Summary
गठबंधन दौरे के ऊतकों की पीढ़ी चिकित्सकीय उपयोगी प्रयोजनों के लिए स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों के अनुकूल ढालने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है. के साथ साथ हम सेल आकार और समारोह के सटीक नियंत्रण के लिए एक microcontact मुद्रण दृष्टिकोण का वर्णन करता है. हृदय progenitors व्युत्पन्न भ्रूण स्टेम सेल के उच्च शुद्ध आबादी का उपयोग करना है, हम तो anisotropic कार्यात्मक दौरे ऊतक उत्पन्न करते हैं.
Abstract
उन्नत दिल की विफलता एक प्रमुख unmet नैदानिक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है, व्यवहार्य और / या पूरी तरह कार्यात्मक हृदय की मांसपेशी कोशिकाओं के नुकसान से उत्पन्न होने वाली है. इष्टतम दवा चिकित्सा के बावजूद, दिल की विफलता और विकसित दुनिया में मृत्यु दर और रुग्णता का एक प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करता है. नशीली दवाओं के विकास में एक प्रमुख चुनौती सेलुलर assays की पहचान सही है कि सामान्य और रोगग्रस्त इन विट्रो में मानव दौरे शरीर क्रिया विज्ञान पुनरावृत्ति करना है. इसी तरह, पुनर्योजी हृदय जीव विज्ञान में प्रमुख चुनौतियों की पहचान और नैदानिक प्रासंगिक मात्रा में रोगी विशेष के हृदय progenitors के अलगाव के आसपास घूमता है. इन कोशिकाओं को फिर कार्यात्मक ऊतक कि देशी हृदय के ऊतकों वास्तुकला microcontact मुद्रण सटीक micropatterned प्रोटीन आकार है कि दिल के संरचनात्मक संगठन सदृश के निर्माण के लिए अनुमति देता है जैसा दिखता में इकट्ठे हो सकता है, इस तरह ज्यामितीय cues प्रदान करने के लिए सेल आसंजन spatially नियंत्रित है. यहाँहम अत्यधिक pluripotent स्टेम कोशिकाओं से इन विट्रो, सेल विकास कोशिकी मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ micropatterned सतहों की पीढ़ी में फर्क myocardial कोशिकाओं शुद्ध अलगाव के लिए हमारे दृष्टिकोण का वर्णन है, और स्टेम सेल व्युत्पन्न anisotropic दौरे के ऊतकों में हृदय की मांसपेशी कोशिकाओं के विधानसभा.
Introduction
चिकित्सा उपचार में हाल के अग्रिमों के बावजूद, उन्नत दिल की विफलता और विकसित दुनिया में मृत्यु दर और रुग्णता का एक प्रमुख कारण बनी हुई है. नैदानिक सिंड्रोम कार्यात्मक दौरे के ऊतकों का नुकसान और बाद में असफल दिल की अक्षमता प्रभावित व्यक्तियों की चयापचय की मांग को पूरा करने से उठता है. चूंकि दिल एक सीमित पुनर्योजी क्षमता है, ऑटोलॉगस हृदय प्रत्यारोपण केवल वर्तमान चिकित्सकीय स्वीकार किए जाते हैं सीधे खो कार्यात्मक हृदय के ऊतकों भरपाई उद्देश्य चिकित्सा है. हृदय प्रत्यारोपण के दाता दिल की एक सीमित संख्या और की जरूरत है, लंबी अवधि के immunosuppressive चिकित्सा के लिए इस चिकित्सा के व्यापक प्रसार का उपयोग बंद करना सहित महत्वपूर्ण कमियां है,. एक परिणाम के रूप में, चिकित्सा उपचार उपचार का मुख्य आधार हृदय रोग के साथ रोगियों के लिए किया गया है. नशीली दवाओं के विकास में एक प्रमुख चुनौती सेलुलर assays की पहचान सही है कि इन विट्रो में सामान्य और रोगग्रस्त दौरे शरीर क्रिया विज्ञान पुनरावृत्ति करना है.
