-innehållande lösning enligt följande: Tillsätt 100 ul DMSO till en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 5 mg amfotericin B (Sigma A4888). Vortexa denna lösning under 10 sekunder. Lägg sedan 10 pl av denna lösning till en andra mikrocentrifugrör som innehåller 625 pl K +-intern lösning för amfotericin B (lösning (h)). Virvel som ovan.
- Fyll presynaptiska elektroden med amfotericin-innehållande K +-intern lösning framställd i steg 4,3 och den postsynaptiska elektrod med K +-intern lösning (lösning (g)).
- Byt media i kultur skålen med NFR och flytta den till ett inverterat mikroskop utrustat med faskontrastoptik.
- Placera båda elektroderna strax ovanför sina respektive mål. Skaffa hel-cell-samarbetenfiguration med muskelcellen elektroden innan den perforerade patch konfiguration med åderbråck elektroden.
- För att bekräfta funktionalitet synapsen, depolarisera varicosity med en patch clamp förstärkare (t.ex. Axopatch 200B, Molecular Devices) under mjukvara kontroll (t.ex. genom pCLAMP 9, Molecular Devices) och observera de samtidiga presynaptiska och postsynaptiska strömmar. Figur 7 visar sett strömmarna som svar på depolariserande steg spänningen som ges till det presynaptiska varicosity i 10 mV steg från -30 mV till +40 mV. För aktiv strömmar ses i presynaptiska cellen bärs av Na + och Ca 2 + och de yttre strömmar genom K +. Strömmar som registrerats i den postsynaptiska cellen är svar på signalsubstans frigörs från åderbråck och bärs mest av Na + via nikotin kanaler acetylkolinreceptorn.
Representative Results
Figur 4B visar den dorsala vy av en isolerad ryggmärg / myotome omedelbart efter dess avlägsnande från ett steg 22 Xenopus embryo. Figur 4C visar att, efter avlägsnande huden och inkubation i Ca 2 +-Mg 2 +-fri lösning (CMF, lösning ( c)), celler dissocierar till en "sand högen" och är redo för plätering. Omedelbart efter plätering i celler odlingsmediet uppvisar liten morfologiska variabilitet (Figur 5B) men ta olika former efter 24 timmar i kultur. Muskelceller blir spolformad medan nervceller fortfarande sfäriska samtidigt sträcker neuriter som utarbeta varicosites på synapser med muskelceller (Figur 6). Samtidig parade patch inspelning från presynaptiska varicosity och postsynaptiska muskelceller (Figur 7) visar de presynaptiska inre och yttre strömmar i samband med lanseringen av signalsubstansen och resultant excitatorisk postsynaptiska strömmar.
Figur 1 A:.. Avelspar av grodor i parning hink ovanpå skärmen B: Grodor i amplexus med befruktade ägg.
Figur 2 A:.. "Lämplig" steg 22 embryo B: "olämpliga" steg 28 embryo. Skala stapel representerar 1 mm.
Figur 3 A:. Steg 22 embryot före avlägsnande av vitellinmembranet och gelé päls. Pilen pekar på den yttre kanten av gelé pälsen. Vitellinmembranet vidhäftar tätt till EMBRyo och är praktiskt taget osynlig B:. Bare embryo. Skala stapel representerar 1 mm.
Figur 4 A: Steg 22 embryo med en streckad linje indikerar till-dissekeras delen B:.. Akut isolerade dorsala delen av embryo, "d" och "v" avser de dorsala och ventrala delar av embryona, medan "m" och "n" indikerar de ungefärliga lägena för mytomes och neurala röret C:. "Sand högen" av celler efter 60 minuter i CMF. Skala bar är 1 mm för A och 0,5 mm för B och C.
Figur 5 A:. 5x effekt vy av celler i odling omedelbart efter plätering. B: Samma kultur på 40x. Skalastapel representerar 40 pm för A och 5 pm för B.
Figur 6. Neuromuskulär i kultur med identifiering av neuronal soma (S), presynaptiska varicosity (V) och postsynaptiska muskelceller (M). Skala bar: 5 pm.
Figur 7. Presynaptiska (överst) och postsynaptiska (underst) strömmar ses som svar på applicering av 10 mV inkrementell spänningssteg presenteras för presynaptiska varicosity från -30 mV till +40 mV. Spänningssteg indikeras intill några av de presynaptiska spåren. Den hållpotential för båda cellerna var -70 mV.
Discussion
Viktiga steg i den framgångsrika samodling av motoneuroner och muskelceller är användningen av lämpligt arrangerade embryon framställda av den inducerade uppfödning av Xenopus grodor och försiktig aseptisk dissektion av odifferentierade spinala neuron och myoblaster. Befruktade ägg bör lämnas orörd tills de når ungefär steg 10 eller så flytta dem förr ofta stoppar deras utveckling. Friska embryon identifieras av ett jämnt utseende och en brun och vit melerad färg. Etapp 22-24 embryon är de mest användbara eftersom detta är den punkt under utveckling strax efter neuralrörsdefekter stänger och innan myocyter har differentierat betydligt. Dessutom celler från äldre embryon inte skilja bra i CMF. Försiktighet bör iakttas vid demontering av vitellinmembranet som fäster starkt till embryot. Membranet ska slitas sönder med vassa tänger så att embryot framträder intakt. En annan viktig precaution är att noggrant placera cellerna på botten av odlingsskålen (snarare än att låta dem sedimentera där). Denna metod är att föredra eftersom detta ökar sannolikheten för att cellerna skall häfta vid odlingsskålen.
Funktionell neurotransmission mellan nerv och muskel kan bestämmas med bara postsynaptiska inspelning och ofta kan fastställas genom observation av spontan muskelsammandragning efter innervation. Un-innerverade muskelceller inte rycka inte kultur. Postsynaptiska inspelning ensam är användbart för inspelning miniatyr gavel strömmar eller potentialer men mätningar av framkallade utsläpp kräver presynaptisk stimulering och korrelation av pre-och postsynaptiska strömmar kräver dubbel patch-clamp.
Förutom parade patch inspelning som beskrivs här, erbjuder detta preparat möjlighet att införa tredjedel pipett på den neuronala soma 5 Detta tillåter alstring av en aktionspotential THAt kan propagera till den presynaptiska åderbråck och leda till frisättning av signalsubstans. Dessutom, kan förmodade medel som tros förmedla eller modulera synaptisk överföring kan införas på endera sidan av den synaps: via muskelcellen pipetten eller genom diffusion från en tredje pipett placeras i soma.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Finansierat av NSF (0.854.551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
| Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
Table 1. |
|||||||||||||||||
References
- Augustine, G. J., Eckert, R. Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse. J. Physiol. 346, 257-271 (1984).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).
- Weldon, P. R., Cohen, M. W. Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system. J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).
- Tabti, N., Poo, M. -M. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. 137-153 (1991).
- Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J. Neurosci. 17, 2990 (1997).
- DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction. J. Neurosci. 19, 7846 (1999).
- Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels. Nat. Neurosci. 3, 566 (2000).
- Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction. J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).
- Xie, S. P., Poo, M. M. Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069 (1986).
- Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target. Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).
- Feng, Z., Ko, C. P. Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1. J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).
- Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones. Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).
- Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions. Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).
- Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse. Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).
- Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).
- Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture. J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).
- Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis. J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).
- Dan, Y., Poo, M. M. Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro. Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).
- Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).
- Niewkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland, Amsterdam. (1967).
