Summary
Den generation linje myokardvävnad är ett centralt krav för att anpassa de senaste framstegen inom stamcellsbiologi att kliniskt användbara syften. Häri beskriver vi en metod mikrokontakttryckning för exakt kontroll av cellens form och funktion. Med hjälp av mycket renade populationer av embryonala stamceller härstammar hjärt stamfäder skapar vi sedan anisotropa funktionell myokardvävnaden.
Abstract
Avancerad hjärtsvikt är en stor tillgodoser kliniska utmaning till följd av förlusten av livskraftiga och / eller fullt fungerande hjärtmuskelceller. Trots optimal läkemedelsbehandling utgör hjärtsvikt en ledande orsak till dödlighet och sjuklighet i den utvecklade världen. En stor utmaning inom läkemedelsutveckling är att identifiera cellulära analyser som noggrant rekapitulera normal och sjuk människa hjärtinfarkt fysiologi in vitro. Likaså de stora utmaningarna i regenerativ hjärt biologi kretsar kring identifiering och isolering av patientspecifika hjärt föregångare i kliniskt relevanta mängder. Dessa celler måste sedan sättas samman till funktionell vävnad som liknar den naturliga hjärtvävnad arkitektur. Mikrokontakttryckning möjliggör inrättandet av exakta micropatterned protein former som liknar strukturell organisation av hjärtat, vilket ger geometriska ledtrådar för att styra celladhesion rumsligt. Häribeskriver vi vår strategi för isolering av högrenade hjärtmuskelceller från pluripotenta stamceller differentierar in vitro generering av ytor celltillväxt micropatterned med extracellulära matrix proteiner och montering av stamceller som härrör hjärtmuskelceller i anisotropisk myokardvävnaden.
Introduction
Trots den senaste tidens framsteg inom medicinsk terapi, förblir avancerad hjärtsvikt en ledande orsak till dödlighet och sjuklighet i den utvecklade världen. Den kliniska syndromet uppstår från en förlust av funktionell myokardial vävnad och därefter en oförmåga hos det sviktande hjärtat att möta metaboliska krav drabbade individer. Eftersom hjärtat har en begränsad regenerativ kapacitet, är autolog hjärttransplantation den enda nuvarande kliniskt accepterade behandling direkt syftar till påfyllning förlorade funktionell hjärtvävnad. Betydande nackdelar med hjärttransplantation, inklusive ett begränsat antal givare hjärtan och behovet av långvarig immunosuppressiv behandling, utesluter utbredd användning av denna terapi. Som ett resultat av detta har medicinsk behandling varit grunden för behandling av patienter med hjärtsjukdom. En stor utmaning inom läkemedelsutveckling är att identifiera cellulära analyser som noggrant rekapitulera normal och sjuk hjärtinfarkt fysiologi in vitro.
Den senaste konvergens stamcellsbiologi och tissue engineering teknik väcker nya lovande möjligheter för hjärt förnyelse. Generera funktionell myokardiell vävnad från en förnybar patientspecifik källa skulle vara ett stort framsteg inom området. Detta skulle göra det möjligt att utveckla sjukdomen specifika cellulära analyser för läkemedelsutveckling och upptäckter och skulle lägga grunden för hjärt regenerativ medicin. Mänskliga embryonala stamceller (ES-celler) och, viktigare, mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (IPS) celler utgör en potentiellt förnybar patientspecifik källa av celler ventrikulära stamceller och mogna myocyter ventrikulära. Kombinationen av stamcellsbiologi och vävnad strategier teknik löser detta problem genom att skapa funktionella hjärtvävnad in vitro som kan användas i utvecklingen av cellulära analyser för läkemedelsutveckling eller hjärt regenerativa metoder för behandling av avancerad hjärtsvikt.
