Summary
Somitogenesis is een ritmische ontwikkelingsproces dat ruimtelijk patronen het lichaam as van gewervelde embryo's. Eerder ontwikkelden we transgene zebravis lijnen die fluorescerende verslaggevers gebruiken om de cyclische genen die dit proces sturen observeren. Hier hebben we cultuur verspreid cellen van deze lijnen en het imago van hun oscillaties in de tijd in vitro.
Abstract
Segmentatie is een periodieke en sequentiële morfogenetische proces in gewervelde dieren. Deze ritmische vorming van blokken van weefsel genaamd somieten langs het lichaam as is het bewijs van een genetische oscillator patroonvorming van het zich ontwikkelende embryo. In de zebravis, wordt de intracellulaire klok rijden segmentatie bestaat uit leden van de Haar / Hes transcriptiefactor familie georganiseerd in negatieve feedback loops. We hebben onlangs gegenereerd transgene fluorescerende reporter lijnen voor de cyclische gen HER1 dat de ruimtelijke en temporele patroon van oscillaties in de presomitische mesoderm (PSM) recapituleren. Met behulp van deze lijnen, ontwikkelden we een in vitro cultuur systeem dat real-time analyse van segmentatie klok oscillaties laat binnen enkele, geïsoleerde PSM cellen. Door het verwijderen van PSM weefsel van transgene embryo's en vervolgens verspreiden cellen van oscillerende gebieden op glazen bodem gerechten, we gegenereerd culturen geschikt voor time-lapse imaging van fluorescentie-signaal vanindividuele klokcellen. Deze aanpak biedt een experimenteel en conceptueel kader voor directe manipulatie van de segmentatie klok met ongekende eencellige resolutie, waardoor de cel-autonome en weefsel-level eigenschappen te onderscheiden en ontleed.
Introduction
De periodieke vorming van segmenten langs de gewervelde lichaam as of somitogenesis, is het bewijs van een ruimtelijke en temporele oscillator in het zich ontwikkelende embryo. De voorkeur mechanisme voor het regelen somitogenesis wordt conceptueel beschreven door een "klok en golffront" model 1, waarbij de "klok" bestaande uit cellulaire oscillatoren, nu gedacht intracellulair worden aangedreven door de ritmische expressie van een reeks genen cyclisch 2, streept de formatie somieten de presomitische mesoderm (PSM). Als het embryo zich ontwikkelt, een rijping "golffront" in de PSM gaat in overleg met de regressie weefsel naar de achterkant, het vertragen en arresteren cellulaire oscillatoren bij het passeren 3. Samen is dit spatiotemporeel dynamisch systeem aangeduid als de segmentatie klok. De huidige aanpak om de segmentering klok overspanning bestuderen drie toenemende niveaus van organisatie van de genetische oscillator in enkelvoudige cellen tot lokale koppeling thbij optreedt tussen de cellen en uiteindelijk tot mondiale regulering van positionele informatie in het collectieve PSM weefsel 4.
Eerdere studies suggereren dat de cel-autonome segmentatie oscillator in zebravis bestaat uit genen en eiwit producten van het haar / hes transcriptie factorfamily, die worden verondersteld om een negatieve feedback lus te vormen door middel van transcriptionele repressie 5-7. De Delta / Notch signaalweg synchroniseert oscillaties tussen naburige cellen en regeling van de collectieve periode van de bevolking 8-10. Fgf signaalmoleculen geproduceerd in de tailbud lijken een gradiënt over de zebravis PSM bouwen, en worden daardoor hypothese bij te dragen tot het vertragen en arresteren oscillerende cellen in de voorste 11. Tot nu toe hebben de functionele rol van elk van deze moleculen in somitogenesis is onderzocht door genetische mutatie, morfolino injectie, heat-shock over-expressie, en antagonist drug Treatment van onderdelen van klokken en de signalering tussen cellen 5,7,10,12. Met behulp van deze verstoringen is segmentatie klokfunctie zijn afgeleid uit weefsel-niveau beschrijvingen van somite fouten en verlies van uniforme oscillaties in expressie van genen zoals cyclische HER1, her7 en delta C. Echter, bijna al deze gegevens zijn afkomstig uit vaste embryo's en niet om veranderingen die inherent zijn aan de dynamische functie van de segmentatie klok zijn nauwkeurig vast te leggen. Meer recent heeft meerdere embryo time-lapse imaging onthulde de eerste mutanten met veranderde oscillator periode, maar deze waarnemingen werden ook gemaakt op het weefsel niveau 7,13. Zo is het gedrag van de hypothese cel-autonome oscillator tijdens somitogenesis is niet waargenomen.
Statische momentopnamen van somitogenesis geven een onvolledig beeld omdat, inherent, het proces wordt aangedreven door een oscillerend systeem. Eerder werk in muis en kuiken cellen toonde aan dat niveaus van transcripten eiwit stijgen en dalen, maar de bemonstering van een ongeveer 2 uur oscillatie om de 30 of 45 min per se beperkt de verzamelde gegevens en dus de conclusies die kunnen worden getrokken 14,15. Studie van andere biologische oscillatoren, met name, circadiane klok heeft verwijderd van geënsceneerde metingen van gen-en eiwitexpressie verhuisde naar real-time monitoring met behulp van fluorescentie-en bioluminescentie verslaggevers 16,17. Deze tools zijn essentieel voor het aantonen klok eigenschappen van individuele cellen 18. Een bioluminescent reporter van de Hes1 cyclische gen ontwikkeld en kort kenmerk muis-PSM-cellen 19. De gemiddelde periode en variantie berekend voor een klein aantal cellen waaruit blijkt dat oscillaties aanhouden meerdere cycli in vitro. Echter, deze studies niet kwantitatief in op de stabiliteit en robuustheid van de oscillator frequentie en amplitude, of cellen spontaan kunnen in-of uitstappen oscillaties,en hoe de cellen behouden hun faserelaties. Bovendien, het effect van signaalmoleculen in het embryo op het cel-autonome klok niet rechtstreeks getest. Derhalve zijn deze fundamentele eigenschappen van de cel oscillator blijven volledig onbekend.
We hebben onlangs transgene vis lijnen met behulp van BAC recombineering 20 naar Venus (YFP) fluorescentie verslaggevers van HER1 meningsuiting 30 rijden ontwikkeld. Dergelijke lijnen exploiteren de regulerende signalen van de intacte chromosomale locus waarin ze zijn ingebed en herhalen de temporele dynamica en ruimtelijke patroon van HER1. Deze doorbraak zorgt voor real-time monitoring van genexpressie in de ontwikkelingslanden zebravis embryo in vivo. Om de fundamentele eigenschappen van de cel-autonome oscillaties en hoe dergelijke expressie wordt na verloop van tijd geregeld bestuderen, hebben we onlangs ontwikkelde een betrouwbare methode om te isoleren en op te nemen van PSM cellen in vitro. Dit protocol beschrijft hoe we onze transgene reporter lijnen zijn gebruikt om verspreide celculturen, van waaruit we de oscillaties van de zebravis segmentatie klok karakteriseren in enkele cellen te genereren. We kunnen onopgeloste vraagstukken in het veld die niet toegankelijk met statische of weefsel-level analyse waren, evenals de segmentatie klok rechtstreeks te manipuleren op het eencellige niveau signaalstoffen en remmers daardoor pakken.
Protocol
1. Voordat Dissection
- Op de dag voor dissectie, embryo's te verkrijgen van een incross van zebravis paren heterozygoot voor de transgene allel.
- Raise embryo's in E3 medium zonder methyleenblauw bij 28 o C tot schild stadium (6 uur na de bevruchting).
- Transfer embryo's in E3 medium zonder methyleenblauw tot 20 o CO / N. Bij 20 ° C, zal embryo 1 somiet per uur te vormen zodra ze tailbud stadium te bereiken. Na 17-20 uur O / N bij 20 ° C, moeten embryo's worden op 5 tot 8 somiet stadium de volgende ochtend bij het begin van de dissectie protocol.