स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी के हाल ही में अभिसरण हृदय उत्थान के लिए नए होनहार रास्ते उठाती है. रोगी विशेष के एक अक्षय स्रोत से उत्पन्न कार्यात्मक दौरे के ऊतकों के क्षेत्र में एक प्रमुख अग्रिम होगा. यह रोग दवा के विकास और खोज के लिए विशिष्ट सेलुलर assays के विकास के लिए अनुमति देते हैं और हृदय पुनर्योजी चिकित्सा के लिए नींव रखना होगा. मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) और, अधिक महत्वपूर्ण है, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) के एक संभावित अक्षय ventricular पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और परिपक्व वेंट्रिकुलर myocytes रोगी विशेष के स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों के संयोजन इन विट्रो में कार्यात्मक हृदय के ऊतकों है कि दवाओं की खोज के लिए या उन्नत दिल की विफलता के उपचार के लिए हृदय पुनर्योजी दृष्टिकोण में सेलुलर assays के विकास में इस्तेमाल किया जा सकता है पैदा करके इस समस्या को संबोधित है.
_content "> हृदय उत्थान में एक केंद्रीय चुनौती एक इष्टतम सेल प्रकार की पहचान किया गया है कोशिकाओं की एक विस्तृत सरणी 1 किया गया अध्ययन किया है, लेकिन तारीख करने के लिए, हालांकि विभिन्न स्रोतों से अलग multipotent हृदयजनित व्यापारियों की खोज की गई है, एक सेल की पहचान. स्रोत है कि myogenic सेल भाग्य की प्रतिबद्धता के रूप में इस तरह के महत्वपूर्ण आवश्यकताओं को पूरा, vivo में या इन विट्रो और संरचना में एक कार्यात्मक दौरे के ऊतकों का विस्तार करने की क्षमता के रखरखाव के लिए एक केंद्रीय 2 समस्या साबित हो गया है, हम पहले एक डबल ट्रांसजेनिक murine प्रणाली का वर्णन किया है. कि हम एक उपन्यास डबल ट्रांसजेनिक माउस कि MEF2c जीन की एक Isl1 निर्भर बढ़ाने की नियंत्रण के तहत लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन dsRed व्यक्त उत्पन्न और अत्यधिक ES इन विट्रो में फर्क कोशिकाओं से प्रतिबद्ध वेंट्रिकुलर progenitors (CVP) की आबादी को शुद्ध करने के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है. के नियंत्रण के तहत बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीनहृदय विशिष्ट Nkx2.5 बढ़ाने. इस दो रंग फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रणाली, ES कोशिकाओं के विकास से पहली और दूसरी दिल क्षेत्र progenitors प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल उनकी अभिव्यक्ति MEF2c और Nkx2.5 जीन के अनुसार क्रमित कर रहा है (FACS) के माध्यम से अलग किया जा सकता है के आधार पर. CVP हृदय myocytes दौरे मार्करों और संरचनात्मक और कार्यात्मक गुण 3, क्या हृदय ऊतक पुनर्योजी प्रयोजनों के लिए महान वादा करता है की अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर समान है.हालांकि वहाँ ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में बहुत प्रगति कर दिया गया है, मूल सेलुलर वास्तुकला की नकल उतार एक प्रमुख चुनौती बनी हुई है. पारंपरिक तरीकों को इस चुनौती का पता कर इन विट्रो में कोशिकाओं के साथ बोने जैविक या सिंथेटिक scaffolds शामिल हैं. तेजी से गिरावट, सीमित शारीरिक और यांत्रिक स्थिरता और कम सेल घनत्व 1,4,5 सहित scaffolds के नुकसान की एक संख्या के कारण, हम पाड़ कम ऊतक इंजीनियर करने का प्रयास किया है. Although हृदय कोशिकाओं कोशिकी मैट्रिक्स प्रोटीन का स्राव को उनके स्थानीय microenvironment संशोधित कर सकते हैं, वे एक और अधिक सीमित खुद कोशिकी cues के अभाव में छड़ी के आकार हृदय myocytes व्यवस्थित करने की क्षमता है. इस प्रकार, एक टेम्पलेट है कि कोशिकाओं उपयुक्त स्थानिक और जैविक कार्यात्मक दौरे के ऊतकों रचना cues प्रदान की आवश्यकता है. Microcontact मुद्रण एक साधारण और कम खर्चीली तकनीक ठीक सेल आकार, संगठन, और 6-8 समारोह, जो सभी के गठबंधन कार्यात्मक दौरे के ऊतकों की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण हैं को नियंत्रित प्रदान करके इस चुनौती पते. यह सुविधा के आकार के साथ microtextured polydimethylsiloxane (PDMS) 2 9 सुक्ष्ममापी है कि सटीक पैटर्न में PDMS substrates पर कोशिकी मैट्रिक्स प्रोटीन के बयान सक्षम है और इस तरह सेल आसंजन spatially प्रभावित करने के लिए नीचे लेकर टिकटों का उपयोग शामिल है.
