Somitogenesis er en rytmisk udviklingsproces, der rumligt mønstre kroppens akse hvirveldyr embryoner. Tidligere har vi udviklet transgene zebrafisk linjer, der bruger fluorescerende journalister til at observere de cykliske gener, der driver denne proces. Her har vi kulturen spredte celler fra disse linjer og billede deres svingninger over tid in vitro.
Segmentering er en periodisk og sekventiel morfogenetisk proces i hvirveldyr. Denne rytmiske dannelse af blokke af væv kaldet somitter langs kroppen akse er tegn på en genetisk oscillator mønstret embryo under udvikling. I zebrafisk er den intracellulære ur kørsel segmentering består af medlemmer af Hendes / Hes transskription faktor familie organiseret i negativ feedback loops. Vi har for nylig skabt transgene fluorescerende reporter linjer for den cykliske gen HER1 der rekapitulere spatio-temporale mønster af svingninger i presomitic mesoderm (PSM). Ved hjælp af disse linjer, har vi udviklet et in vitro kultur system, der giver real-time analyse af segmentering ur svingninger inden for de enkelte, isolerede PSM celler. Ved at fjerne PSM væv fra transgene embryoner og derefter sprede celler fra oscillerende regioner på glasbund retter, vi genererede kulturer egnet til time-lapse billeddannelse af fluorescens signal fraindividuelle ur celler. Denne fremgangsmåde giver en eksperimenterende og konceptuelle rammer for direkte manipulation af segmentering ur med hidtil uset encellede opløsning, så dets celle-selvstændig og væv niveau egenskaber, der skal skelnes og dissekeret.
Den periodiske dannelse af segmenter langs hvirveldyr kroppens akse, eller somitogenesis, er tegn på en rumlig og tidsmæssig oscillator i udviklingen af embryoet. Den foretrukne mekanisme kontrollerende somitogenesis er begrebsmæssigt beskrives ved en "ur og bølgefront" model 1, hvor "ur" bestående af cellulære oscillatorer, nu menes at være intracellulært drevet af den rytmiske ekspression af et sæt af cykliske gener 2, flåter fra formationen af somitter fra presomitic mesoderm (PSM). Da fosteret udvikler sig, en modning "bølgefront" i PSM bevæger sig i samråd med regression væv mod bageste, langsommere og anholde cellulære oscillatorer, som det passerer 3. Sammen er dette spatiotemporally dynamisk system kaldes segmentering ur. Nuværende tilgange til at studere segmentering ur span tre stigende niveauer af organisationen fra den genetiske oscillator i enkelte celler til lokale koblings thved opstår mellem celler og endelig til global regulering af positionelle oplysninger i den kollektive PSM væv 4..
Tidligere undersøgelser tyder på celle-autonome segmentering oscillator i zebrafisk består af gener og protein produkter fra transskription hendes / hes factorfamily, som menes at danne en negativ feedback loop gennem transkriptionel repression 5-7. Delta / Notch signalvejen synkroniserer svingninger mellem naboceller og regulerer den kollektive periode af befolkningen 8-10. FGF signalmolekyler produceret i tailbud synes at bygge en gradient tværs zebrafisk PSM, og derved hypotese at bidrage til at bremse og anholde oscillerende celler i den forreste 11. Indtil nu har de funktionelle roller hver af disse molekyler i somitogenesis blevet undersøgt af genetisk mutation, morpholino injektion, varme-shock over-udtryk, og antagonist drug treatment af ur komponenter og signalering mellem celler 5,7,10,12. Ved hjælp af disse forstyrrelser har segmentering urfunktion udledes af væv niveau beskrivelser af somite defekter og tab af ensartede svingninger i ekspression af cykliske gener som HER1, her7, og delta C. Men næsten alle disse data fra faste embryoner og undlader at præcist at indfange ændringer, der er uløseligt forbundet med den dynamiske funktion segmentering ur. For nylig er flere embryo time-lapse imaging afslørede første mutanter med ændret oscillator periode, men disse observationer blev også foretaget på vævsniveau 7,13. Således ikke blevet observeret adfærd hypotese celle-autonom oscillator under somitogenesis.
Statiske snapshots af somitogenesis et ufuldstændigt billede, fordi sagens natur, er processen drives af en oscillerende system. Tidligere arbejde i mus og chick celler viste, at niveauet af udskriftog protein stiger og falder, men prøveudtagning en ca 2 hr svingning hver 30 eller 45 min nødvendigvis begrænser de indsamlede data og dermed de konklusioner, der kan drages 14,15. Undersøgelse af andre biologiske oscillatorer, især, døgnrytmen ure, har bevæget sig væk fra iscenesatte målinger af gen-og protein udtryk til real-time overvågning ved hjælp af fluorescerende og selvlysende reportere 16,17. Disse værktøjer er afgørende for at demonstrere ur egenskaber af enkeltceller 18. Et bioluminescerende reporter af Hes1 cykliske gen er blevet udviklet og kortvarigt kendetegnet ved enkelt mus PSM celler 19. Den gennemsnitlige varighed og varians blev beregnet for et lille antal celler, som viser, at svingninger vare ved i flere cyklusser in vitro. Men disse undersøgelser ikke kvantitativt fat på stabilitet og robusthed af oscillator frekvens og amplitude, hvorvidt cellerne spontant kan komme ind eller udrejse svingninger,og hvordan cellerne opretholder deres faserelationer. Derudover er virkningerne af signalmolekyler fundet i embryonet celle-autonom ur ikke har været direkte testet. Derfor er disse fundamentale egenskaber af enkelt celle oscillator være fuldstændig ukendt.
