Summary
整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。
Abstract
高度な心不全は、生存および/または完全に機能する心筋細胞の損失から生じる、主要な臨床上の満たされていない課題である。最適な薬物療法にもかかわらず、心不全は、先進国における死亡率と罹患率の主要な原因を表しています。医薬品開発における主要な課題は正確にin vitroでの正常および病的な人間の心筋の生理学を再現細胞アッセイの識別である。同様に、回生心臓生物学における主要な課題は、臨床的に関連する量で患者固有心筋前駆細胞の同定および単離を中心に展開。これらの細胞は、ネイティブ心臓組織構造に似ている機能的な組織に組み込まれなければならない。マイクロコンタクトプリントは、このように空間的に細胞接着を制御するために幾何学的な手がかりを提供して、心臓の構造組織に似ている正確なマイクロパターンタンパク質形状の作成 が可能になります。ここに我々は非常にin vitroで 、細胞外マトリックスタンパク質とマイクロパターン化細胞成長表面の生成、および異方性の心筋組織への幹細胞由来の心筋細胞の集合体で分化する多能性幹細胞から心筋細胞を精製単離するための我々のアプローチについて説明します。
Introduction
薬物療法における最近の進歩にもかかわらず、高度な心不全は、先進国における死亡率と罹患率の主要な原因のままです。臨床症状は、機能心筋組織の損失および罹患した個体の代謝要求を満たすために、心不全のその後不能から生じる。心臓が限られた再生能力を持っているので、自家心臓移植は、直接失わ機能的な心臓組織を補充を目的とした、現在臨床的に認められ治療法です。ドナー心臓および長期免疫抑制療法の必要性の限られた数を含む、心臓移植の重大な欠点は、この治療法の普及の使用を排除する。その結果、薬物療法では、心疾患患者の治療の主力となっている。医薬品開発における主要な課題は正確にin vitroで正常と病的心筋の生理を繰り返す細胞アッセイの識別である。
幹細胞生物学と組織工学技術の最近の収束は、心臓再生のための新しい有望な道を発生させます。再生可能な患者固有のソースから機能的な心筋組織を生成すると、フィールド内の主要な進歩であろう。これは、医薬品開発と発見のための疾患特異的な細胞アッセイの開発が可能になると心臓の再生医療のための基礎を築くだろう。ヒト胚性幹細胞（ES細胞）と、もっと重要なのは、人間の人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、心室前駆細胞および成熟した心室筋細胞の潜在的に再生可能な患者固有のソースを表します。幹細胞生物学と組織工学戦略の組み合わせでは、創薬のためか、進行した心不全の治療のための心臓再生のアプローチにおける細胞アッセイの開発に使用することができるin vitroで機能的な心臓組織を生成することで、この問題に対処しています。
_content ">心臓再生における中心的な課題は、最適な細胞タイプの同定されています。様々なソースから異なる多能性心臓前駆体が発見されているものの、細胞の広い配列が、しかし、今日まで、細胞の識別を1に研究されているこのような筋原細胞の運命へのコミットメントなどの重要な要件を満たしているソースは、機能的な心筋組織へのin vivoまたは in vitroおよび組成の展開する能力を維持することは、中心的な問題であることが証明された2。我々は以前に二重トランスジェニックマウス系を記載しているそれは非常にin vitroで分化したES細胞から、コミットされた心室性前駆細胞の集団（CVP）を精製単離を可能にします私たちはMEF2C遺伝子のISL1依存エンハンサーの制御下のDsRed赤色蛍光タンパク質を発現する新規な二重トランスジェニックマウスを作製し、の制御下で増強された緑色蛍光タンパク質心臓特異的エンハンサーNkx2.5。この2色の蛍光レポーターシステム、MEF2CとNkx2.5遺伝子の発現に応じて蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて単離することができる開発ES細胞からの第一及び第二の心臓フィールド前駆細胞に基づく。 CVPは、心臓組織の再生を目的とした偉大な約束を提供しています何の心筋マーカーとの構造的および機能的な資質3の発現パターンに基づいて、心筋細胞に似ている。組織工学の分野における多くの進歩があったが、ネイティブの細胞構造を模倣することは重要な課題として残されている。