- Monteer gereedschappen en reagentia die nodig zijn voor dissectie.
- Brand gepolijst glazen pipet voor de overdracht van embryo's en weefsel
- Paar fijne tang voor het verwijderen van chorions uit embryo's
- Sylgard-gecoate 35-mm schotel voor dissectie - Giet Sylgard polymeer in een 35 mm schaal en genezen O / N in een 37 ° C. Maak de dissectie goed gebruikeen naald een klein volume van uitgeharde polymeer te verwijderen. De schotel kan worden schoongemaakt en vervolgens hergebruikt.
- Geslepen, afgeplatte wolfraam draad gereedschappen voor PSM weefsel manipulatie
- Micro-scalpel voor het snijden van de gewenste stukken van PSM tot cultuur
- 35-mm kunststof schotel voor trypsine incubatie
- L15-medium met 10% foetaal runderserum
- 0,25% trypsine / EDTA-oplossing
- Sigmacoted gel-loading tips voor verspreiding
- Plastic petrischaaltjes met E3 medium zonder methyleenblauw.
- Bedek glazen bodem beeldvorming schotel met Fibronectin1 substraat (10 ug / ml in PBS). Verlaat schotel op de bank om de vacht tijdens de dissectie.
- Gebruik stereoscoop met geschikte fluorescentie filters te identificeren en te sorteren positieve transgene embryo's (5-8 somiet fase).
- Identificeer transgene embryo's door onderzoek van de presomitische mesoderm (PSM) voor YFP expressie onder fluorescentie kanaal (Figuur 1A). Fluorescentie shoULD zichtbaar in het gebied van de laatst gevormde somite de tailbud. Selecteer embryo's met helderste signaal; 25% van de nakomelingen moet zijn homozygote embryo's met 2 kopieën van het transgen. Het aantal geïdentificeerde embryo's nodig zijn is afhankelijk van het experiment. Een ontleed tailbud stuk zal opleveren 1000 cellen, gemiddeld. Typisch, een paar extra positieve embryo bruikbaar wanneer fouten worden gemaakt tijdens de dissectie.
- Gebruik doorvallend licht als een positionele verwijzing naar een autofluorescentie onderscheiden, met name in de dooier cel uit het signaal.
- Transfer positieve embryo's om een aparte plastic petrischaaltje met E3 medium zonder methyleenblauw.
2. PSM Dissection en Verspreiding
- Bereid embryo's voor dissectie.
- Onder een dissectie microscoop, met behulp van fijne tang, verwijder voorzichtig het chorion uit elk embryo in de E3 medium. Zorg ervoor dat het embryo niet te beschadigen of verstoren van de dooier cel. Vul Sylgard-gecoate ontleden schotel met L15 medium met serum. Met behulp van een tang of een ander vlak tool, verwijder eventuele luchtbellen uit het oppervlak van de Sylgard.
- Transfer dechorionated embryo's met behulp van de brand-gepolijst glas pipet om de dissectie schotel.
- Met behulp van de draad gereedschappen, verhuizen alle embryo's aan een kant van het ontleden schotel.
- Ontleden PSM van een enkel embryo.
- Orient een enkel embryo op zijn zijkant in de kleine goed in de Sylgard laag binnen het ontleden schotel (Figuur 1B).
- Met behulp van de micro-scalpel, slice door het embryo en dooier cel anterieure de achterhersenen en via de ventrale pool van het embryo (Figuur 1B, gestippelde rode lijn).
- Verwijder het voorste stuk van het embryo uit de put, en verleggen naar de zijkant van de schotel, en gebruik vervolgens de draad gereedschap om de resterende dooier cel korrels weg te schrapen van het achterste gedeelte met inbegrip van de PSM.
- Zodra de dooier is weg geschraapt, plat en oriënteren de PSM met het voorste einde wijst weg van de experimentator en de posterieure richting van de experimentator (figuur 1C).