Vi har for nylig udviklet transgene fisk linjer ved hjælp af BAC recombineering 20 til at køre Venus (YFP) fluorescens reportere HER1 udtryk 30. Sådanne linier udnytte de regulatoriske tidskoder af den intakte kromosomale locus, hvor de er indlejret og rekapitulere de tidsmæssige dynamik og rumlige mønster af HER1. Dette gennembrud giver mulighed for real-time overvågning af genekspression i udviklingslandene zebrafisk embryo in vivo. At studere de fundamentale egenskaber af celle-autonome svingninger og hvordan en sådan ekspression reguleres over tid, vi for nylig udviklet en pålidelig metode til at isolere og optage fra PSM celler in vitro. Denne protocol beskriver, hvordan vi har udnyttet vores transgene reporter linjer til at generere spredte cellekulturer, hvorfra vi kan karakterisere svingninger zebrafisk segmentering uret i enkeltceller. Vi kan derved løse de udestående spørgsmål i det felt, der ikke var tilgængelige med statisk eller vævs-level analyse, såvel som direkte manipulere segmentering ur på enkelt celle niveau med signalmolekyler og inhibitorer.
At studere en cellulær proces, der finder sted i løbet af fosterudviklingen, biologer benytter typisk en tilgang til hele foster. Men for fuldt ud at forstå, hvordan en enkelt celle opfører sig inden for en udviklingsmæssig tidsramme, en metode til at undersøge og forurolige de enkelte celler i isolation er også meget gavnligt. Ved at generere spredte PSM cellekulturer ved hjælp af transgene zebrafisk embryoner har vi nu et redskab til direkte at studere cellen selvstændige karakter af genetiske svingninger i segmentering ur på en kvantitativ måde. Det er muligt at måle dynamikken i svingninger i vores fluorescerende reporter i hundredvis af celler under en række betingelser.
Den observerede periode af enkelt celler i kultur er længere end somitogenesis periode i den intakte embryoet. Vi observerer, at en intakt PSM explant i kultur udviser også langsommere svingninger end den intakte embryo (data ikke vist), hvilket tyder på that længere periode observeret i isolerede celler er ikke blot på grund af skader fra spredning. Observeres En variabel periode og amplitude i de fleste af vores serie encellede tid. Kilden til denne variation er ukendt, men bør afsløre vigtige detaljer om segmentering ur tempo-making kredsløb.
Med denne metode kan vi studere de genetiske komponenter af segmentering på celleniveau samt behandle spørgsmål, der er udfordrende at undersøge i hele embryoet. For eksempel ved kontrolleret tilsætning af kendte signalmolekyler findes i udviklingen af embryoet til vores kulturer, kan vi undersøge deres virkninger på det indre PSM cellulære oscillator i en robust og reproducerbar analyse. Vores PSM kultur-system åbner døren til en streng vurdering af, hvilke faktorer, alene eller i kombination fremmer svingninger i disse celler, hvilke faktorer hæmmer disse svingninger, og for at afprøve samspillet mellem disse molekyler. Med disse værktøjer i hånden, vi sigter mod atevaluere eksisterende modeller for somitogenesis der er baseret på offentliggjorte data væv niveau, samt brug resulterer i enkelte celler til at generere forudsigelser, der kan testes i hele embryoet.
Til vores viden, dette er den første zebrafisk primær cellekultur protokol for akut tidsforskudt optagelse af fluorescens i enkeltceller; videreudvikling og forfining af denne protokol er ingen mulig tvivl. Andre protokoller anvender ofte zebrafisk embryoner til at generere stabile cellelinjer, der kan transficeres med journalister, og som anvendes til langsigtet billeddannelse 27-29. Mens stabile linjer er nyttige til billeddannelse en proces, der ikke er bundet til udviklingen timing, såsom den døgnrytmen ur, spørgsmålet om embryonale segmentering nødvendiggør øjeblikkelig billeddannelse mens cellerne er stadig i deres oscillerende, stamfader tilstand. Når celler stoppe oscillerende, de antager en differentieret celle skæbne, og da i vævet, vil blive indarbejdet i en somite. Det er possible at med den rette faktor eller faktorer i vitro vi kunne generere PSM-lignende zebrafisk cellekultur linjer, der ville forblive oscillerende, således betydeligt længere sigt observationer, flere sekventielle perturbationer eller high-throughput screening.
Vi forventer, at denne metode til fremstilling af primære kulturer af dispergerede celler til time-lapse imaging er velegnet til studiet af enhver cellulær proces, der forekommer inden for en udviklingsmæssig tidsramme, som ikke er tilgængelige ved hjælp af stabile zebrafisk cellelinjer. Isoleringen af distinkte celletyper på forskellige udviklingsstadier fra de relevante transgene reporter linier, enten via dissektion eller via FACS efter embryonale dissociation, kunne give de startende celler. Nogle optimering af dyrkningsbetingelserne, styret af den embryonale oprindelse af cellerne, kan være påkrævet. Ved at kombinere denne fleksible og følsomme protokol med den hastigt voksende samling af transgene zebrafisklinjer, håber vi at fremme en in vitro udviklingsmæssige biologi tilgang, der er et supplement til de klassiske genetiske og embryologiske metoder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en EMBO Langsigtet stipendium (ABW), en National Science Foundation International Postdoc Research Fellowship (ABW), Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), en graver-BB-stipendium (AO) og Det Europæiske Forskningsråd under De Europæiske Fællesskabers syvende rammeprogram STG-207.634 (DS, ACO). Vi takker Ravi Desai for nyttige kommentarer til manuskriptet. Vi vil også gerne takke MPI-CBG protein udtryk facilitet til produktion af zebrafisk Fibronectin1 fragmentet, MPI-CBG fisk facilitet personale til pleje og vedligeholdelse af vores fisk linjer og MPI-CBG lysmikroskopi facilitet til billeddannelse support.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | |||
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |