Summary
Hizalanmış miyokard doku nesil klinik açıdan yararlı amaçlar için kök hücre biyolojisi ile ilgili güncel gelişmeleri adapte için önemli bir gerekliliktir. Bu yazıda hücre şekli ve fonksiyonu hassas kontrolü için mikrokontak baskı yaklaşımı açıklar. Kardiyak progenitörler türetilmiş embriyonik kök hücre son derece saf popülasyonlarının kullanarak, biz sonra anizotropik fonksiyonel miyokard doku oluşturur.
Abstract
İleri kalp yetmezliği uygulanabilir ve / veya tamamen fonksiyonel kalp kası hücrelerinin kaybından kaynaklanan, büyük karşılanmamış klinik sorun teşkil etmektedir. Optimum ilaç tedavisine rağmen kalp yetersizliği gelişmiş dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir temsil eder. Ilaç geliştirilmesinde önemli bir meydan okuma doğru vitro normal ve hastalıklı insan miyokard fizyolojisi recapitulate hücresel testlerinin tanımlanmasıdır. Aynı şekilde, rejeneratif kalp biyolojideki başlıca zorlukları klinik miktarlarda hasta-spesifik kardiyak progenitörlerin tespiti ve izolasyonu etrafında döner. Bu hücreler daha sonra böylece mekansal hücre yapışması kontrol geometrik ipuçları veren,. Mikrokontak baskı kalbinin yapısal organizasyonu benzer hassas micropatterned protein şekillerin oluşturulmasını sağlar yerli kalp dokusu mimarisi benzer fonksiyonel doku içine monte edilmelidir. Buradabiz çok in vitro, ekstrasellüler matriks proteinleri ile micropatterned hücre büyümesi yüzeylerin nesil ayırt pluripotent kök hücrelerinden miyokard hücreleri arıtılmış izolasyonu için bizim yaklaşımımız açıklamak ve anizotropik miyokard dokusu içine kök hücre kökenli kalp kası hücrelerinin montajı.
Introduction
Medikal tedavideki gelişmelere rağmen, ileri kalp yetmezliği gelişmiş dünyada mortalite ve morbiditenin önde gelen nedenidir. Klinik sendrom fonksiyonel miyokard doku kaybı ve etkilenen bireylerin metabolik ihtiyaçları karşılamak için başarısız kalp sonradan bir yetersizlik ortaya çıkar. Kalp sınırlı yenilenme kapasitesi olduğundan, otolog kalp nakli doğrudan kaybetti işlevsel kalp dokusu yenilenmesi hedefleniyor sadece mevcut klinik kabul tedavisidir. Donör kalpleri sınırlı sayıda ve uzun süreli immünosupresif tedavi için, bu tedavinin yaygın kullanılmasına engel ihtiyacı da dahil olmak üzere kalp nakli önemli sakıncaları. Sonuç olarak, tıbbi tedavi kalp hastalığı olan hastalar için tedavi dayanak noktası olmuştur. Ilaç geliştirilmesinde önemli bir meydan okuma doğru vitro normal ve hastalıklı miyokard fizyolojisi recapitulate hücresel testlerinin tanımlanmasıdır.
Kök hücre biyolojisi ve doku mühendisliği teknolojinin son yakınsama kardiyak rejenerasyon için yeni umut verici yollar yükseltir. Yenilenebilir bir hastaya özgü kaynak işlevsel miyokard dokusu oluşturuluyor alanında önemli bir ilerleme olacaktır. Bu ilaç geliştirme ve keşif için hastalığa spesifik hücresel testlerin geliştirilmesi için izin verecek ve kardiyak rejeneratif tıp için temellerini atacak. İnsan embriyonik kök (ES) hücreler ve, daha da önemlisi, insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) hücreler ventriküler progenitör hücreler ve olgun ventriküler miyositlerin potansiyel yenilenebilir hastaya özgü kaynağı temsil eder. Stem hücre biyolojisi ve doku mühendisliği yöntemi kombinasyonu ilaç keşfi için veya ileri kalp yetmezliğinin tedavisi için kalp rejeneratif yaklaşımlar hücre testlerin geliştirilmesinde kullanılabilecek in vitro fonksiyonel kalp dokusu oluşturularak bu sorunu ortadan kaldırır.