के साथ साथ, हम स्टेम सेल के साथ ऊतक bioengineering प्रौद्योगिकी गठबंधन का प्रस्तावएल जीव विज्ञान anisotropic कार्यात्मक दौरे ऊतक उत्पन्न करने के लिए. तदनुसार, हम यहाँ हमारे निम्नलिखित के लिए हाल ही में प्रकाशित एक दृष्टिकोण का प्रदर्शन: (1) microcontact मुद्रण, गठबंधन दौरे के ऊतकों के लिए एक टेम्पलेट के उत्पादन के लिए substrates पर PDMS micropatterned प्रोटीन सतहों की पीढ़ी (2) अत्यधिक से हृदय progenitors शुद्ध अलगाव ES कोशिकाओं इन विट्रो में फर्क है, और (3) दोनों तकनीकों के संयोजन उत्पन्न करने के लिए कार्यात्मक दौरे के ऊतकों गठबंधन.
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Protocol
गठबंधन कार्यात्मक दौरे ऊतक उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल के तीन प्रमुख भागों में बांटा जा सकता है. micropatterned नरम लिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग करते हुए गुरु के निर्माण निम्नलिखित प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं माना जाता है लेकिन स्थापित 6 विधि के आधार पर बनाया जा सकता है.
1. Fibronectin substrates पर PDMS microcontact मुद्रण
- एजेंट अनुपात और degas किसी भी हवाई बुलबुले को खत्म करने के लिए एक desiccator का उपयोग कर विधानसभा के इलाज के लिए एक 10:1 आधार पर Sylgard 184 (डॉव Corning) PDMS elastomer मिक्स.
- PDMS 20 मीटर चौड़ा और 2 मीटर लंबा लकीरें के साथ पहले से गढ़े मास्टर, या तो कमरे या 65 डिग्री सेल्सियस पर microtextured PDMS टिकटों को प्राप्त करने के लिए 4 घंटे के तापमान पर 2 दिनों के लिए 20 सुक्ष्ममापी रिक्ति द्वारा अलग खिलाफ इलाज.
* एक desiccator में इलाज अत्यधिक किसी भी हवाई बुलबुले को खत्म करने की सिफारिश की है.
- गिलास को कवर फिसल जाता है (उदाहरण के लिए पर स्पिन कोट PDMS2 मिनट के लिए एक प्रगति स्पिन coater का उपयोग करने के लिए और यहां तक कि 15 माइक्रोन मोटाई की पतली PDMS substrates उत्पादन 5,000 rpm पर 22x22 मिमी).
- 70% इथेनॉल के साथ टिकटों को साफ करने के लिए धूल और धूल के कणों को निकालने के. चलो उन्हें शुष्क हवा.
* टिकटों कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, एक नियमित आधार पर PDMS टिकटों renewing समय पर एक सतह घर्षण के कारण की सिफारिश की है.
