Summary
في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود نطاق صغير طريقة تنقية البروتين كفاءة عالية وفعالة من حيث التكلفة، والذي يسمح تنقية البروتينات المؤتلف من خلال الجمع بين فريد شطورة GST-علامة وصغيرة صاحب العلامة.
Abstract
فحوصات أساسية في علم الإنزيمات لتوصيف البيوكيميائية من البروتينات في المختبر يتطلب تركيزات عالية من البروتين المنقى من الفائدة. يجب بروتوكولات تنقية البروتين الجمع بين الكفاءة والبساطة والفعالية من حيث التكلفة 1. هنا، نحن تصف طريقة GST-باعتباره صاحب الصغيرة الحجم نظام لتنقية تقارب جديدة للبروتينات المؤتلف، استنادا إلى N-محطة الجلوتاثيون سيفاروز الوسم (GST) وعلامة 2،3 10xHis-C المبنى رقم 4، وكلاهما تنصهر للبروتين من الفائدة. يتم استخدام بناء الأخير لتوليد مراقبة الحشرات، لإصابة Sf9 الخلايا المصابة للتعبير البروتين 5. GST هو علامة طويلة نوعا ما (29 كيلو دالتون) والذي يعمل على ضمان كفاءة التنقية. ومع ذلك، فإنه قد تؤثر على الخصائص الفسيولوجية للبروتين. وبالتالي، يتم لاحقا المشقوق قبالة البروتين باستخدام انزيم PreScission 6. من أجل ضمان أقصى قدر من النقاء وإزالة GST المشقوق، ونحنوأضاف خطوة تنقية تقارب الثانية على أساس صغيرة نسبيا صاحب العلامة. الأهم من ذلك، ويستند أسلوبنا على اثنين من العلامات المختلفة المرافقة طرفي البروتين، والذي هو أداة فعالة لإزالة البروتينات المتدهورة، وبالتالي، يثري البروتينات كامل طول. طريقة المقدمة هنا لا يحتاج إلى الإعداد فعال مكلفة، مثل FPLC. بالإضافة إلى ذلك، ونحن دمج MgCl 2 و ATP يغسل لإزالة الشوائب الحرارة بروتين الصدمة والعلاج نوكلياز لإلغاء تلويث الأحماض النووية. وباختصار، فإن مزيج من اثنين من الكلمات المختلفة المرافقة N-و-C محطة والقدرة على تنشق مرة واحدة من العلامات، وضمانات الانتعاش من البروتين العالية النقاء وطول الكامل من الاهتمام.
Introduction
تنقية البروتينات المؤتلف أمر حاسم لمعالجة المسائل الأساسية في الكيمياء الحيوية. الطرق التقليدية لتنقية البروتين مثل التبادل الأيوني اللوني وحجم الاستبعاد اللوني تعتمد على الخصائص الفيزيائية للبروتين الهدف مثل نقطة تساوي الكهربية وتهمة أو حجم، على التوالي. ويجري تقاسم خصائص البروتين الأخير من قبل مجموعة متنوعة من البروتينات، مما يزيد بشكل كبير من فرصة تلويث البروتينات في تنقية البروتين الاستراتيجيات التقليدية. يمكن الالتفاف على هذه المشكلة مع استخدام الأعمدة تنقية متعددة، والتي تستغرق وقتا طويلا. في نفس الوقت، وأساليب اللوني الأخيرة مطالبة الإعداد التجريبية مكلفة. تنقية تقارب علامة يزيد بشدة المستهدفة التحديد، كما هو الحال في معظم الحالات سوف يكون علامة فريدة من نوعها لبروتين من الفائدة. في الدراسات الحديثة، وقد استخدم على نطاق واسع تنقية العلم أو HA-تقارب.