_content "> kardiyak rejenerasyon olarak merkezi bir meydan okuma optimal hücre tipinin belirlenmesi olmuştur. çeşitli kaynaklardan farklı multipotent kardiyojenik öncüleri keşfedilmiş olmasına rağmen hücrelerin geniş bir dizi, bununla birlikte, şimdiye kadar, bir hücre kimlik 1 incelenmiştir Böyle miyojenik hücre kaderinin bağlılık gibi kritik gereksinimlerini karşılayan kaynak, fonksiyonel miyokard dokusunun in vivo ya da in vitro ve kompozisyon genişletmek için kapasite bakım merkezi bir sorunu 2 olduğu kanıtlanmıştır. Biz daha önce bir çift transgenik fare sistemi nitelendirdiler Bu son derece in vitro farklılaşan ES hücrelerinin kararlı ventriküler öncü hücrelerden (CVP) popülasyonlarının saflaştırılmış izolasyon sağlar. Bu MEF2c geninin bir Isl1-bağımlı artırıcı madde kontrolü altında DsRed kırmızı flöresanlı protein ifade eden yeni bir çift transgenik fare oluşturulur ve denetimi altında geliştirilmiş bir yeşil floresan proteinkardiyak spesifik Nkx2.5 arttırıcı. Bu iki-renkli flüoresan raportör sistemi, MEF2c ve Nkx2.5 genlerin kendi ifade göre Flüoresans Aktif hücre sıralama (FACS) vasıtasıyla izole edilebilir, gelişmekte olan ES hücreleri geçen ilk ve ikinci kalp alan öncüllerinden esas alınmıştır. CVP kardiyak doku rejeneratif amaçlı büyük umut sunduklarıyla miyokard belirteçler ve yapısal ve işlevsel özellikleri, 3, ifade şekillerine göre kardiyak miyositler benzerler.Doku mühendisliği alanında birçok gelişmeler olmuştur rağmen, yerel hücresel mimarisini taklit önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu sorunu gidermek için geleneksel yöntemler Vitro hücreleri ile tohum, biyolojik veya sentetik iskeleleri bulunmaktadır. Hızla bozulması, sınırlı fiziksel ve mekanik stabilite ve düşük hücre yoğunluğu 1,4,5 gibi iskeleleri, dezavantajları bir dizi nedeniyle, iskele-az doku mühendisi çalışmışlardır. AltHough kalp hücrelerinin ekstrasellüler matriks proteinlerinin salgılanması ile kendi yerel mikroçevrede değiştirebilir, onlar ekstraselüler ipuçlarının yokluğunda çubuk şekilli kardiyak miyositler için kendilerini organize etmek için daha sınırlı bir kapasiteye sahiptir. Böylece, fonksiyonel miyokard dokusu oluşturmak için hücreleri uygun mekansal ve biyolojik ipuçları sağlayan bir şablon gereklidir. Mikrokontak baskı hassas hizalanmış fonksiyonel miyokard doku üretimi için önemli olan her hangi hücre şekli, organizasyon ve fonksiyonu 6-8, kontrol etmek için basit ve ucuz bir yöntem sağlayarak bu sorunu giderir. Bu, hassas kalıplar içinde PDMS substratlar üzerine hücre dışı matris proteinlerinin birikmesi sağlamak ve böylece mekansal olarak hücre yapışma etkiler 2 um ile 9 arasında değişen aşağı özelliği boyutlarına sahip Mikrodokulu polidimetilsiloksan (PDMS) mühür kullanımını kapsamaktadır.