- एक SPI प्लाज्मा प्रेप द्वितीय प्लाज्मा और 275 mTorr 1 मिनट के लिए क्लीनर प्रक्रिया में जगह टिकटों PDMS सतहों हाइड्रोफिलिक रेंडर करने के लिए.
* ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार देखा जाना चाहिए. लंबे समय तक इलाज समय elastomer के खुर में परिणाम कर सकते हैं.
- 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ टिकटों जीवाणुरहित. संपीड़ित हवा के साथ जल्दी सूख.
* कदम आगे एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए बाँझपन बनाए रखने के.
- एफ के साथ सतहों पैर पटकाना कवरibronectin समाधान (50 / DDH 2 हे में ग्राम मिलीलीटर). यह कम से कम 10 मिनट के सोखना चलो.
- टिकटों से Fibronectin समाधान हिला और संपीड़ित हवा के साथ जल्दी से सूखी.
- 2 मिनट के लिए टिकटों और PDMS substrates के बीच conformal संपर्क स्थापित करने और दृढ़ता से दबाएँ.
- DDH 2 ओ के साथ micropatterned substrates कुल्ला DDH 2 हे में उन्हें 4 में 2 सप्ताह के अधिकतम ° C जब तक शुरू में इस्तेमाल के लिए स्टोर. DDH 2 ओ में स्टोर PDMS टिकटों
2. डबल ट्रांसजेनिक भ्रूण स्टेम सेल लाइनों का रखरखाव
सबसे पहले, संवर्धन माउस ES कोशिकाओं के लिए निम्नलिखित मीडिया तैयार:
माउस भ्रूणीय (MEF) तंतुकोशिका मध्यम: Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) ES सेल या भेदभाव ग्रेड, 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस)
भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) के मध्यम: DMEM, 15% FBS ES सेल ग्रेड,1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), 0.5% पी / एस, 0.2% लेकिमिया निरोधात्मक फैक्टर) (lif, .०,००७% 2 Mercaptoethanol (2-ME)
- कोट बाँझ DDH 2 हे में 0.1% जिलेटिन और 37 पर यह सोखना 15 मिनट डिग्री सेल्सियस के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें
- एक thawed अशेष भाजक से 50 मिलीलीटर पीबीएस MEFs एक शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें और उन्हें 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र. MEF मध्यम Resuspend MEFs.
- सोखना, अतिरिक्त Aspirate जिलेटिन और कुओं में जोड़ MEFs के बाद. MEFs 1 दिन करने की अनुमति देते हैं.
* 10 लाख से 3 6 अच्छी तरह प्लेटें लिए MEFs suffices अशेष भाजक.
- जब MEFs संलग्न है, एक शंक्वाकार ट्यूब में एक thawed अशेष भाजक से 50 मिलीलीटर पीबीएस ES कोशिकाओं जोड़ने और उन्हें 5 मिनट के लिए 1,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. Resuspend ESC मध्यम और उन्हें MEFs युक्त कुओं को जोड़ने में ES कोशिकाओं. ESC माध्यम में संस्कृति ES कोशिकाओं संगम तक पहुँच जाता है.
* एक बार ES कोशिकाओं संगम तक पहुँच चुके हैं, passaging है required के अतिवृद्धि से बचने और ES सेल कालोनियों को बनाए रखने.
- Passaging के लिए तैयार ES कोशिकाओं. Aspirate ESC मध्यम और धो बाँझ पीबीएस के साथ एक बार.
- पीबीएस Aspirate और ट्रिप्सिन की 500 μl जोड़ें. प्रक्रिया 37 में 3.5 मिनट ° सी.
- ट्रिप्सिन समाधान विंदुक ऊपर और नीचे कई बार करने के लिए नीचे ES सेल कालोनियों को तोड़ने यह ESC माध्यम के 500 μl के साथ बेअसर.