この課題に対処するための従来の方法は 、in vitro での細胞と播種生物学的または合成足場が含まれています。急速な分解、限られた物理的および機械的安定性と低細胞密度1,4,5含む足場、の多くの欠点のために、我々は足場のない組織を設計しようとしました。 Altキーハフ心臓の細胞が細胞外マトリックスタンパク質の分泌によってそれらの局所微小環境を変更することができ、それらは細胞外手がかりがない状態で棒状の心筋細胞に自分自身を整理するための、より限られた能力を持っている。このように、機能的な心筋組織を構成する細胞は、適切な空間および生物学的な手がかりを提供するテンプレートが必要です。マイクロコンタクトプリントは、正確に位置合わせ機能心筋組織の生成のために重要であるすべては細胞の形状、組織、機能6-8を 、制御するための簡単かつ安価な手法を提供することにより、この課題に対応します。それは正確なパターンで、PDMS基板上に細胞外マトリックスタンパク質の沈着を有効にしてこのように空間的に細胞接着に影響を与えることが2μm9に至るまで、機能·サイズの微小構造のポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプの使用を含む。
ここで、我々は、幹CELで組織生体工学技術を組み合わせることを提案するlは生物学異方性、機能心筋組織を生成する。したがって、我々はここで、次のための私達の最近出版されたアプローチを示す：（1）境界の心筋組織のためのテンプレートを生成するためのマイクロコンタクトプリンティングによるPDMS基板上にマイクロパターンタンパク質表面の生成（2）高から心臓前駆細胞の精製分離ES細胞は 、in vitro で分化、および（3）の両方の技術の組み合わせは、整列機能的な心筋組織を生成する。
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Protocol
整列機能心筋組織を生成するためのプロトコルは、大きく3つの部分に分けることができます。ソフトリソグラフィ技術を用いてマイクロパターンマスタの製造は、次のプロトコルの一部とは見なされませんが、確立された方法6に基づいて行うことができる。
1。 PDMS基板上にフィブロネクチンのマイクロコンタクトプリンティング
- ミックスシルガード10時01分硬化剤の比率をベースと脱ガス気泡を除去するためにデシケーターを使用して、アセンブリで184（ダウコーニング）のPDMSエラストマー。
- 20μm幅と室温または65℃で4時間で2日間のどちらかに20μmの間隔で区切られた2μmの背尾根、°Cが微小構造のPDMSスタンプを取得すると以前に製造されたマスターに対してPDMSを硬化させる。
*デシケーター中で硬化は非常に任意の気泡を除去することをお勧めします。
- ガラスカバースリップ（ 例えば上にスピンコートPDMS15μmの厚さであっても薄いとPDMS基板を製造するために車間スピンコーターを用いて2分間5,000 rpmで22x22のmm）です。
- 埃や汚れの粒子を除去するために、70％エタノールでスタンプをきれいにしてください。空気が乾燥してみましょう。
*スタンプが複数回使用することができますが、定期的にPDMSスタンプを更新する時間をかけて表面の摩耗により推奨されます。
- 275ミリトルで1分間、SPIプラズマPrep IIプラズマクリーナーとプロセスに置きスタンプはPDMSの表面が親水性にする。
*酸素プラズマ処理は監視すべきである。長い治療時間は、エラストマーの割れが発生することがあります。
- 1分間、70％エタノールでスタンプを滅菌する。圧縮空気で素早く乾燥。
*さらなるステップは、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネットで行うべきです。
- Fでスタンプ表面を覆うibronectin液（蒸留H 2 O中の50μg/ ml）を。それが吸着する少なくとも10分してみましょう。
- スタンプからフィブロネクチンソリューションを振り払うと圧縮空気で素早く乾燥。
- 2分間スタンプおよびPDMS基板間の等角接触を確立し、しっかりと押してください。
- 蒸留H 2 Oでマイクロパターン基板をすすぐ最初に使用しない限り、4℃で2週間の最大のddH 2 O中で保管してください。蒸留H 2 OのストアPDMSスタンプ
2。ダブルトランスジェニック胚性幹細胞株の維持
まず、培養マウスES細胞については、次のメディアを準備します。
マウス胚線維芽細胞（MEF）ミディアム：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）、ES細胞や分化グレード、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（P / S）
胚性幹細胞（ESC）ミディアム：DMEM、15％FBSをES細胞グレード、非必須アミノ酸（NEAA）1％、0.5％、P / S、0.2％白血病阻害因子（LIF）、0.0007％2 - メルカプトエタノール（2-ME）を
- 蒸留H 2 Oおよび37℃で15分間吸着させ、それを聞かせて℃のゼラチン滅菌0.1％コート6ウェルプレート
- 円錐管で解凍アリコートから50 mlのPBSにMEFを加え、5分間1,000 rpmで、それらを遠心分離します。 MEF-培地に再懸濁したMEF。
- ウェルに吸着、吸引過剰ゼラチンおよびadd MEFの後。 MEFは1日、添付することができます。
* 3 6ウェルプレート用の千万のMEFで十分のアリコート。
- MEFには添付している場合には、円錐管で解凍アリコートから50 mlのPBSにES細胞を追加し、5分間1,000 rpmで、それらを遠心分離します。再懸濁したESは、ESC-培地中の細胞とMEFを含むウェルに追加します。合流点に到達するまで、ESC-培地で培養したES細胞。
*一度ES細胞は継代はのrequです、合流点に達している繁茂を回避し、ES細胞コロニーを維持するために、赤外発光ダイオード。
- 継代のためにES細胞を準備します。吸引ESC-培地と滅菌PBSで1回洗浄します。
- PBSを吸引除去し、トリプシンの500μlを添加する。 37℃で3.5分プロセス℃まで
- ES細胞コロニーを打破し、ESC-培地500μlでそれを中和するために、上下に数回トリプシン溶液をピペット。
- ご希望の比に応じて通過したES細胞は、通路1月30日に先に調製したMEFを持つ別のウェルに33μlの転送など 。 ESC-培地でES細胞を維持。
* 1/30の通過率は、ES細胞が3日以内にコンフルエントに到達することができます。通過したES細胞は、あなたのin vitro分化のスケジュールに従って。
（3）二重トランスジェニック胚性幹細胞株および心臓前駆細胞の単離とその種のインビトロ分化
まず、followiを準備ES細胞のin vitroでの分化に必要なNGメディア：
適応-ミディアム：イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、15％FBSをES細胞グレード、1％NEAA、0.5％、P / S、0.2％、LIF、0.0007％2-ME
分化ミディアム：IMDM、15％のFBS分化グレード。 1パーセントNEAA、0.5％、P / S、0.1Mアスコルビン酸の0.35％、0.0007％2-ME
- ES細胞がコンフルエントに達したときのin vitro分化に起動します。蒸留H 2 Oおよび37℃で15分間吸着させ、それを聞かせて℃のゼラチン無菌の0.1％のコート10cmの培養皿を
* in vitroでの分化過程の期間に注意してください。心臓前駆細胞を単離することができるようになるまで、それは8日かかります。それに応じてあなたの実験を計画します。
- 以前のように収穫したES細胞。吸着、吸引過剰ゼラチン後、準備された文化にES細胞懸濁液の約1/3-1/2追加適応-培地を含む料理をお楽しみいただけます。 2日間の培養細胞。
*あなたの実験によると適応のためのES細胞の量を選択してください。
- 収穫は1を使用してPBSを含む50mlコニカルチューブにES細胞を適応した。トリプシンの5ミリリットル。 5分間1,000 rpmで解離したES細胞を遠心分離し、分化培地で再懸濁します。
- マルチチャンネルピペットを用いて15cmの培養皿で10μlのドロップあたり約1000個の細胞の胚様体（EB）を作る。 37℃で2.5日間滴をぶら下げとしてプレートや文化EBを反転℃に
- 2.5日後、1 37℃でさらに3.5日間分化培地や文化、それらを使用して℃に6月8日15cmの培養皿のプールのEB
- 3.5日後には、円錐形の50mlチューブにEBSを収集し、それらを約5分間、底に沈むことができます。上清を吸うと滅菌PBSでEBを洗う。 EBをAPPRための底に再び沈むましょうoximately 5分。
- 2でそれらを処理することにより、EBを解離する。 37℃の水浴中で2分間トリプシンを5ml℃〜そっとチューブを振る。次に、2を追加します。 5トリプシン溶液に滅菌PBSミリリットルと10ミリリットル血清ピペットで細胞塊を分解するのに約8から10回上下にピペッティング。 7.5パーセントのFBS ES細胞または分化グレードおよびPBS中の0.01％DAPIを含むFACS緩衝液10mlでトリプシンを中和する。
- 5分間1,000 rpmで解離EBを遠心分離し、FACS緩衝液約1mlに再懸濁します。 1mlのピペットで細胞塊を分解するのに約8から10回上下にピペッティング。
*解離EBの推定量に応じて、FACS緩衝液を追加します。あまりに高度に濃縮された細胞は、FACSの間に詰まらせることがあり、あまりにも低濃度の細胞が不必要にFACSの時間を延長することがあります。
- 取得するために35μmのセルストレーナーで滅菌丸底チューブに細胞を移し単一細胞懸濁液。
- FACSAriaフローサイトメーターを用いて分化したES細胞を選別し、CVPの精製された集団を得る。
*私たちは、高度に精製された着色された細胞を単離するためのマルチステップゲーティング戦略を開発した。簡単に言えば、我々前方散乱振幅（FSC-A）と側方散乱振幅（SSC-A）（ 図1A）上の最初の門。これは、私たちは細胞の破片から全細胞を分離することができます。その後、我々は、FSCと前方散乱光幅（FSC-W）（ 図1B）にゲート。これは、私たちはダブレットおよび他の細胞集合体から細胞シングレットを特定することができます。次に我々のSSC-及び側方散乱幅（SSC-W）（ 図1C）でゲート。これは、細胞シングレットの純度を向上させます。その後、我々は、DAPIでゲート非生存細胞（ 図1D）から生細胞を（DAPI陰性）を単離する染色。それから私達Phycoeryhthrin振幅（PE）とPE-シアニン色素7振幅（PE-Cy7-）上のゲート（R +真赤陽性を得るために - ）細胞と自家蛍光赤陰性細胞（ 図1E）を除外する。 R +とR -細胞はフルオレセインイソチオシアネートの振幅（FITC）で別々に次にゲートされると、PE-緑真陽性（G +）と（ - G）グリーン陰性真ソートするために、これらの集団内の細胞（ 図1F + 1G）。次のようにセルの4集団でこの結果：R + G +、R + G -であり 、R - G +とR - G - （ 図1H）。
- 10分間蒸留H 2 O中1％プルロニックF-127とマイクロパターン基板を不動態化する。その後、滅菌PBSで彼らは3倍洗う。
*プルロニックF-127は、そのブロックの細胞接着界面活性剤である。これは、マイクロパターン化エリアへの細胞接着の閉じ込めをサポートしています。
- パターン化された領域の周囲のPDMSガスケットを取り付けしっかりと押し込みます。フィブロネクチンマイクロパターン基板上に続いて、シードは、CVP。
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Representative Results
in vitroで分化したES細胞でのFACS精製は、前駆細胞の4つの異なる集団（ 図1）を明らかにした。マイクロパターンフィブロネクチンの存在は、連続的なフィブロネクチンライン（ 図2）の完全な転送を表示免疫蛍光顕微鏡検査法により確認された。 G +集団-フィブロネクチン微細パターン上に、FACS分離された前駆体のメッキがR + G +とRの一部のアラインメントをもたらした。細胞接着を支持ブロッカーとしてプルロニックF-127が使用されていたが、R + G -であり、R - G -集団は、フィブロネクチンの異方性アーキテクチャを尊重し、隣接したタンパク質線（ 図3）との間の空間に成長していませんでした。
図1。 Represe in vitroで分化したES細胞では 6日目のntativeフローサイトメトリーチャート（）ゲー前方散乱振幅（FSC-）上と側方散乱振幅（SSC-）、FSCおよび散布幅フォワード（上の（B）ゲーFSC-W）（C）は DAPI染色のSSCおよび側方散乱幅（SSC-W）（D）のゲートにゲート（E）Phycoeryhthrin（PE）とPE-シアニン色素7のためのゲーティング（PE- Cy7）（FとG）フルオレセインイソチオシアネートの振幅（FITC-A）と、PE-（H）前駆細胞の4つの異なる集団を明らかにフローサイトメトリープロットのためのゲーティング：。R + G +、R + G -であり 、R - G +とR - G - 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
fig2.jpgの "alt ="図2 "/>
図2。マイクロパターンフィブロネクチン基質の代表的な免疫蛍光顕微鏡。スケールバーは、80μmである。