- Als de dunne laag van ectoderm niet heeft getrokken door dit punt, gebruikt u de draad gereedschap om het afpellen van de bovenkant van de PSM-weefsel.
- De micro-scalpel snijden de tailbud, de achterste punt van de PSM voorbij het einde van de notochorda, weg van de rest van het weefsel (figuur 1C, gestippelde rode lijn). OPMERKING: Andere stukjes weefsel van de PSM, bijvoorbeeld anterior PSM dichter bij de laatst gevormde somite kunnen ook in cultuur gehouden, afhankelijk van de experimentele kwestie.
- Verplaats de tailbud stuk op een hoek van de schotel uit de buurt van het ontleden gebied. Gebruik de draad gereedschappen om alle vuil en ongewenste embryo weefsel uit het veld ontleden wissen.
- Herhaal dit met de volgende embryo.
- Pool tailbud stukken uit meerdere embryos, afhankelijk van het aantal cellen is vereist voor het experiment. Gemiddeld een stuk tailbud weefsel levert 1.000 cellen.
- Vul lege 35-mm kunststof schaal met een kleine hoeveelheid trypsine-EDTA.
- Met behulp van de brand-gepolijst glas pipet tailbud stukken uit ontleden schotel tot schotel met trypsine / EDTA. Incubeer tailbud stuks trypsine / EDTA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Terwijl het weefsel wordt geïncubeerd in trypsine, verwijder de Fibronectin1 oplossing uit de glazen bodem beeldvorming schotel.
- Was de oplossing van glas 3 keer met MilliQ water. Gebruik aanzuig aan elke wasbeurt te verwijderen en zorgen voor het gerecht volledig droog is.
- Verspreiden tailbud stukken in medium voor beeldvorming.
- Pipetteer 100 ul L15-medium met serum in beeldvorming schaal.
- Met behulp van een gecoate gel tip, verwijder de tailbud stukken uit het trypsine / EDTA in een zo klein mogelijk volume.
- Pipetteer de tailbud stukken in het medium in deimaging gerecht. Pipetteer de stukken en neer meerdere malen te splitsen en suspendeer de cellen in het medium. Wees voorzichtig luchtbellen te introduceren. Controleer celklonten onder de microscoop en disperse meer indien nodig.
- Laat gedispergeerde cellen in de suspensie bezinken op de Fibronectin1 bekleed glas gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg een kleine hoeveelheid extra L15-medium met serum de cellen voor het begin beeldvorming. Wees voorzichtig vaste cellen niet te verstoren.
- Gezien de experimentele vraag, voeg eventueel aanvullende of medicamenteuze behandelingen aan de cultuur.
3. Imaging van Dispersed PSM cellen
- Opgericht beeldvorming schotel in koelruimte op de time-lapse imaging microscoop. Stel Warner kamer om de gewenste temperatuur voor het experiment. Laat schotel equilibreren gedurende ten minste 30 minuten voor het begin beeldacquisitie. Crosscheck temperatuur met externe temperatuurvoeler geplaatst in schaal, indien nodig. OPMERKING: Doorde relatie tussen temperatuur en somitogenesis tarief 21 stabiele temperatuurregeling is essentieel voor nauwkeurige metingen van de periode in enkele PSM cellen.
- Acquire testbeelden in de fluorescentie kanaal om te controleren of de belichtingstijd en winst zorgen voor een groot dynamisch bereik van intensiteiten zonder verzadiging om goed signaal te garanderen aan geluidsniveaus. Een typisch beeld fluorescentie overgenomen van verspreide cellen gegenereerd uit onze lijnen met behulp van dit protocol vereist 400 msec en 40 msec voor een verzonden lichtbeeld met een EMCCD camera werkt bij een EM Gain van 85. Bovendien, pre-amp gain en snelheid van het uitlezen van de camera zijn ook essentieel om signaal over ruis te maximaliseren.
- Met behulp van het doorgelaten licht kanaal, kiest velden van cellen voor de time-lapse acquisitie.
- Run time-lapse acquisitie protocol voor gewenste tijdsduur.