- पारित होने के अपने वांछित अनुपात के अनुसार ES कोशिकाओं, उदाहरण के हस्तांतरण के साथ एक और अच्छी तरह से करने के लिए 33 μl पहले 1/30 पारित होने के लिए तैयार MEFs. ESC मध्यम में ES कोशिकाओं को बनाए रखने.
* / 1 30 के एक मार्ग अनुपात ES कोशिकाओं को 3 दिनों के भीतर संगम तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है. पारित होने ES कोशिकाओं अपने में इन विट्रो भेदभाव अनुसूची के अनुसार.
3 डबल ट्रांसजेनिक भ्रूण स्टेम सेल लाइन्स और अलगाव और कार्डिएक progenitors के सीडिंग की इन विट्रो में भेदभाव
सबसे पहले, followi तैयारएनजी मीडिया ES कोशिकाओं के इन विट्रो में भेदभाव के लिए आवश्यक:
अनुकूलन मध्यम: Iscove संशोधित Dulbecco (IMDM) मध्यम, 15% FBS ES सेल ग्रेड 1% NEAA, 0.5% पी / एस, 0.2% LIF, .०,००७% 2 ME-
भेदभाव मध्यम: IMDM, 15% FBS भेदभाव ग्रेड. 1% NEAA, 0.5% पी / एस 0.1M Ascorbic एसिड के 0.35%, 0.०,००७% 2 इ
- इन विट्रो में भेदभाव शुरू जब ES कोशिकाओं संगम तक पहुँच चुके हैं. कोट बाँझ DDH 2 हे में 0.1% जिलेटिन और 37 पर यह सोखना 15 मिनट डिग्री सेल्सियस के साथ 10 सेमी संस्कृति व्यंजन
* में इन विट्रो भेदभाव प्रक्रिया की अवधि के बारे में पता है. यह 8 दिन लगते हैं जब तक हृदय progenitors अलग किया जा सकता है. अपने प्रयोगों की योजना के अनुसार.
- हार्वेस्ट ES कोशिकाओं के रूप में पहले. सोखना, Aspirate अतिरिक्त जिलेटिन के बाद और संस्कृति के लिए तैयार ES सेल निलंबन के लगभग 1/3-1/2 जोड़नेअनुकूलन मध्यम युक्त व्यंजन. 2 दिनों के लिए संस्कृति कोशिकाओं.
ES कोशिकाओं के अनुकूलन के लिए अपने प्रयोगों के अनुसार राशि चुनें.
- हार्वेस्ट एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार 1 का उपयोग पीबीएस युक्त ट्यूब में ES कोशिकाओं रूपांतरित किया. ट्रिप्सिन की 5 मिलीग्राम. 5 मिनट के लिए 1,000 rpm dissociated ES कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और उन्हें भेदभाव मध्यम में resuspend.
- 15 सेमी संस्कृति व्यंजन में 10 μl ड्रॉप के अनुसार लगभग 1000 कोशिकाओं की embryoid (यूके) शरीर एक मल्टी चैनल विंदुक का उपयोग. 2.5 दिनों के लिए बूंदों को फांसी के रूप में 37 में संस्कृति और ईबीएस प्लेटें पलटना ° सी.
- 2.5 दिनों के बाद, पूल और 3.5 दिनों के लिए 37 पर एक भेदभाव मध्यम और उन्हें संस्कृति ° सी. का उपयोग कर में 6-8 15 सेमी संस्कृति व्यंजन की ईबीएस
- 3.5 दिनों के बाद, एक शंक्वाकार 50 मिलीलीटर ट्यूब में ईबीएस इकट्ठा करने और उन्हें लगभग 5 मिनट के लिए नीचे करने के लिए सिंक. तैरनेवाला चूसो और बाँझ पीबीएस के साथ ईबीएस धो लो. ईबीएस appr के लिए नीचे करने के लिए फिर से सिंकoximately 5 मिनट.