図3。の代表的な免疫蛍光顕微鏡胚（A）とES細胞由来の（B）をフィブロネクチン上の微細パターン文化、さらに5日後、FACS分離された前駆細胞核、青; smMHC、赤、サルコメアα-アクチニン、緑。スケールバーは40μm。 Domian ら （2009年）から転載。
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Discussion
このプロトコルでは、我々は彼らが整列し、心筋細胞のようなロッド形状を取ることができますどのような心原性前駆細胞の精製された集団を区別し、フィブロネクチンマイクロパターン基板上シードそれらをするための方法を提示した。正常な細胞組織は、心筋組織のために、特に、正常な組織機能8,10のために重要です。心筋細胞は、異方性セル·アレイを形成する際に、11,13 11,12改善された機械的および電気生理学的特性を発現することが示されている。マイクロパターン基板をフィブロネクチン上で培養した心臓前駆細胞は 、in vitro で 、棒状の心筋細胞に分化するので、これは心臓組織工学内apivotalステップを表します。
マイクロコンタクトプリントは 、in vitro での心筋組織に似ている2次元のテンプレートを生成するために使用できる、シンプルで安価なツールです。抽のが、効率的かつ成功したパターニングellularマトリックスタンパク質は、選択された蛋白質に決定的に依存しています。異なるタンパク質の大規模な様々なが正常PDMS基板、そのようなI型コラーゲンなどの特定のタンパク質が、上に刻印されているのに対し、前にマイクロコンタクトプリント14〜PDMS基板の表面改質を必要とします。また、スタンプだけでなく、スタンプの期間に適用される圧力の量も大幅にマイクロコンタクトプリントの効率性と忠実度に影響を与えることができます。
このプロトコルのもう一つの重要なステップは、親水性PDMSスタンプの表面をレンダリングするためのプラズマクリーナーの使用です。 PDMSスタンプと、両基板はPDMS基板の濡れ性のチューニングが可能なタンパク質3,6の転送を行うために必要とされることがわかった酸素プラズマ処理15と、複数のグループを受けていないときにマイクロコンタクトプリントが発生しないことはよく知られているそれである、15。しかし、我々が発見したの親水性を増加させるPDMSは、代わりにこのような混乱が少ない、または不完全なタンパク質線などの高品質で、より均一な蛋白質の微細パターンにおいて、PDMS基板結果のスタンプ。
提示プロトコルのために、20μmの微細パターン幅は、マウス新生児の心筋細胞16の報告されたセル幅に応じて、選択されました。しかし、微細パターンの製造は、スペースに限りがあるため、細胞生存率に対して反対の作用を防止するために、種と心の発達段階に依存し16から20までの方法で行われるべきである。
特にES細胞由来CVP、R + G +集団の発見および精製は、心臓組織内で信頼性のある生体工学の研究を可能にします。特に、我々は彼らの細胞整列を維持するとの契約心筋組織を形成することができるように私たちのES細胞由来の心筋前駆細胞を観察している。ことを考えると3次元が機能構築組織は、組織工学の分野における重要な目標であり、他のグループが以前に他の細胞型21,22のために説明したように、私たちの生成した2次元異方性の心筋組織を効果的に、複数層の細胞シートを使用することができる。しかし、今日まで、トランスジェニックレポーターシステムの一つの制限は、ES細胞のインビトロ分化の結果である。 FACS使用可能CVPは、特に強く心R + G +集団は、すべての分化した細胞の0.5％のおおよその平均のために現在のアカウント。したがって、CVPへのES細胞の in vitro分化に改善することは縦方向に整列心筋線維から成る大規模な異方性の心臓組織を構築するためにCVPの十分な量を生成することに向けた大きな一歩となるだろう。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、ナノシステム研究センター（CNS）、無のNSF賞の下で国立科学財団によってサポートされている国家ナノテクノロジー基盤ネットワーク（NNIN）のメンバーで、一部で実施された。 ECS-0335765。 CNSは、ハーバード大学の一部である。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
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