وعلى النقيض من تفصيل القائمةombinant بروتوكولات تنقية البروتين التي تستخدم به واحد، أنشأنا مزيج فريد من اثنين من العلامات. ينطوي أسلوبنا الانصهار من علامة GST في N-محطة وصاحب العلامة في محطة سي من البروتين من الفائدة، لالنسبة المثلى بين كمية ونقاء البروتين المطلوب. ضريبة السلع والخدمات هو علامة طويلة (29 كيلو دالتون)، والتي هي ذات كفاءة عالية لتنقية على الجلوتاثيون الخرز سيفاروز. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام GST يضمن فعاليتها من حيث التكلفة لدينا أسلوب 1. إمكانية يلتصق قبالة GST مع انزيم PreScission (مع تسلسل الاعتراف LeuGluValLeuPheGln / GlyPro، مما أدى إلى إضافة اثنين فقط من الأحماض الأمينية) والعديد من المزايا، على سبيل المثال، فإن هذه الاستراتيجية يتجنب التعديلات وظائف البروتين الفسيولوجية بسبب عائق تفارغي. الصغير صاحب العلامة تنصهر مع غيرها من أقصى البروتين يخدم في خطوة تنقية الثانية لزيادة البروتين النقاء بغسل قبالة GST المشقوق، وكذلك البروتينات وغيرها من تدهور الملوثات. بالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب البروتوكول خطوة لغسيل الكلى عند التبديل من ضريبة السلع والخدمات إلى صاحب تنقية خطوة العمود (راتنج تالون). الملوثات شيوعا في مثل هذه العمليات هي تنقية الحرارة صدمة البروتينات (HSP). إضافة خطوة الحضانة مع MgCl 2 و ATP يسمح إزالة هذه الملوثات (الشكل 1).
البروتين سريع اللوني السائل (FPLC) وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) هي التقنيات الشائعة التي تعتمد على الأجهزة باهظة الثمن لتوليد عالية الغلة من البروتين المنقى من الفائدة. بروتوكول تنقية دفعة نقدم هنا، في المقابل، هو دليل ولا يتطلب الإعداد فعال مكلفة. يمكن التوصل إلى ارتفاع العائد من البروتين عن طريق التوسع في البروتوكول. في نفس الوقت، مع بروتوكول تنقية دفعة، ويمكن تعديل حجم شطف من أجل تعزيز تركيز البروتين، والتي لا تعطى مع FPLC أو HPLC.
ntent "> أيضا، مع دفعة GST-صاحب بروتوكول تنقية والبروتينات مع حجم المدى من 10-300 كيلو دالتون ~ يمكن تنقيته. واحدة من أكبر مزايا تعطى من حقيقة أن واحدا يمكن تنقية العديد من البروتينات في نفس الوقت ، على سبيل المثال، على حد سواء من النوع البري والبروتين متحولة. إن نجاح بروتوكول المعروضة تعتمد فقط على مستوى التعبير والذوبان من البروتين من الفائدة.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنتاج المؤتلف الفيروسة العصوية
يتم إنشاؤها لمراقبة الحشرات باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية باك إلى باك من إينفيتروجن أساسا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة فقط:
- تم إنشاء تعديل pFastBac1 ناقلات (GIBCO، والحياة) الذي يحتوي على GST-وصاحب العلامات (الشكل 2). الموقع MultiCloning (MCS) من PET-52B (+) ناقلات (Novagen)، تحتوي على 10xHis علامة، تم إدراجها في MCS من ناقلات pFastBac1 لتوليد pFastBac1-بكتيريا-10xHis. وكان تسلسل MCS-52B الحيوانات الأليفة (+) PCR تضخيم بين المواقع تقييد XbaI وBlpI، إضافة موقع تقييد BglII في 5 'أقصى وموقع تقييد HindIII في 3' أقصى. ثم تم استنساخ المنتج PCR بين BamHI وHindIII موقع تقييد pFastBac1، وذلك باستخدام توافق BamHI وBglII تسلسل قيود. منذ كان الهدف هو توليد pFastBac1 السماح للتعبير عنالبروتين المؤتلف مع streptavidin و10xHis-العلامات، وكان موقع تقييد BamHI من PET-52B (+) لا تستخدم تسلسل MCS. أيضا، لم يستخدم موقع تقييد XbaI لتجنب التكرار من المواقع قيود التي تحدث بين المواقع بالفعل في MCS من pFastBac1 وهذه إدراجها مع MCS من PET-52B (+). ثم تم إدراج تسلسل الترميز GST مع موقع PreScission البروتياز الاعتراف (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) في pFastBac1-بكتيريا-10xHis. تسلسل GST كدنا] من pGEX-6P-2 (GE للرعاية الصحية) تم تضخيم PCR مع الاشعال تحتوي على راسي وKpnI مواقع التقييد في 5 'و 3' الأطراف، على التوالي. موقع روسي يسمح بإضافة كودون البداية ولكن أيضا ألانين إلى GST. ثم تم استنساخ المنتج PCR في pFastBac1-بكتيريا-10xHis بين المواقع تقييد راسي وKpnI، مما أدى إلى حذف Streptavidin البطاقات. كان اسمه الانصهار ناقلات جديدة وبالتالي الحصول على pFastBac1-GST-10xHis.
- استنساخ [كدنا] الترميز للعلاقات العامةotein من الفائدة في ناقلات pFastBac-GST-10xHis بين ضريبة السلع والخدمات (N-محطة) وصاحب العلامة (C-محطة). كن حذرا لإزالة كودون وقف كدنا] للسماح للاندماج مع محطة C صاحب العلامة.
- تحويل E. القولونية DH10Bac مع pFastBac المؤتلف (حصلت عليه في الخطوة 1.2) لتوليد bacmid. السماح لتنمو المستعمرات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وعدة ساعات في 30 درجة مئوية على لوحات تحتوي على اختيار Bluo غال وIPTG (10 ميكروغرام / مل تتراسايكلين، 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين، 7 ميكروغرام / مل جنتاميسين، و 100 ميكروغرام / مل Bluo- غال، 40 ميكروغرام / مل IPTG).
- انتقاء وrestreak 2 مستعمرات بيضاء (من الخطوة 1.3) على لوحات مختارة لتأكيد النمط الظاهري الأبيض.
- تطعيم 2 مل من LB تحتوي على 10 ميكروغرام / مل تتراسايكلين، 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين، 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين مع اثنين من المستعمرات بيضاء من الخطوة 1.4 والسماح لهم تنمو بين عشية وضحاها في إطار التحريض (250 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية.
- من أجل تنقية الحمض النووي bacmid، تكوير البكتيريا من الخطوة 1.5،resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر من الحل الأول وإضافة 300 ميكرولتر من الحل الثاني (Maxiprep عدة من في Qiagen). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 300 ميكرولتر من 3 M KOAc درجة الحموضة 5.5 واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي العينات في 4 درجات مئوية، وأقصى سرعة لمدة 10 دقيقة. إضافة 800 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى supernatants واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي العينات لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، ويغسل بيليه مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪. السماح بيليه الجافة و resuspend تحت ظروف معقمة في 40 ميكرولتر من EDTA تريس، ودرجة الحموضة 8.0. يجب أن يتم تخزين الحمض النووي bacmid في 4 درجات مئوية.
- تولد لمراقبة الحشرات كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. يمكن تخزينها لمراقبة الحشرات في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
2. المؤتلف التعبير البروتين
- من أجل اختيار الأكثر كفاءة الفيروسة العصوية لتنقية ورصد أي وقت يتم الوصول إلى الذروة من البروتين التعبير، إجراء فحص الإصابة مصغرة لق يلي: تصيب 2 × 10 7 من المصابين Sf9 الخلايا المستزرعة في 27 درجة مئوية في وسائل الإعلام غريس (تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ P / S) مع 133 ميكرولتر (1/150) من الفيروسة العصوية. جمع aliquots من 1.5 مل في 0، 24، 48، و 72 ساعة بعد العدوى. بيليه الخلايا وتحليل مستوى التعبير عن بروتين من الفائدة عن طريق النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة للعلامة.
- استخدام الفيروسة العصوية الأكثر كفاءة من الخطوة 2.1 لتصيب الدوار تحتوي على 1.0 × 10 6 خلايا Sf9 لكل مل في 500 مل من وسائل الإعلام مع نسبة 1/150 بين الفيروس وسائل الإعلام. السماح للخلايا المصابة تنمو في التعليق حتى 27 درجة مئوية وحصاد الخلايا عند بلوغ الحد الأقصى للتعبير البروتين (كما هو محدد في الخطوة 2.1 أعلاه). الخلايا مكعبات يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
3. إعداد المحللة للذوبان الخليوي
يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية من الحضانة في 4 درجات مئوية تحت دوران خفيفة.
- ليز Sالخلايا F9 التعبير عن بروتين اهتمامك في ~ 20 مل من العازلة ملزمة GST (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 0.05٪ تريتون-X-100، 1 ملم DTT في PBS1X لتركيز النهائي من كلوريد الصوديوم 250 ملم، ومثبط البروتياز كوكتيل (روش). في حمام الماء المثلج، dounce الحل 20x ومع الخالط dounce، يصوتن كل 3X 30 ثانية (إخراج 70٪)، ومرة أخرى dounce 20x و.