- उन्हें 2 के साथ प्रसंस्करण द्वारा ईबीएस अलग कर देना. 37 पर 2 मिनट के लिए एक पानी में स्नान 5 ट्रिप्सिन मिलीलीटर ° C ट्यूब धीरे मिलाते हुए. फिर, 2 जोड़ने के लिए. बाँझ पीबीएस trypsin समाधान के लिए 5 मिलीग्राम और 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ ऊपर और नीचे लगभग 8-10 बार नीचे सेल समूहों को तोड़ने विंदुक. FACS बफर के 10 मिलीलीटर 7.5% FBS ES सेल या भेदभाव ग्रेड और 0.01% पीबीएस में DAPI युक्त ट्रिप्सिन बेअसर.
- 1,000 rpm पर dissociated ईबीएस 5 मिनट के लिए और उन्हें अपकेंद्रित्र FACS बफर के लगभग 1 मिलीलीटर में resuspend. एक 1 मिलीग्राम विंदुक के साथ ऊपर और नीचे लगभग 8-10 बार नीचे सेल समूहों को तोड़ने विंदुक.
* Dissociated ईबीएस की अनुमानित राशि के अनुसार FACS बफर जोड़ें. भी अत्यधिक ध्यान केंद्रित कोशिकाओं FACS दौरान रोकना और भी कम केंद्रित कोशिकाओं FACS समय अनावश्यक लम्बा हो सकता सकता है.
- एक बाँझ ट्यूब दौर नीचे कोशिकाओं को एक 35 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के साथ प्राप्त करने के लिए स्थानांतरणएक एकल कक्ष निलंबन.
- क्रमबद्ध करें विभेदित ES कोशिकाओं एक FACSAria प्रवाह cytometer और शुद्ध CVP की आबादी का उपयोग कर प्राप्त करने के.
* हम एक बहु कदम gating उच्च शुद्ध रंग की कोशिकाओं को अलग करने की रणनीति विकसित की है. संक्षेप में, हम अग्रेषित स्कैटर (FSC-A) आयाम और साइड स्कैटर आयाम (एसएससी-A) (चित्रा 1 ए) पर 1 गेट. यह हमें सेलुलर मलबे से पूरे कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुमति देता है. हम तो FSC-एक और फॉरवर्ड (FSC डब्ल्यू) स्कैटर चौड़ाई (चित्रा 1B) पर फाटक. यह हमें दोहरी और अन्य सेलुलर समुच्चय से सेल singlets को अलग करने के लिए अनुमति देता है. हम तो SSC-एक और साइड (एसएससी डब्ल्यू) स्कैटर चौड़ाई (चित्रा 1C) पर फाटक. यह सेल singlets की शुद्धता बढ़ जाती है. हम तो DAPI पर फाटक अलाभकारी कोशिकाओं (चित्रा 1D) से व्यवहार्य कोशिकाओं (DAPI नकारात्मक) को अलग धुंधला है. हम तो गेट पर (पीई A) Phycoeryhthrin आयाम और पीई Cyanine डाई 7 (पीई Cy7 ए) आयाम सच लाल सकारात्मक (नि. प्राप्त + (आर) और autofluorescent लाल नकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 1E) बाहर. + आर और आर - इन आबादी (चित्रा 1F कोशिकाओं के भीतर + कोशिकाओं आइसोथियोसाइनेट Fluorescein (FITC ए) आयाम और पीई एक सच (जी +) हरी सकारात्मक और सच हरे नकारात्मक सॉर्ट (G) पर तो अलग gated ) 1G. के रूप में 4 कोशिकाओं से आबादी में यह परिणाम है: आर + + जी, आर + जी, आर जी + और आर - जी (1H चित्रा).
- DDH 2 हे में 1% एफ 127 10 मिनट के लिए Pluronic साथ micropatterned substrates passivate. फिर, उन्हें बाँझ पीबीएस के साथ 3x धो लो.
* Pluronic F-127 एक है कि ब्लॉक कोशिका आसंजन surfactant है. यह micropatterned क्षेत्र में कोशिका आसंजन के कारावास का समर्थन करता है.