Bu yazıda, kök cel ile doku biyomühendislik teknolojisi birleştirmek teklifl biyoloji anizotropik fonksiyonel miyokard dokusu oluşturmak için. Buna göre, biz burada şu bizim son zamanlarda yayınlanan bir yaklaşım göstermektedir: (1) hizalanmış miyokard dokusu için bir şablon nesil için mikrokontak baskı ile PDMS yüzeylerde micropatterned protein yüzeylerin nesil (2) Şiddetle gelen kardiyak progenitörlerin saflaştırılmış izolasyonu ES hücreleri in vitro farklılaşan, ve (3) oluşturmak için iki tekniği kombinasyon fonksiyonel miyokardiyal doku hizalanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hizalanmış fonksiyonel miyokard dokusu oluşturmak için protokol üç ana bölüme ayrılabilir. Yumuşak litografi teknikleri kullanarak micropatterned master imalat aşağıdaki protokolünün bir parçası olarak kabul edilmez ancak kurulan yöntem 6'ya göre yapılabilir.
1. PDMS Yüzeyler üzerine Fibronektin arasında mikrokontak Baskı
- Ajan oranı ve degas herhangi bir hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için bir desikatörde kullanarak derleme kür için 10:1 üssünde Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS elastomer karıştırın.
- ° C Mikrodokulu PDMS pul elde etmek için 65 oda sıcaklığında ya da 4 saatte 2 gün ya da 20 mikron boşluk ile ayrılmış 20 mikron genişliğinde ve 2 mikron boyunda sırtları ile önceden fabrikasyon usta karşı PDMS Cure.
* Bir desikatörde Kür yüksek hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için tavsiye edilir.
- Cam kapak slipi (örn. üzerine Spin mont PDMS15 um kalınlıkta ince ve düz yüzeyler PDMS üretmek için bir Headway Spin Kaplayıcı kullanılarak 2 dakika için 5000 rpm'de 22x22 mm).
- Toz ve kir parçacıkları temizlemek için% 70 Etanol ile pulları temizleyin. Onları havada kurumasını bekleyin.
* Pul birkaç kez kullanılabilir, ancak, düzenli bir PDMS pullar yenileyen bir süre boyunca yüzey sürtünerek aşınma nedeniyle tavsiye edilir.
- 275 mTorr az 1 dakika süreyle bir SPI Plazma-Hazırlık II Plazma Temizleyici ve süreç içinde yer pulları PDMS yüzeylerin hidrofilik işlemek için.
* Oksijen plazma tedavisi izledi olmalıdır. Daha uzun işlem süresi elastomer çatlaklara neden olabilir.
- 1 dakika için% 70 Etanol ile pulları sterilize edin. Basınçlı hava ile hızlı kurulayın.
* Ayrıntılı adımlar kısırlık korumak için biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.
- F yüzeyler damga Kapakibronectin çözeltisi (GKD 2 O içinde 50 mg / ml). Bu adsorbe en az 10 dakika izin verin.
- Damgalar arasından Fibronektin çözüm Silkelen ve basınçlı hava ile çabuk kurur.
- 2 dakika için pulları ve PDMS yüzeyler arasındaki konform temas kurmak ve sıkıca bastırın.
- GKD 2 O. ile micropatterned yüzeylerde durulayın Başlangıçta kullanılan ° C sürece 4 az 2 hafta en fazla GKD 2 O içinde saklayın. GKD 2 O. Mağaza PDMS pulları
2. Çift Transgenik Embriyonik Kök Hücre Hatlarının Bakım
Birincisi, kültür fare ES hücreleri için aşağıdaki ortam hazırlayın:
Fare embriyonik fibroblast (MEF)-Ortamı: Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ES hücresi ya da farklılaşma dereceli,% 1 Penisilin-Streptomisin (P / S)
Embriyonik Kök Hücre (ESC)-Orta: DMEM,% 15 FBS ES hücre notu,% 1 Temel Olmayan Amino Asitler (NEAA),% 0,5 P / S,% 0.2 lösemi inhibitör faktörü (LIF), 0.0007% 2-mercaptoethanol (2-ME)
- Steril% 0.1 GKD 2 O Jelatin ve 37 azından adsorbe 15 dakika izin ° C ile kaplayın 6-kuyucuğu
- , Konik bir tüp içinde çözülmüş bir kısım 50 ml PBS ile MEFS ilave edin ve 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj onları. MEF-ortamda süspanse MEFS.