- (اختياري). احتضان مجموع المحللة الخلية مع 1 ملي MgCl 2 و 7 benzonase نوكلياز (2.5 U / مل) لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الحمض النووي RNA أو التلوث.
- أجهزة الطرد المركزي في 18،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. إبقاء طاف.
- (اختياري). الطرد المركزي طاف مرة أخرى لمدة 30 دقيقة في 18،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية للحصول على المحللة للذوبان واضحة. تمرير طاف من خلال مرشح 0.2 ميكرون أو 0.45 لتجنب انسداد.
4. ملزمة البروتين على GST الخرز
- احتضان الخلايا المحللة للذوبان مع 1 مل من الخرز GST (prewashed مرتين مع10 مل من العازلة GST) ملزمة لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية تحت التناوب لطيف.
التعليق: الساعة الحضانة يحتاج إلى أن يكون الأمثل وفقا لاستقرار وكفاءة البروتين ملزمة.
- تدور سريعة على 700 دورة في الدقيقة وإزالة طاف تحتوي على بروتينات غير منضم (وهذا يمكن أن تبقى لمزيد من التحليل). غسل البروتينات ملزمة GST (الشكل 3B، حارة 1) مع GST غسل العازلة (GST العازلة ملزمة مع 350 ملي مول كلوريد الصوديوم النهائية).
- كرر الخطوة 4.2 2X. في غسل الماضي، وإزالة طاف قدر ممكن.
- احتضان حبات مع 5 ملي ATP و 15 ملي MgCl 2 (في 10 مل العازلة ملزمة GST) لمدة 1 ساعة عند 4 درجة مئوية لتجنب الربط غير محدد من البروتينات حرارة صدمة 8. تغسل حبات ثلاث مرات مع GST غسل العازلة.
5. PreScission الشق من ضريبة السلع والخدمات
- أجهزة الطرد المركزي حبات GST، وإزالة طاف وتغسل حبات GST مع P5 BUFفر (50 ملي NaHPO 4 درجة الحموضة 7.0، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين، 0.05٪ تريتون-X-100، 5 ملي إيميدازول).
- احتضان GST-الخرز مع PreScission الانزيم في المنطقة العازلة من 3 P5 ساعة ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية. (اقسم حبات GST في كسور 100 ميكرولتر وإضافة وحدات 4-8 (2-4 ميكرولتر) من انزيم مخففة في 100 ميكرولتر من العازلة P5).
التعليق: فترة حضانة من خطوة PreScission يحتاج إلى أن يكون الأمثل وفقا للوزن الجزيئي فضلا عن الاستقرار من البروتين. إذا لوحظ تدهور، يمكن تخفيض هذا الوقت الحضانة لمدة لا تقل عن 2 ساعة بدلا من ليلة وضحاها.
- تدور السريع وجمع طاف. كرر هذه الخطوة مرتين بعد إضافة 100 ميكرولتر من P5 العازلة إلى الخرز وتجميع جميع أجزاء (الشكل 3B، 2 لين).
التعليق: حبات المتبقية يمكن استخدامها لتحليل كفاءة الانقسام (الشكل 3B
6. لTALON المعادن تقارب الراتنج ملزمة البروتين
- تقسيم شطف من فوق إلى 3 أجزاء من 1 مل واحتضان كل مع 100 ميكرولتر الخرز الراتنج تالون تقارب المعدن الجافة (prewashed مرتين مع العازلة P5) لمدة 1 ساعة تحت التناوب.
التعليق: تقسيم شطف في عدة كسور يزيد من كفاءة ملزمة / يغسل.
- غسل الراتنج 5 دقائق مع العازلة P30 (P5 عازلة مع تركيز النهائي من 30 ملي إيميدازول).
- كرر الخطوة 6.2 2X وتجميع الخرز في أنبوب واحد. قبل غسل الماضي، وإزالة طاف قدر ممكن.
التعليق: هذا يتوافق مع TALON ملزمة العينة (الشكل 3B، حارة 4).