- नमूनों क्षेत्र के आसपास PDMS gaskets संलग्नऔर दृढ़ता से दबाएँ. फिर, Fibronectin micropatterned substrates पर बीज CVP.
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Representative Results
FACS इन विट्रो विभेदित ES कोशिकाओं में शुद्धि progenitors के चार अलग - अलग आबादी (1 चित्रा) से पता चला. Fibronectin micropatterned की उपस्थिति immunofluorescence माइक्रोस्कोपी है कि निरंतर Fibronectin लाइनों (2 चित्रा) की एक पूरी हस्तांतरण प्रदर्शित द्वारा पुष्टि की गई. जी + आबादी - Fibronectin micropatterns पर FACS पृथक progenitors के चढ़ाना आर + + जी और आर के भाग के संरेखण में हुई. हालांकि Pluronic कोशिका आसंजन की एक सहायक अवरोधक F-127 के रूप में इस्तेमाल किया गया था, + आर जी और आर जी आबादी Fibronectin की anisotropic वास्तुकला का सम्मान नहीं किया था और आसन्न प्रोटीन (3 चित्रा) लाइनों के बीच अंतरिक्ष में हुई.
चित्रा 1. Represe ntative प्रवाह cytometry इन विट्रो विभेदित ES कोशिकाओं में 6 दिन के चार्ट (ए) अग्रेषित स्कैटर (FSC-A) आयाम और साइड स्कैटर आयाम (एसएससी ए) पर Gating. FSC-एक (और स्कैटर चौड़ाई फॉरवर्ड Gating (बी) FSC-W) () सी एसएससी एक और साइड स्कैटर चौड़ाई (एसएससी डब्ल्यू). DAPI धुंधला हो पर Gating (डी) पर Gating. (ई) (पीई) और पीई Cyanine Phycoeryhthrin डाई 7 के लिए Gating (पीई Cy7) (एफ और जी) आइसोथियोसाइनेट Fluorescein (FITC ए) आयाम और पीई () एच प्रवाह cytometry progenitors के चार अलग आबादियों खुलासा साजिश के लिए Gating: आर + + जी, आर + जी, आर जी + और आर - जी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 2. Fibronectin substrates micropatterned के प्रतिनिधि immunofluorescence माइक्रोस्कोपी पैमाने बार, 80 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3. प्रतिनिधि के immunofluorescence माइक्रोस्कोपी भ्रूण (ए) और ES सेल व्युत्पन्न (बी) FACS पृथक progenitors Fibronectin micropatterns पर एक अतिरिक्त संस्कृति के 5 दिनों के बाद नाभिक, नीले, smMHC, लाल, sarcomeric α actinin, हरे. स्केल बार, 40 सुक्ष्ममापी. Domian एट अल (2009) से Reproduced.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम एक विधि प्रस्तुत हृदयजनित progenitors के शुद्ध आबादी को अलग करने और उन्हें micropatterned Fibronectin substrates पर बीज के लिए क्या उन्हें पंक्ति में है और एक हृदय रॉड myocyte तरह आकार लेने की अनुमति देता है. सामान्य सेलुलर संगठन सामान्य ऊतकों 8,10 दौरे के ऊतकों के लिए, विशेष रूप से समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. हृदय myocytes सुधार यांत्रिक 11,12 और electrophysiological गुण 11,13 विकसित जब anisotropic सेल arrays बनाने के लिए दिखाया गया है. चूंकि हृदय पर micropatterned Fibronectin substrates संवर्धित progenitors इन विट्रो में छड़ के आकार दौरे कोशिकाओं में अंतर है, यह हृदय ऊतक bioengineering के भीतर apivotal कदम का प्रतिनिधित्व करता है.