- Een aan te schaffen een fluorescentiebeeld per veld doorgelaten licht en. OPMERKING: Stel een interval tussen overname rounds dat temporele dynamiek gedurende langere imaging of induceren van toxiciteit in de cellen vast te leggen zonder foto-bleken. Dit protocol maakt gebruik van een 2 minuten interval.
- Controleer time-lapse set-up af en toe tijdens het opnemen om ervoor te zorgen dat de cellen blijven in focus, geen software of hardware fouten, enz.
4. Beeldverwerking van Verworven Time-lapse films
- Open filmbestand voor een verworven veld in een software voor beeldverwerking. OPMERKING: Fiji werd gebruikt voor alle verwerkingen in dit protocol.
- Split doorgelaten licht en fluorescentie frames van het ene veld naar 2 stapels van beelden te creëren.
- Volg een enkele cel in het doorgelaten licht kanaal.
- Plaats een cirkelvormig ROI (region of interest) rond de geselecteerde cel in het eerste frame in het doorgelaten licht kanaal. OPMERKING:.. Alleen cellen die 1 gezond zijn aan het einde van de opname, 2 niet buiten bewegen van het veld, en 3 niet in contact komen met andere ce komen.LLS worden bijgehouden.
- Red een ROI om de paar frames om de ROI manager. Volg cel totdat het laatste frame.
- Meet intensiteit met de opgeslagen ROI op de fluorescentie kanaal.
- Selecteer de fluorescentie stack en met de opgeslagen ROI, gebruik dan de aangepaste cirkel interpolator plug-in en de macro om de intensiteit van de bijgehouden cel na verloop van tijd te meten.
- Controleer de uitvoer trace van de macro. Als het trace kwalitatief vangt kenmerken van de fluorescentie time-lapse, exporteren de waarden naar een Excel-werkblad.
- Sla de ROI lijst voor de cel.
- Herhaal volgen in kanaal verzonden en het meten van de fluorescentie kanaal voor andere cellen in het gebied.
- Herhaal alle stappen voor extra velden uit het experiment.
Representative Results
Dit protocol produceert culturen van levensvatbare, verspreid, enkel PSM cellen voor time-lapse imaging van fluorescentie-signaal (figuur 2). Het transgen genereert een reporter die cyclus van productie en afbraak optreedt met vergelijkbare dynamiek het endogene gen en eiwit in het embryo, in de orde van een half uur. Door de snelle omzet, moet de YFP signaal in enkele cellen snel worden gedetecteerd bleken te minimaliseren en een hoge tijdsresolutie de kenmerken van elke oscillerende cyclus vangen. Ook, gezien de relatieve duisternis van het signaal, cultuur en acquisitie voorwaarden zijn zorgvuldig afgestemd op de gevoelige en robuuste resultaten te garanderen. . 1 Een ECM substraat gebruikt voor het coaten van de glazen bodem cultuur gerechten: Wij hebben de volgende factoren van belang te zijn in het genereren van een optimale PSM celculturen voor de beeldvorming gevonden. 2. Toevoeging van serum aan de dissectie en imaging medium. 3. Dissectie van PSM van geïdentificeerde embryo's genomen na de paring HETErozygous paren, waarvan de nakomelingen potentieel dragen 2 kopieën van het transgen. 4. Beeldacquisitie binnen een optimaal zoombereik, met een hogere NA doelstelling om een efficiënte vangst van de fluorescentie-signaal te waarborgen. 5. Belichting met een solid-state lichtbron om de intensiteit schommelingen die kunnen bijdragen tot de achtergrond ruis te minimaliseren. 6. Signaaldetectie met een zeer gevoelige EM-CCD camera signaal uitlezing maximaliseren.