- Kuyulara adsorpsiyon, aspirat aşırı Jelatin ve eklenti MEFS sonra. MEFS 1 gün takmak için izin ver.
* 3 6-kuyucuğu için 10 milyon MEFS yeterli bir kısım.
- MEFS eklenmiş zaman, konik bir tüp içinde çözülmüş bir kısım 50 ml PBS ile ES hücreleri ilave edin ve 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj onları. Süspanse ES ESC-orta ve MEFS içeren kuyuların ekleyebilirsiniz hücreleri. ESC-ortam içinde kültür ES hücreleri kesişme noktası kadar ulaşır.
* Bir kez ES hücreleri pasajlanmasını requ, izdiham olduğunu ulaştıbüyüme önlemek ve ES hücre kolonileri korumak için IRED.
- Pasajlanmasını için ES hücreleri hazırlayın. Aspiratif ESC-orta ve steril PBS ile bir kez yıkayın.
- PBS aspire ve tripsin 500 ul ekleyin. 37 Proses 3,5 dak ° C.
- ES hücre kolonilerinin yıkmak ve ESC-orta 500 ul ile nötralize etmek için birkaç kez aşağı Tripsin çözümü pipet ve.
- İstediğiniz oranına göre Passage ES hücreleri, başka bir kuyuya örneğin transfer 33 ul önceki geçişi 1/30 MEFS hazırlanmıştır. ESC-Ortamda ES hücreleri koruyun.
* 1/30 arasında bir geçiş alanı oranı, ES hücreleri 3 gün içinde izdiham ulaşmasını sağlar. Passage ES hücreleri in vitro farklılaşma zamanlamaya göre.
3. Çift Transgenik Embriyonik Kök Hücre Hatları ve Kardiyak progenitörlerinin İzolasyon ve Tohumluk in vitro farklılaşma olarak
İlk olarak, followi hazırlamakNG ortamı ES hücrelerinin in vitro farklılaşması için gerekli süre:
Adaptasyon-Orta: Iscove Modifiye Dulbecco Orta (IMDM),% 15 FBS ES hücre notu,% 1 NEAA,% 0,5 P / S,% 0.2 LIF, 0.0007% 2-ME
Farklılaşma-Orta: IMDM,% 15 FBS Farklılaşma dereceli. % 1 NEAA,% 0.5 P / S, 0.1M Askorbik Asit, 0.35,% 0.0007% 2-ME
- ES hücreleri izdiham ulaştığınızda vitro farklılaşma başlayın. Steril% 0.1 GKD 2 O Jelatin ve 37 azından adsorbe 15 dakika izin ° C ile kaplayın 10 cm kültür tabaklarında
* In vitro farklılaşma sürecinin süresi farkında olun. Kardiyak progenitörler izole edilebilir gelene kadar 8 gün sürer. Buna göre deney planlayın.
- Daha önce olduğu gibi Hasat ES hücreleri. Adsorpsiyon, aspirat aşırı Jelatin sonra ve hazırlanan kültür ES hücre süspansiyonu yaklaşık 1/3-1/2 ekleyinAdaptasyon-medium içeren yemekler. 2 gün boyunca kültür hücreleri.
* Da deneylere göre uyarlanması için ES hücrelerinin miktarını belirleyin.