_content "> En central utmaning i hjärt regenerering har varit identifieringen av en optimal celltyp. Ett brett spektrum av celler har studerats 1, men hittills, även om olika multipotenta kardiogena prekursorer från olika källor har upptäckts, identifiering av en cell källa som uppfyller kritiska krav såsom engagemang för myogena cellöde har underhållet av förmågan att expandera in vivo eller in vitro och sammansättning till en funktionell myokardvävnaden visat sig vara ett centralt problem 2. Vi har tidigare beskrivit en dubbel transgen mus systemet som möjliggör isolering av höggradigt renade populationer av engagerade stamfäder ventrikulära (CVP) från ES-celler differentierar in vitro. Vi genererade en ny dubbel transgen mus som uttrycker den röda fluorescerande proteinet dsRed under kontroll av en Isl1-beroende förstärkare av MEF2c genen och den förbättrade grönt fluorescerande protein under kontroll avhjärt-specifika Nkx2.5 förstärkare. Baserat på denna tvåfärgade fluorescerande reportersystem, första och andra hjärta fältet stamfäder från u ES-celler kan isoleras med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) enligt deras uttryck av MEF2c och Nkx2.5 gener. CVP likna hjärtmyocyter baserade på uttrycket mönster myokardiala markörer och strukturella och funktionella kvaliteter 3, vad erbjuder mycket lovande för hjärt ändamål vävnadsregenerativa.Även om det har varit många framsteg inom tissue engineering, imitera naturliga cellulära arkitektur är fortfarande en viktig utmaning. Konventionella metoder för att hantera denna utmaning ingår sådd biologiska eller syntetiska ställningar med celler in vitro. På grund av ett antal nackdelar av byggnadsställningar, inklusive snabb nedbrytning, begränsad fysisk och mekanisk stabilitet och låg celldensitet 1,4,5, har vi försökt att modifiera byggnadsställning-mindre vävnad. AltHough hjärtceller kan ändra sin lokala mikromiljö genom utsöndring av extracellulära matrix proteiner, har de en mer begränsad förmåga att organisera sig för stavformade hjärtmyocyter i frånvaro av extracellulära signaler. Således är en mall som ger celler lämpliga spatiala och biologiska signaler att komponera funktionell myokardvävnaden krävs. Mikrokontakttryckning behandlar denna utmaning genom att tillhandahålla en enkel och billig teknik för att exakt kontrollera cellens form, organisation och funktion 6-8, som alla är avgörande för generering av inriktade funktionell myokardvävnaden. Den innefattar användning av mikrotexturerade polydimetylsiloxan (PDMS) stämplar med funktionen storlekar ned till 2 | im 9 som möjliggör avsättning av extracellulära matrixproteiner på PDMS substrat i exakta mönster och därmed påverka cellvidhäftning rumsligt.
Häri föreslår vi att kombinera teknik vävnad bioteknik med stam celL biologi att generera anisotropa funktionell myokardvävnaden. Därför visar vi här vår nyligen publicerade tillvägagångssätt för följande: (1) generering av micropatterned protein ytor på PDMS substrat genom mikrokontakttryckning för generering av en mall för alliansfria myokardvävnaden, (2) isolering av högrenade hjärt stamfäder från ES-celler differentiera in vitro, och (3) en kombination av båda teknikerna för att generera inriktade funktionell myokardvävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet för att generera inriktade funktionell myokardvävnaden kan delas in i tre större delar. Tillverkningen av micropatterned mästare med mjuk litografi teknik är inte som en del av följande protokoll men kan göras baserat på etablerad metod 6.
1. Microcontact Utskrift av fibronektin på PDMS Substrat
- Blanda Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS elastomer vid en 10:01 bas härdare förhållandet och lufta den enheten med hjälp av en exsickator för att eliminera eventuella luftbubblor.
- Cure PDMS mot en tidigare tillverkad master med 20 um bred och 2 pm höga åsar, åtskilda av 20 um mellanrum för antingen 2 dagar vid rumstemperatur eller 4 timmar vid 65 ° C för att erhålla mikrotexturerade PDMS frimärken.
* Härdning i exsickator rekommenderas för att eliminera eventuella luftbubblor.
- Spin päls PDMS på glas täckglas (t.ex.22x22 mm) vid 5.000 rpm i 2 minuter med hjälp av en Coater Headway Spin för att producera tunt och jämnt PDMS substrat av 15 um tjocklek.
- Rengör frimärken med 70% etanol för att ta bort damm och smutspartiklar. Låt dem lufttorka.
* Frimärken kan användas flera gånger, men förnyar PDMS frimärken regelbundet rekommenderas på grund av en yta nötning över tiden.
- Placera frimärken i en SPI-Plasma-Prep II Plasma Cleaner och process för 1 min vid 275 mTorr att göra PDMS ytor hydrofila.
* Syre plasmabehandling bör övervakas. Längre behandlingstider kan resultera i sprickbildning i elastomeren.
- Sterilisera stämplar med 70% etanol under 1 minut. Torkar snabbt med tryckluft.
* Ytterligare åtgärder bör utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp för att bibehålla sterilitet.
- Täck stämpla ytor med Fibronectin lösning (50 | ig / ml i DDH 2 O). Låt det adsorbera minst 10 min.
- Skaka av Fibronektin lösning från frimärken och torka snabbt med tryckluft.
- Upprätta konform kontakt mellan stämplar och PDMS substrat i 2 min och tryck till.
- Skölj micropatterned substrat med DDH 2 O. Förvara dem i DDH 2 O för högst 2 veckor vid 4 ° C om inte ursprungligen användes. Förvara PDMS frimärken i DDH 2 O.
2. Underhåll av Double Transgena embryonala stamcellslinjer
Först framställa följande media för ES odling musceller:
Mus embryonala fibroblast (MEF)-medium: Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), 10% fetalt bovint serum (FBS) ES-cell-eller differentiering-grad, 1% penicillin-streptomycin (P / S)
Embryonala stamceller (ESC)-medium: DMEM, 15% FBS ES-cell-grade,1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% leukemiinhibitorisk faktor (LIF), 0,0007% 2-merkaptoetanol (2-ME)
- Coat 6-brunnars plattor med steril 0,1% gelatin i DDH 2 O och låt den adsorbera 15 min vid 37 ° C.
- Lägg MEF från en tinad alikvot till 50 ml PBS i ett koniskt rör och centrifugera dem vid 1.000 rpm under 5 minuter. Återsuspendera MEF i MEF-medium.
- Efter adsorption, aspirera överskott Gelatin och lägga MEF i brunnarna. Tillåt MEF 1 dag att fästa.
* En alikvot av 10 miljoner MEF räcker för 3 6-brunnsplattor.
- När MEF har fäst, lägger ES-celler från en tinad alikvot till 50 ml PBS i ett koniskt rör och centrifugera dem vid 1.000 rpm under 5 minuter. Återsuspendera ES-celler i ESC-medium och lägga till dem i brunnarna innehåller MEF. Kultur ES-celler i ESC-medium tills konfluens nås.
* När ES-celler har nått konfluens, är passage requIRED att undvika överväxt och upprätthålla kolonier ES cell.
- Förbered ES-cellerna för passage. Sug ESC-medium och tvätta en gång med steril PBS.
- Aspirera PBS och tillsätt 500 pl trypsin. Process 3,5 min vid 37 ° C.
- Pipettera trypsinlösning upp och ner flera gånger för att bryta ner kolonier ES celler och neutralisera den med 500 ul ESC-medium.
- Passage ES-celler enligt önskad kvot, t.ex. överföring 33 ul till annan väl med tidigare framställda MEF till passagen 1/30. Upprätthålla ES-celler i ESC-medium.
* En passage förhållande av 1/30 tillåter ES-celler att nå sammanflytning inom 3 dagar. Passage ES-celler enligt din in vitro-differentiering schema.
3. In vitro differentiering av Double Transgena embryonala stamcellslinjer och isolering och sådd av Cardiac stamceller
Först förbereda following material som krävs för in vitro-differentiering av ES-celler:
Anpassning-medium: Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM), 15% FBS ES-cell-grad, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME
Differentiering-Medium: IMDM, 15% FBS Differentiering-klass. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% av 0,1 M askorbinsyra, 0,0007% 2-ME
- Start in vitro differentiering när ES-celler har nått konfluens. Coat 10 cm odlingsskålar med steril 0,1% gelatin i DDH 2 O och låt den adsorbera 15 min vid 37 ° C.
* Var medveten om hur länge in vitro differentiering processen. Det tar 8 dagar tills hjärt progenitorer kan isoleras. Planera dina experiment därefter.
- Harvest ES-celler som tidigare. Efter adsorption, aspirera överskott Gelatin och tillsätt ungefär 1/3-1/2 av ES cellsuspensionen berett kulturrätter innehållande Anpassning-medium. Kultur celler för 2 dagar.
* Välj den mängd av ES-celler för anpassning enligt dina experiment.
- Skörd anpassad ES-celler i en 50 ml koniskt rör innehållande PBS med 1. 5 ml trypsin. Centrifugera dissocierade ES-celler vid 1.000 rpm under 5 minuter och återsuspendera dem i differentiering-mediet.
- Gör embryoidkroppar (EBS) av ca 1.000 celler per 10 pl droppe i 15 skålar cm kultur med en flerkanalig pipett. Vänd plattorna och kultur EbS som hängande droppar i 2,5 dagar vid 37 ° C.
- Efter 2,5 dagar, pool EBs av 6-8 15 rätter cm kultur i en med Differentiering-medium och kultur under ytterligare 3,5 dagar vid 37 ° C.