Suboptimale culturen zullen cellen die niet afgerond en gezond wil blijven gedurende de opname bevatten. Onze hypothese was dat onze ECM substraat, een fragment van zebravis fibronectin1 gaatjes cellen ongedifferentieerd PSM-achtige toestand, in vergelijking met andere gebruikelijke substraten zoals polylysine of laminine. Andere substraten we getest veroorzaakt cellen plat op het glas en het verlies van oscillerende fluorescentiesignaal in de loop van de opname. We vonden ook dat de toevoeging van serum aan het medium tijdens de dissectie, verspreiding,en opnemen was niet alleen belangrijk om de trypsine voor dissociatie lessen, maar ook toegenomen fluorescentie-intensiteit op achtergrond waarschijnlijk door verbeterde cellevensvatbaarheid. Om een optimale signaalontvangst verzekeren van enkelvoudige cellen gebruikten we een 40x objectief speciaal ontworpen voor fluorescentie beeldvorming (Zeiss Plan NeoFluor serie) met een hoge NA. We vonden ook dat een solid-state lichtbron voorzien stabieler verlichting dan traditionele kwiklampen, die kritiek is voor fluctuaties in de achtergrondstraling die bijdragen aan vage beelden te minimaliseren. Deze wijzigingen zijn belangrijk om robuuste resultaten.
Met dit protocol we verwachten culturen waarin de meeste cellen in een gegeven gebied zijn fluorescentie op enig moment tijdens de opname. We vinden dat fluorescerende cellen meestal blijven afgerond en zijn soms heel beweeglijk tijdens opnames. Enkele cellen, zoals fluorescerende cellen apoptotisch kan worden tijdens de opname. Deze cellen worden uitgesloten van eennalyse. We hebben ook cellen die in contact met andere cellen worden uitgesloten of verplaatst buiten het gezichtsveld. Gemiddeld zien we een verlaging 12% van het aantal cellen per veld het einde van de 10 uur opname gemeten door telling van het aantal gezonde cellen in het doorgelaten licht kanaal. Dit verlies omvat zowel celdood en cellen die uit het veld verplaatst. Gegeven deze kanttekeningen kunnen we gemiddeld spoor 5 fluorescerende cellen per veld dat levensvatbaar en zichtbaar blijven, en typisch opnemen 6 velden per conditie. Zo zal een experiment met 4 voorwaarden moeten 24 in totaal velden verworven en typisch ongeveer 30 bijgehouden cellen per conditie. Onder standaard beeldomstandigheden met L15-medium met 10% foetaal runderserum, zien we dat PSM-cellen (n = 101 cellen bij 4 experimentele replicaten) kan produceren tussen 2 en 7 pieken met de gemiddelde en de standaardafwijking van 3 ± 1 pieken (2 -3 cycli). De mediaan piekaantal, evenals de 25% percentiel, 2 pieken en 75% percentiel is 3 pieken. Met behulp van onze semi-automatische tracking en analyse, kunnen we snel genereren van fluorescentie-intensiteit in de tijd sporen voor individuele PSM cellen, met een vertegenwoordiger cel spoor weergegeven in figuur 2C. Deze ruwe sporen kunnen dan worden gebruikt om kwantitatieve metingen van eigenschappen van de oscillerende PSM cellen, zoals frequentie, amplitude, aantal cycli, en de timing van de pieken maken.