- Hasat 1 kullanarak PBS içeren 50 ml'lik konik bir tüp içine ES hücreleri uyarlanmıştır. Tripsin 5 ml. 5 dakika boyunca 1000 rpm'de disosiye ES hücreleri santrifüjleyin ve Farklılaşma-orta onları tekrar süspansiyon haline getirin.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak 15 cm kültür tabaklarında 10 ul damla başına yaklaşık 1,000 hücrelerin embriyoid organları (EBS) olun. 37 de 2.5 gün için damlacıkları asılı olarak kültür plakaları ve EBS Invert ° C.
- 2.5 gün sonra, biri 37 bir ek 3.5 gün için Farklılaştırma, orta ve bunları kullanarak kültür içinde 6-8 ° C'de 15 cm kültür tabaklarında bir havuz EBS
- 3.5 gün sonra, 50 ml konik bir tüp içinde EBS toplamak ve bunları yaklaşık 5 dakika boyunca aşağıya doğru nüfuz etmesine izin. Süpernatant kadar Suck ve steril PBS ile EBS yıkayın. EBS yak için alt için tekrar batırmakoximately 5 dk.
- 2 ile bunları işleyerek EBS çözerler. 37, bir su banyosu içinde 2 dakika süreyle, 5 ml tripsin ° C'de yavaşça sallama tüpü. Ardından, 2 ekleyin. 5 Tripsin solüsyonu steril PBS ml ve 10 ml lik bir serolojik pipet ile hücre kümeleri yıkmak için yaklaşık 8-10 kat yukarı ve aşağı Pipeti. FACS tampon 10 ml% 7.5 PBS FBS ES hücre veya Farklılaşma dereceli ve% 0.01 DAPI içeren ile tripsin nötralize.
- 5 dakika boyunca 1,000 rpm'de santrifüje EBS ayrılmış ve FACS tamponu, yaklaşık 1 ml bunları tekrar süspansiyon. Bir 1 ml pipet ile hücre kümeleri yıkmak için yaklaşık 8-10 kat yukarı ve aşağı pipet.
* Disosiye EBS tahmini miktarına göre FACS tampon ekleyin. Çok yüksek konsantre hücreler FACS sırasında yapışmasına neden olabilir ve çok düşük konsantre hücre gereksiz FACS zamanını uzatabilir.
- Elde etmek için 35 mikron hücre süzgecinden steril bir yuvarlak tabanlı tüp hücreleri aktarıntek bir hücre süspansiyonu.
- Sıralama farklılaşmış ES hücreleri bir FACSAria Akış Sitometresi kullanarak ve CVP nüfus saflaştırılmış edinin.
* Biz son derece saf renkli hücreler izole etmek için bir çok adım geçitleme strateji geliştirdi. Kısacası, biz Forward Scatter Genlik (FSC-A) ve Yana Saçılım Genlik (SSC-A) (Şekil 1A) üzerine ilk kapı. Bu bizi hücresel artıklardan bütün hücreler ayrı sağlar. Biz o zaman FSC-A ve Forward Scatter-Genişlik (FSC-W) (Şekil 1B) üzerine kapısı. Bu bize çiftler ve diğer hücresel büyüklükler hücre mayoları izole sağlar. Daha sonra SSC-A ve Yana Saçılım-Genişlik (SSC-W) (Şekil 1C) üzerindeki kapısı. Bu hücre, singlet saflığını artırır. Biz o DAPI üzerine kapısı cansız hücreleri (Şekil 1D) dan canlı hücreler (DAPI-negatif) ayırmak için boyama. Daha sonra Phycoeryhthrin Genlik (PE-A) ve PE-siyanin boya 7 Genlik (PE-Cy7-A) gerçek kırmızı-pozitif (R elde etmek için kapı + -) hücreler ve autofluorescent kırmızı-negatif hücre (Şekil 1E) dışlamak için. R + ve R - bu popülasyonlar (Şekil 1F içinde hücreleri + - hücreleri Floresein izotiyosiyanat Genlik (FITC-A) ve PE-gerçek bir yeşil-pozitif (G +) ve gerçek (G) yeşil-negatif sıralamak için ayrı ayrı ardından Geçitli vardır 1G). Aşağıdaki gibi hücrelerin 4 popülasyonlarında Bu sonuçlar: R + G + R + G -, R - G + ve R - G - (Şekil 1H).