- Efter 3,5 dagar, samla strandsandaler ett koniskt 50 ml rör och låt dem sjunka till botten under cirka 5 minuter. Suga upp supernatanten och tvätta EBS med steril PBS. Låt EB sjunka igen till botten för caoximately 5 minuter.
- Dissociera EB genom att bearbeta dem med 2. 5 ml trypsin under 2 min i ett vattenbad vid 37 ° C, skaka röret mjukt. Lägg sedan till 2. 5 ml steril PBS till trypsinlösning och pipettera upp och ned med en 10 ml serologisk pipett cirka 8-10 gånger för att bryta ned cellkluster. Neutralisera Trypsin med 10 ml FACS-buffert innehållande 7,5% FBS ES-cell-eller differentiering-kvalitet och 0,01% DAPI i PBS.
- Centrifugera dissocierad EBs vid 1.000 rpm under 5 minuter och återsuspendera dem i ca 1 ml FACS-buffert. Pipettera upp och ned med en 1 ml pipett ungefär 8-10 gånger för att bryta ned cell kluster.
* Lägg FACS buffert enligt den uppskattade mängden dissocierade EBS. Alltför koncentrerade celler kan täppa vid FACS och alltför låga koncentrerade celler kan förlänga FACS tid i onödan.
- Överför celler till en steril rundkolv rör med en 35 | im cellfilter att erhållaen enkelcellsuspension.
- Sortera differentierade ES-celler med hjälp av en FACSAria flödescytometer och få renade populationer av CVP.
* Vi utvecklade ett flera steg slussning strategi att isolera höggradigt renade färgade celler. I korthet, vi första porten på Forward Scatter Amplitud (FSC-A) och Side Scatter Amplitud (SSC-A) (Figur 1A). Detta tillåter oss att skilja hela celler från cellrester. Vi sedan grind på FSC-A och Forward Scatter Bredd (FSC-W) (Figur 1B). Detta tillåter oss att isolera celler undertröjor från dubbletter och andra cellulära aggregat. Vi sedan gate på SSC-A och Side Scatter Bredd (SSC-W) (Figur 1C). Detta ökar renheten av cell undertröjor. Vi sedan gate på DAPI färgning för att isolera viabla celler (DAPI-negativ) från icke-viabla celler (figur 1D). Vi sedan gate på Phycoeryhthrin Amplitude (PE-A) och PE-cyaninfärgämne 7 Amplitud (PE-Cy7-A) för att erhålla sann röd-positiva (R + -) celler och att utesluta autofluorescerande röd-negativa celler (Figur 1E). R + och R - celler är sedan gated separat på Fluoresceinisotiocyanat Amplitud (FITC-A) och PE-A för att sortera True Green-positiva (G +) och äkta grön-negativa (G -) celler i dessa populationer (figur 1F + 1G). Detta resulterar i 4 populationer av celler enligt följande: R + G +, R + G -, R - G + och R - G - (figur 1H).
- Passivera micropatterned substrat med 1% Pluronic F-127 i DDH 2 O under 10 min. Sedan tvätta dem 3x med steril PBS.
* Pluronic F-127 är en surfaktant som blockerar celladhesion. Den stöder inneslutning av celladhesion till micropatterned område.
- Fäst PDMS packningar runt den mönstrade regionenoch tryck till. Därefter, frö CVP på fibronektin micropatterned substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-rening av in vitro differentierade ES-celler avslöjade fyra distinkta populationer av ursprungsceller (figur 1). Närvaron av micropatterned Fibronektin bekräftades genom immunofluorescens-mikroskopi som visade en fullständig överföring av kontinuerliga linjer fibronektin (Figur 2). Plätering av FACS-isolerade progenitorer PÅ fibronektin micropatterns resulterade i inriktning av R + G + och en del av R - G + populationer. Även Pluronic F-127 som en stödjande blockerare av celladhesion användes, R + G - och R - G - gjorde populationer respekterar inte den anisotropa arkitektur fibronektin och växte in i utrymmet mellan angränsande protein linjer (Figur 3).
Figur 1. Represe ntative flödescytometri diagram av dagen 6 in vitro differentierade ES-celler. (A) Gating på Forward Scatter Amplitud (FSC-A) och Side Scatter Amplitud (SSC-A). (B) Gating på FSC-A och Forward Scatter Bredd ( FSC-W). (C) Gating på SSC-A och Side Scatter Bredd (SSC-W). (D) Gating på DAPI färgning. (E) Gating för Phycoeryhthrin (PE) och PE-cyaninfärgämne 7 (PE- Cy7) (F och G) gating för fluoresceinisothiocyanat Amplitud (FITC-A) och PE-A (H) Flödescytometri tomt avslöjar fyra distinkta populationer av ursprungsceller:.. R + G +, R + G -, R - G + och R - G -. Klicka här för att se större bild .
fig2.jpg "alt =" Bild 2 "/>
Figur 2. Representativ immunofluorescensmikroskopi av micropatterned fibronektin substrat. Skalfält, 80 um.