Figuur 1. Identificatie van transgene embryo's en schema's van de dissectie. (A) Zijdelingse weergave van een transgene zebravis embryo uiten YFP fluorescentie bij ~ 5-somiet podium. Het beeld is een overlay van doorgelaten licht en fluorescentie kanaal. Pijlen geven gebieden van het signaal vanaf de punt van de tailbud gehele PSM, naar de l ast gevormd somiet. Inzet toont een schematische voorstelling van de verslaggever transgen (voor meer informatie over de ontwikkeling en het in vivo gedrag verwijzen naar Soroldoni et al.. 30. (B) Schematische voorstelling van zijaanzicht van embryo vóór de eerste snijden tijdens dissectie. Gestippelde rode lijn geeft de eerste snede gemaakt over de achterhersenen, hoewel de dooier cel net achter de tailbud. (C) Schematische weergave van afgeplatte PSM na verwijdering van dooier korrels en epidermale laag, georiënteerd langs de anterior-posterior as. gestippelde rode lijn geeft de tweede snede om de tip te verwijderen van de tailbud voor verspreiding en cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
07fig2.jpg "/>
Figuur 2. Vertegenwoordiger beelden en sporen van een enkele cel op een versnipperde PSM cultuur. (A) Montage van doorgelaten licht beelden van een enkele PSM cel in een 6-h time-lapse-opname. Merk op dat de cel blijft afgerond en gezond in de loop van de opname. (B) Overeenkomstige montage van fluorescentie beelden van een PSM cel. Pieken in intensiteit van de cel zijn genummerd in de loop van de opname. (C) Gemiddelde intensiteit in de tijd gemeten vanaf een ROI bovenaan deze cel. Waarden zijn afkomstig uit elk frame uit een film met een frame rate van een per 2 min met behulp van de cirkel interpolator plug-in en aangepaste macro geschreven in Fiji. Pieken in intensiteit zijn opnieuw genummerd in de gehele trace. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Om een cellulair proces dat plaatsvindt in de loop van de embryonale ontwikkeling te bestuderen, biologen meestal gebruik maken van een aanpak in het kader van de gehele embryo. Echter, om volledig te begrijpen hoe een enkele cel gedraagt zich binnen een ontwikkelingsstoornis tijdsbestek, een methode te onderzoeken en te verstoren individuele cellen in afzondering is ook zeer gunstig. Door het genereren van verspreide PSM celculturen met behulp van transgene zebravis embryo's hebben we nu een tool om direct te bestuderen de cel autonome karakter van genetische oscillaties in segmentatie klok op een kwantitatieve manier. Het is mogelijk om de dynamiek van de oscillaties meten onze fluorescente reporter honderden cellen onder verschillende omstandigheden.
De waargenomen periode van enkele cellen in kweek is langer dan de somitogenesis periode in de intacte embryo. We constateren dat een intact PSM explant in cultuur vertoont ook langzamer oscillaties dan het intacte embryo (gegevens niet getoond), wat suggereert that de langere periode waargenomen in geïsoleerde cellen is niet alleen te wijten aan schade door verspreiding. Een variabele periode en amplitude wordt waargenomen in de meeste van onze eencellige tijdreeksen. De bron van deze variabiliteit is onbekend, maar moet belangrijke details over tempo maken circuits van de segmentatie klok onthullen.
Met deze methode kunnen we de genetische componenten van segmentatie op cellulair niveau en adres vragen die uitdaging te onderzoeken in het gehele embryo bestuderen. Bijvoorbeeld, door gereguleerde toevoeging van bekende signaalmoleculen in het ontwikkelende embryo voor onze culturen, kunnen we de effecten op de enkel PSM cellulaire oscillator op een robuuste en reproduceerbare test onderzocht. Onze PSM cultuur systeem opent de deur naar een strenge evaluatie van welke factoren, alleen, of in combinatie te bevorderen oscillaties in deze cellen, welke factoren deze oscillaties te remmen, en de wisselwerking tussen deze moleculen te testen. Met deze tools in de hand, willen weevalueren bestaande modellen somitogenesis die zijn gebaseerd op gepubliceerde weefsel-level data, alsmede het gebruik resulteert in enkele cellen voorspellingen kunnen worden getest in het gehele embryo genereren.
Voor zover ons bekend, is dit de eerste zebravis primaire celkweek protocol voor acute time-lapse opname van fluorescentie in enkele cellen; verdere ontwikkeling en verfijning van dit protocol is geen twijfel mogelijk. Andere protocollen gebruiken vaak zebravis embryo om stabiele cellijnen kunnen worden getransfecteerd met reporters en gebruikt voor langdurige beeldvorming 27-29 genereren. Hoewel stabiele lijnen zijn nuttig voor het afbeelden van een proces dat niet gebonden is aan ontwikkeling timing, zoals de circadiane klok, de vraag embryonale segmentatie vereist directe beeldvorming terwijl cellen nog in de oscillerende progenitor staat. Zodra cellen stoppen met oscillerende, ze gaan uit van een gedifferentieerde cel lot, en wanneer in het weefsel, zou in een somiet worden opgenomen. Het is possible dat met de juiste factor of factoren aanwezig in vitro konden we PSM-achtige zebravis celkweeklijnen dat oscillerende zou blijven, waardoor aanzienlijk langere termijn observaties, meerdere opeenvolgende storingen, of high-throughput screening genereren.