- 10 dakika için GKD 2 O içinde% 1 Pluronic F-127 ile micropatterned substratlar etkisizleştirmek. Sonra steril PBS ile 3x yıkayın.
* Pluronic F-127 engelleyen hücre yapışması bir yüzey aktiftir. Bu micropatterned bölge için hücre yapışma kısıtlanmasının destekler.
- Desenli bölgenin etrafında PDMS contaları takınve sıkıca bastırın. Fibronektin micropatterned yüzeylere Sonra tohum CVP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro farklılaşan ES hücreleri içinde FACS saflaştırma soylarının dört farklı popülasyonlarının (Şekil 1) ortaya koymuştur. Micropatterned Fibronektin varlığı sürekli Fibronektin hatları (Şekil 2) arasında bir tam transfer gösterilen immün flüoresan mikroskopi ile teyit edilmiştir. G + popülasyonları - Fibronektin micropatterns üzerine FACS-izole progenitörlerinin Kaplama R + G + ve R parçası uyum sonuçlandı. Pluronic F-127 hücre yapışma destekleyici bir engelleyici kullanıldığı gibi, ancak R + G - ve R - G - Fibronektin popülasyonlar anizotropik mimari saygı ve bitişik protein hatları (Şekil 3) arasındaki boşluk içine büyüdü yoktu.
Şekil 1. Represe vitro farklılaşmış ES hücreleri gün 6 ntative flow sitometri grafik. Forward Scatter Genlik (FSC-A) ve Yana Saçılım Genlik (SSC-A) (A) Yolluk. FSC-A ve Scatter-Genişlik Forward (üzerine (B) Yolluk FSC-W). (C) DAPI boyama üzerine SSC-A ve Yana Saçılım-Genişlik (SSC-W). (D) Yolluk üzerine Yolluk. (E) Phycoeryhthrin (PE) ve PE-siyanin boya 7 Yolluk (PE- Cy7) (F ve G) Floresein izotiyosiyanat Genlik (FITC-A) ve PE-A (H) ataları dört farklı toplumlarda ortaya Flow sitometri arsa için Yolluk:.. R + G + R + G -, R - G + ve R - G -. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
fig2.jpg "alt =" Şekil 2 "/>
Şekil 2. Micropatterned Fibronektin yüzeylerde Temsilcisi immünofloresan mikroskopisi. Ölçek çubuğu, 80 mikron.
Şekil 3,. Temsilcisi immünofloresan mikroskopi embriyonik (A) ve ES hücre kaynaklı (B) Fibronektin micropatterns kültürün ek bir 5 gün sonra FACS-izole ataları Çekirdekler, mavi;. SmMHC, kırmızı; sarkomerik α-aktinin, yeşil. Ölçek çubuğu, 40 mikron. Domian ve diğ. (2009) çoğaltılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, biz onları hizalamak ve bir kardiyak miyosit benzeri çubuk şekil almaya izin verir ne kardiyojenik progenitörlerinin saflaştırılmış popülasyonları ayırmak ve micropatterned Fibronektin yüzeylerde tohum onları için bir yöntem sundu. Normal hücresel organizasyonu miyokard dokusunun özellikle normal doku fonksiyonu 8,10 için kritik öneme sahiptir. Kardiyak miyositlerin anizotropik hücre dizileri oluştururken geliştirilmiş mekanik 11,12 ve elektrofizyolojik özelliklerini 11,13 geliştirmek için gösterilmiştir. Micropatterned Fibronektin yüzeylerde kültüre kardiyak ataları vitro çubuk şeklindeki miyokard hücrelerine ayırt bu yana, bu kalp dokusu biyomühendislik içinde apivotal adımı temsil etmektedir.
Mikrokontak baskı in vitro miyokardiyal doku benzeyen 2-boyutlu bir şablon oluşturmak için kullanılabilecek bir basit ve ucuz bir araçtır. Extrac Ancak, verimli ve başarılı bir desenlendirmeellular matris proteinlerinin tercih edilen bir protein üzerinde kritik dayanır. Farklı proteinlerin büyük bir çeşitlilik başarılı bir şekilde PDMS yüzeyler, örneğin Kolajen Tip I olarak bazı proteinler, üzerine damgalanır edilmiş olup, önceki mikrokontak baskı 14'e PDMS substrat yüzey modifikasyonu gerektirir. Buna ek olarak, ezme süresi kadar pul uygulanan basınç miktarı da büyük ölçüde mikrokontak baskı verimi ve aslına uygunluk etkileyebilir.
Bu protokolün bir diğer kritik adım hidrofilik PDMS pul yüzeyleri işlemek için bir plazma temizleyici kullanımıdır. Bu PDMS pulları ve substratlar hem oksijen plazma işlemi 15 ve PDMS substratların ıslanabilirlik ayarlanması 3,6 olası bir protein transferi yapmak için gerekli olduğunu bulundu birkaç grup uğramayan zaman mikrokontak baskı oluşmaz biliniyor , 15. Ancak, bulduğumuz bir hidrofil artanPDMS yerine bu tür daha az yıkıcı veya eksik proteini hatları gibi yüksek kalite ile daha düzgün protein micropatterns içinde PDMS substrat sonuç damga.
Sunulan protokolü için, 20 mikron genişlikte micropattern mürin Neonatal kardiyak miyosit 16 bildirilen hücre genişliğine göre seçilmiştir. Bununla birlikte, micropatterns yapımını sınırlı boşluk nedeniyle hücre canlılığı ile ilgili ters etkilerin önlenmesi için bir tür ve kalp gelişimsel aşamada 16-20-bağımlı bir şekilde yapılması gerekir.
ES hücre kökenli CVP, özellikle R + G + nüfusun keşif ve saflaştırılması, kardiyak doku biyomühendislik içinde güvenilir çalışmaların etkinleştirin. Özellikle, biz onların hücresel hizalamayı koruyarak ile sözleşme miyokard dokusu oluşturma yeteneğine sahip olması bizim ES hücre kaynaklı kardiyak ataları gözlemledik. O inşa üç boyutlu fonksiyonel Verilendoku, biyomühendislik alanında önemli bir hedef olduğu diğer gruplar daha önce bir başka hücre tipleri 21,22 için tarif edildiği gibi, bizim üretilen iki-boyutlu anizotropik miyokardiyal doku etkili bir tabaka birden fazla hücre levhalar için kullanılabilir. Ancak, bugüne kadar, transgenik muhabir sisteminin bir sınırlama ES hücreleri in vitro farklılaşma sonucudur. FACS mevcut CVP, özellikle güçlü bir şekilde kardiyojenik R + G + nüfus, her farklılaşmış hücreler% 0.5 'i arasında bir ortalama için şu anda yaklaşık hesap. Böylece, CVP içine ES hücreleri in vitro farklılaşma iyileştirilmesi uzunlamasına hizalanmış miyokard lifleri oluşan büyük anizotropik kardiyak doku oluşturmak için CVP yeterli miktarda üretme yolunda büyük bir adım olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Nanoseviye Sistemleri Merkezi (MSS), hiçbir NSF ödül kapsamında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı (NNIN), bir üyesi azından kısmen yapıldı. ECS-0335765. MSS Harvard Üniversitesi'nden bir parçasıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