Figur 3. Representativa immunofluorescensmikroskopi av embryonal-(A) och ES-cellerna (B) FACS-isolerade stamceller efter ytterligare 5 dagars odling på fibronektin micropatterns kärnor, blå,. SmMHC, röd, sarkomeriskt α-aktinin, grön. Skala bar, 40 um. Reproduceras från Domian et al. (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll presenterade vi en metod för att isolera renade populationer av kardiogena föregångare och frö dem på micropatterned fibronektin substrat vad ger dem anpassa och ta en hjärt myocyt-liknande stav form. Normal cellulär organisation är kritisk för normal vävnad funktion 8,10, i synnerhet för myokardial vävnad. Hjärtmyocyter har visat att utveckla förbättrade mekaniska 11,12 och elektrofysiologiska egenskaper 11,13 vid bildandet anisotropa cell arrayer. Eftersom hjärt progenitorer odlade på micropatterned fibronektin substrat differentierar till stavformade myokardiala celler in vitro, är detta apivotal steg inom hjärtvävnaden bioteknik.
Mikrokontakttryckning är en enkel och billigt verktyg som kan användas för att generera 2-dimensionella mallar liknar myokardial vävnad in vitro. Men effektiv och framgångsrik mönstring av utvinningellular matrisproteiner bygger kritiskt på proteinet val. En stor mängd olika proteiner har framgångsrikt stämplat på PDMS substrat, vissa proteiner, såsom kollagen typ I, kräver ytmodifiering av PDMS substrat före mikrokontakttryckning 14. Dessutom, kan mängden av tryck som appliceras på stämpeln liksom varaktigheten av stansningen också kraftigt påverka effektiviteten och noggrannheten i mikrokontakttryckning.
En annan avgörande steg i detta protokoll är användningen av en plasma renare för att göra ytor PDMS frimärken hydrofila. Det är väl känt att mikrokontakttryckning inte uppstår när både PDMS frimärken och substrat inte genomgår behandling syreplasma 15, och flera grupper fann att trimma vätbarheten av PDMS substrat krävs för att göra en överföring av protein möjligt 3,6 , 15. Vi fann emellertid att öka hydrofiliciteten hosPDMS stämpel i stället för PDMS substrat resulterar i mer enhetliga protein micropatterns med högre kvalitet, såsom mindre störande eller ofullständig protein linjer.
För presenterade protokollet var micropattern bredd av 20 um väljs, enligt den rapporterade cellbredden av murina neonatala hjärtmyocyter 16. Bör dock tillverkningen av micropatterns utföras på en art-och hjärt utvecklingsstadium-beroende 16-20 sätt för att förhindra motsatta effekter på cellviabilitet på grund av begränsat utrymme.
Upptäckten och rening av ES-cellerna CVP, särskilt R + G + befolkningen, möjliggör tillförlitliga studier inom hjärtvävnaden bioteknik. Särskilt har vi observerat vår ES-cellerna hjärt föregångare för att kunna bilda avtalsslutande hjärtmuskelvävnad med att upprätthålla sin cellulära inriktning. Med tanke på att konstruera tredimensionella funktionellavävnad är ett centralt mål inom mjukpapper bioteknik, kan vår genererade tvådimensionell anisotropa myokardvävnaden användas effektivt för lager flera cellskikt, som andra grupper tidigare beskrivits för andra celltyper 21,22. Dock hittills, är en begränsning av den transgena reportersystem resultatet av in vitro-differentiering av ES-celler. FACS finns CVP, särskilt starkt kardiogen R + G + befolkningen, utgör för närvarande en ungefärlig genomsnitt 0,5% av alla differentierade celler. Således, förbättra in vitro-differentiering av ES-celler i CVP kommer att vara ett stort steg mot att generera tillräckliga mängder CVP för att bygga större anisotropa hjärtvävnad bestående av längsgående linje myokardiella fibrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete utfördes delvis vid Centrum för Nanoscale Systems (CNS), en medlem av National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN), som stöds av National Science Foundation i NSF utmärkelsen nej. ECS-0.335.765. CNS är en del av Harvard University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