Microcontact मुद्रण एक सरल और सस्ती उपकरण है कि दो आयामी इन विट्रो में दौरे के ऊतकों जैसी टेम्पलेट्स उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, extrac के कुशल और सफल patterningellular मैट्रिक्स प्रोटीन पसंद के प्रोटीन पर गंभीर रूप से निर्भर करता है. जबकि विभिन्न प्रोटीन की एक बड़ी विविधता को सफलतापूर्वक किया गया है पर मुहर लगी PDMS substrates, कोलेजन मैं प्रकार के रूप में कुछ प्रोटीन,, PDMS substrates की सतह संशोधन 14 microcontact मुद्रण के लिए पहले की आवश्यकता है. इसके अलावा, टिकट मुद्रांकन की अवधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लागू दबाव की राशि भी बहुत दक्षता और microcontact मुद्रण की निष्ठा को प्रभावित कर सकते हैं.
इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम एक प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करने के लिए PDMS हाइड्रोफिलिक टिकटों की सतहों को प्रस्तुत करना है. यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि microcontact मुद्रण जब दोनों PDMS टिकटों और substrates ऑक्सीजन प्लाज्मा 15 उपचार, और कई समूहों में पाया गया कि PDMS substrates के wettability ट्यूनिंग के क्रम में प्रोटीन का एक 3,6 संभव बनाने के हस्तांतरण की आवश्यकता है गुजरना नहीं घटित नहीं करता है 15. हालांकि, हमने पाया है कि hydrophilicity में वृद्धिउच्च गुणवत्ता के साथ और अधिक समान प्रोटीन कम विघटनकारी या अधूरा प्रोटीन लाइनों के रूप में, micropatterns में PDMS सब्सट्रेट परिणामों के बजाय PDMS स्टाम्प.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए, 20 सुक्ष्ममापी की micropattern चौड़ाई रिपोर्ट murine नवजात हृदय myocytes 16 सेल चौड़ाई के अनुसार चुना गया था. हालांकि, micropatterns के निर्माण के एक प्रजाति है और दिल के विकास के चरण पर निर्भर 16-20 तरीके में बाहर किया जाना चाहिए क्रम में सीमित स्थान के कारण सेल व्यवहार्यता पर विपरीत प्रभाव को रोकने के लिए.
ES सेल व्युत्पन्न CVP, विशेष रूप से आर + + जी जनसंख्या की खोज शोधन, हृदय ऊतक bioengineering के भीतर विश्वसनीय पढ़ाई कर सकेंगे. विशेष रूप से, हम उनके सेलुलर संरेखण को बनाए रखने के साथ करार दौरे के ऊतकों के गठन के लिए सक्षम होने के लिए हमारे ES सेल व्युत्पन्न हृदय progenitors मनाया है. कि कार्यात्मक के निर्माण के तीन आयामी दियाऊतक ऊतक bioengineering के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है, हमारे उत्पन्न दो आयामी anisotropic दौरे के ऊतकों को प्रभावी ढंग से परत कई सेल शीट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में अन्य समूहों को पहले अन्य सेल प्रकार 21,22 के लिए वर्णित है. लेकिन, आज तक, ट्रांसजेनिक संवाददाता प्रणाली की एक सीमा ES कोशिकाओं के इन विट्रो में भेदभाव का नतीजा है. FACS उपलब्ध CVP, विशेष रूप से जोरदार हृदयजनित आर + + जी जनसंख्या, वर्तमान में सभी विभेदित कोशिकाओं के 0.5% की एक अनुमानित औसत के लिए खाते. इस प्रकार, ES कोशिकाओं के CVP में इन विट्रो भेदभाव में सुधार CVP के लिए पर्याप्त मात्रा में पैदा करने के लिए बड़ा anisotropic हृदय longitudinally गठबंधन दौरे फाइबर से मिलकर ऊतक बनाने की दिशा में एक बड़ा कदम होगा.
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Disclosures
लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में नेनो पैमाने सिस्टम (सीएनएस) के लिए केंद्र, राष्ट्रीय नैनो इंफ्रास्ट्रक्चर) (NNIN नेटवर्क है, जो NSF कोई पुरस्कार के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है के एक सदस्य पर प्रदर्शन किया था. ईसीएस 0,335,765. CNS हार्वर्ड विश्वविद्यालय का हिस्सा है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
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