Wij verwachten dat deze werkwijze voor de bereiding primaire kweken van verspreide cellen voor time-lapse imaging is zeer geschikt voor de studie van een cellulair proces dat plaatsvindt binnen een ontwikkelingsstoornis tijdsbestek dat is niet aanspreekbaar gebruik stabiel zebravis cellijnen. De isolatie van verschillende celtypen in verschillende ontwikkelingsstadia van de juiste transgene reporter lijnen, hetzij via dissectie of via FACS na embryonale dissociatie, kan het uitgangsmateriaal cellen. Sommige optimalisatie van kweekomstandigheden, geleid door de embryonale oorsprong van de cellen nodig zijn. Door het combineren van deze flexibele en gevoelige protocol met de snel groeiende collectie van transgene zebravislijnen, hopen we een in vitro ontwikkelingsbiologie aanpak die complementair is aan de klassieke genetische en embryologische methoden te vergemakkelijken.
Disclosures
Auteur bijdragen:
ABW ontwikkeld en verfijnd de verspreiding, cultuur, beeldvorming, en cell tracking protocollen. DS gegenereerde de transgene lijnen en hield toezicht op het ontwerp van de time-lapse fluorescentie microscoop gebruikt in dit protocol. AO pionier eerste proof-of-principle experimenten te distantiëren en imago PSM cellen in kweek. JS schreef de cirkel interpolator plugin instrument in Fiji gebruikt om fluorescentie-intensiteit meet van time-lapse filmpjes. ABW en ACO schreef het manuscript.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een EMBO Langdurige fellowship (ABW), een National Science Foundation International Postdoctoraal Research Fellowship (ABW), het Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), een DIGS-BB fellowship (AO), en de Europese Onderzoeksraad in het kader van de Europese Gemeenschappen zevende kaderprogramma STG-207634 (DS, ACO). Wij danken Ravi Desai voor nuttig commentaar op het manuscript. We willen ook graag de MPI-CBG eiwitexpressie faciliteit bedanken voor de productie van de zebravis Fibronectin1 fragment, de MPI-CBG vis faciliteit personeel voor de zorg en het onderhoud van onze vis lijnen en de MPI-CBG lichtmicroscopie faciliteit voor de beeldvorming ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
| Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
| Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
| Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
| 35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
| 60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
| Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
| Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
| Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
| L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
| Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
| 0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
| Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
| Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
| Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
| E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
| Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
| Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
| EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |
References
- Cooke, J., Zeeman, E. C. A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis. J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139, 625-639 (2012).
- Dequeant, M. L., Pourquie, O. Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis. Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).
- Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P.
- Oates, A. C., Ho, R. K. Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish. Development. 129, 2929-2946 (2002).
- Lewis, J. Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator. Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).
- Schroter, C., Oates, A. C. Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant. Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).
- Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock. Science. 317, 1911-1915 (2007).
- Ozbudak, E. M., Lewis, J. Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries. PLoS Genet. 4, e15 (2008).
- Herrgen, L., et al. Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock. Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).
- Sawada, A., et al. Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation. Development. 128, 4873-4880 (2001).
- Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism. PLoS Biol. 5, e150 (2007).
- Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development. Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R.
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Soroldoni, D., Oates, A. C. Live transgenic reporters of the vertebrate embryo's Segmentation Clock. Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish. Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).
- Schroter, C., et al.
- Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M.
- Mould, A. P., et al. Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio). BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).
- Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach. Biochem J. 424, 179-189 (2009).
- Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish. Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).
- Westerfield, M. In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection. Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).
- Carr, A. J., Whitmore, D. Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods. Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).
- Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock. Nature. 404, 87-91 (2000).
- Soroldoni, D., et al. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, DOI. 222-225 (1126).