7. شطف من البروتين النقي
- احتضان البروتين ملزمة الراتنج تالون لمدة 5 دقائق تحت تناوب مع P500 العازلة (P5 عازلة مع تركيز النهائي من 500 ملي إيميدازول). استخدام النسبة بين العازلة والخرز 1:1 ت / ضد (على سبيل المثال، إذا كنت قد اتخذت 200 ميكرولتر من الخرز جافة، سيكون لديك لإضافة 200 ميكرولتر من P500). كرر هذه الخطوة مرتين والحفاظ على كل جزء على حدة مزال (اسمه شطف 1 (E1)، شطف 2 (E2) وشطف 3 (E3)؛ الشكل 3B، الممرات 5-7).
التعليق: حبات المتبقية يمكن استخدامها لتحليل فعالية شطف (الشكل 3B، حارة 8). عادة، يتم مزال 60-80٪ من البروتين في المجموع.
- تحليل كمية ونوعية البروتين النقي الخاص بك عن طريق تحميل ما يقرب من 20-40 ميكرولتر من كل جزء مع تركيز BSA القياسية على SDS-PAGE وصمة عار مع Coomassie الأزرق (الشكل 3B) أو SYPRO البروتين وصمة عار لتصور.
التعليق: البروتين من الفائدة يمكن أيضا الكشف عن تروughout الإجراء تنقية استخدام الألغام المضادة للضريبة السلع والخدمات ومكافحة صاحب الأضداد (الشكل 3C).
8. تخزين البروتين النقي
- Dialyze البروتين النقي ضد وجود مخزن مؤقت التخزين المناسبة (على سبيل المثال 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0 خلات، 200 ملي شركة الخطوط الجوية الكويتية، 10٪ الجلسرين، 1 ملم EDTA، 0.5 ملي DTT) في 4 درجات مئوية. فمن المهم للتحقق من هطول الأمطار من البروتين النقي أثناء غسيل الكلى. نحن عادة dialyze 2X لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية تحت التحريض التناوب.
- جعل مأخوذة صغيرة من البروتين النقي (10-20 ميكرولتر) وتجميد الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة. تخزين aliquots في -80 درجة مئوية، وتجنب العديد من ذوبان الجليد / دورات التجمد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل توضيح الكفاءة للله GST بروتوكول تنقية، ونحن تنقيته Rec14، وهو S. البروتين pombe من 32.9 كيلو دالتون. تم استنساخ [كدنا] Rec14 في منطقتنا تعديل ناقلات pFastBac1 السماح اضافات من ضريبة السلع والخدمات وصاحب-به في وN-C-تيرميني، على التوالي (الشكل 1A). تم الفيروسة العصوية المؤتلف ثم أعدت واستخدامها لتصيب الخلايا المصابة SF9 للتعبير البروتين. حضنت لست] خلية قابلة للذوبان مع حبات GST وكان مزال بروتينات ملزمة الشق ضريبة السلع والخدمات مع PreScission البروتيني. كان الناتج Rec14-صاحب البروتين ومزال تقارب تنقيته على الراتنج TALON والبروتينات المربوطة مع العازلة التي تحتوي على 500 ملي TALON إيميدازول. صاحب-Rec14 كان مدال المنقى في المخزن تخزين وتخزينها في -80 درجة مئوية (الشكل 1B).
ولست] الخلية القابلة للذوبان ومجموعه من الخلايا المصابة SF9 مع الفيروسة العصوية المؤتلف Rec14، أو المصابة وهمية عن السيطرة، تم تحليلها من قبل Coomأسيي تلطيخ الأزرق، مما يسمح لنا لتأكيد التعبير عن بروتين GST-Rec14-صاحب (الشكل 3A). أثناء عملية تنقية، تم تحليل العديد من العينات لمتابعة كفاءة الأسلوب. تحليل هذه العينات بواسطة Coomassie الأزرق تلطيخ (الشكل 3B) يبين أنه خلال الخطوة الأولى للتنقية، GST-Rec14 تم بشكل صحيح منضمة إلى حبات GST، مع الوزن الجزيئي واضح من 60 كيلو دالتون ~ بسبب انصهار Rec14 (32.9 كيلو دالتون) مع ضريبة المبيعات (29 كيلو دالتون) (حارة 1). بعد انشقاق PreScission من ضريبة السلع والخدمات، وخالية من GST-Rec14 صاحب يهاجر حوالي 37 كيلو دالتون (حارة 2) في حين أن ضريبة السلع والخدمات المشقوق يمكن تصور على حبات GST (حارة 3، حوالي 25 كيلو دالتون). على الرغم من جزء من ضريبة السلع والخدمات خالية من Rec14 التي لا تزال ملزمة لحبات GST (حارة 3)، والإثراء ملحوظ في Rec14-تم تحقيقه صاحب (حارة 2، مع عدم وجود الملوثات مرئية على تلطيخ Coomassie الأزرق). ويمكن تحسين هذه الخطوة من خلال زيادة فترة حضانة من البروتين مع PreScission. تحليل Rec14-صاحب منضمة إلى TALONالخرز (بعد الخطوة 7.1، حارة 4) مقارنة مع البروتينات مزال بعد تنقية GST خطوة (حارة 2)، وتبين أن نسبة كبيرة من Rec14-صاحب منضما إلى حبات تالون. بعد عدة غسلات، وكان صاحب Rec14-مزال وجمعها. أجريت ثلاث elutions. وكشف تحليل نقاء عالية من Rec14-صاحب (لا الملوثات مرئية بواسطة Coomassie تلطيخ، الممرات 5-7)، وأكبر تركيز للRec14-صاحب في شطف الأولى. بعد شطف (حارة 8) يوضح المقارنة بين الكسور مزال (الممرات 5-7) لحبات TALON كفاءة شطف، منذ-صاحب Rec14 يمكن أن يتم الكشف عن عدد قليل فقط كما ملزمة على الخرز.
وتعرض العينات المستخدمة في الشكل 3B إلى تحليل لطخة غربية مع المضادة للضريبة السلع والخدمات والأجسام المضادة للله من أجل متابعة Rec14 في جميع أنحاء الداخلي (الشكل 3C). وصمة عار مكافحة GST يظهر أن بعض GST-Rec14 وضريبة السلع والخدمات وحدها، كانت موجودة في البروتينات مزال من الخطوة تنقية GST (حارة 2)، وعشرفي الملوثات وإزالتها عن طريق تقارب خطوة تنقية صاحب العلامة. هذه وصمة عار يسمح لنا أيضا لمراقبة ذلك ضريبة السلع والخدمات قد أزيلت بكفاءة من Rec14 من العلاج PreScission وخطوة تنقية صاحب العلامة (الممرات 4-8). يهدف لمكافحة وصمة عار له للكشف عن Rec14. وبالتالي يمكن أن نؤكد أن GST-Rec14-صاحب وRec14-صاحب لم المشقوق تماما وإزالتها من حبات GST (حارة 11). علاوة على ذلك، بتركيز عال، يبدو Rec14 لتجميع (حارة 13). وباختصار، فإن النتائج المقدمة تثبت كفاءة تنقية GST-صاحب لتنقية S. pombe Rec14.
الشكل 1. الملخص التخطيطي للله GST-خطوتين طريقة تنقية تقارب. A. GST-Rec14-صاحب بناء المستنسخة في pFastBac (Baculovir . ناقلات لنا التعبير) B. تقارب خطوتين تنقية GST-Rec14-Sf9 من صاحب المحللة الخلية القابلة للذوبان:.، تليها PreScission الانقسام من ضريبة السلع والخدمات GST ملزم، وشطف مع إيميدازول ملزم TALON انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. التمثيل التخطيطي pFastBac1-GST-10xHis. GST (الأخضر)، PreScission موقع البروتيني (الضوء الأزرق)، يتم عرض الموقع multicloning (الحمراء)، و10 صاحب العلامة (الأزرق الداكن). في الحالة الأدنى هي متواليات النوكليوتيدات مصدرها PET-52B (+). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
together.within صفحة = "دائما"> 
الرقم 3. نتيجة مثالية من صاحب GST-تنقية Rec14. A. Coomassie تلوين جزء من الكل البروتين (حارة 2 و 3) والمحللة الخلية القابلة للذوبان (حارة 4 و 5) من خلايا Sf9 همية المعالجة (حارة 2 و 4) أو المصابين GST-Rec14-صاحب الفيروسة العصوية (حارة 3 و 5). Rec14-GST صاحب وتمتلك الوزن الجزيئي من حوالي 32.9 كيلو دالتون و 29 كيلو دالتون، على التوالي، وGST-Rec14-صاحب انصهار بروتين لديه الوزن الجزيئي من حوالي 61.9 كيلو دالتون. B. Coomassie تلطيخ يدل كل خطوة من طريقة تنقية البروتين (ل انظر شرح مفصل الداخلي) C. طخة غربية من الكسور التالية الإجراء تنقية مع المضادة للضريبة السلع والخدمات (حارة 1-8) ومعاداة صاحب (حارة 9-16) الأجسام المضادة.upload/50320/50320fig3large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إلى صاحب GST بروتوكول تنقية المعروضة هنا هي مناسبة لتنقية مجموعة واسعة من الأحجام من البروتينات المؤتلف: نحن تنقيته بنجاح لى RAD51 (41kDa)، piBRCA2 (120kDa)، PALB2 (130kDa)، ونسبة عالية من البروتين الوزن الجزيئي غير المستقرة الليشمانيا الطفلية: لي BRCA2 (125kDa) 6،9. وعلاوة على ذلك، فإن البروتينات المنقى مع هذا البروتوكول النشطة كيميائيا 6. نجاح هذه الطريقة يعتمد فقط على التعبير، القابلية للذوبان والاستقرار من البروتين المطلوب.
ناقلات البيولوجيا الجزيئية للتعبير في المضيفين الآخرين، مثل E. كولاي أو الخميرة، يمكن تعديلها بسهولة باستخدام ضريبة السلع والخدمات على نطاق واسع والعلامات صاحب. هذا يسلط الضوء على تطبيق وفعالية التكلفة لهذه التقنية موجودة بالنسبة لمعظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية. مجموعة متنوعة من المزايا تأثر قرارنا لاختيار الخلايا المصابة أكثر من الخلايا البكتيرية أو الثدييات لrecombinanالتعبير ر البروتين وتنقية. على سبيل المثال، يمكن للتعديلات ما بعد النقل مثل مثيلة، والفسفرة ubiquitinylation تؤثر بشدة على وظيفة الأنزيمية من البروتين 10. وبالتالي، لدراسة خصائص الفسيولوجية للبروتين، فمن مواتية لاستخدام نظام يسمح لتعديل ما بعد النقل، مثل خلايا Sf9 المصابة. ميزة أخرى لاستخدام أكثر من Sf9 خلايا الثدييات، على سبيل المثال، هو من طبيعة اقتصادية، حيث ان النظام الخلية المصابة يتطلب أقل بكثير الخلايا ويوجد أسلوب ترنسفكأيشن مكلفة بالمقارنة مع نظام الثدييات.
فإن بساطة أسلوب قدمت مساعدة الباحثين في الحصول على البروتين أو بروتين معقد في شكل منقى للغاية مع أجهزة المختبر القياسية، وهو أمر مفيد للمختبر مع الحد الأدنى من المعدات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر آن ماري ديون-كوت للمناقشات التي تؤدي إلى تطوير الأسلوب. JK وRB هي FQNRT العلماء الدكتوراه، M.-MG هو باحث فانييه CIHR، وJ.-YM هو أحد كبار الباحثين FRSQ. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث لJY. M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| E.Coli DH10Bac (competent) | Invitrogen | ||
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen | ||
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12163 | Solution I and II |
| Ultra Pure Bluo-Gal | Gibco (Life) | 15519028 | |
| IPTG | Gibco (Life) | 15529019 | |
| Sf9 infected cells | ATCC | CRL-1711 | |
| PreScission enzyme | GE Healthcare | 27084301 | |
| Grace's infected medium supplemented | Gibco (Life) | 11605-094 | |
| Fetal Bovine Serum characterized | Hyclone | SH30396.03 | |
| P/S (Penicillin-Streptomycin) | Gibco (Life) | 15070-063 | |
| Glutathione Sepharose resin | GE bioscience | 17075605 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Talon resin | Clontech | 635504 | |
| Imidazole | BioShop | 288324 | |
| Gentamicin | Gibco (Life) | 15710064 | |
| Polyclonal GST-antibody | Production in house | ||
| Monoclonal 6X-His-antibody | Clontech | 631212 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dounce homogenizer (tight) | Wheaton | 357546 | |
| Sonicator (Fisher dismembrator) | Fisher | Model 150 | |
| Dialysis bag (50 mm) | Fisher Scientific | 2115217 | |
References
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
- Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
- Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
- Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
- Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
- Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
- Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
- Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
- Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).
