GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten
Summary
In het huidige protocol, demonstreren we een zeer efficiënte en kosteneffectieve kleinschalige eiwitreiniging methode, die de zuivering van recombinante eiwitten mogelijk maakt door de unieke combinatie van een splitsbaar GST-tag en een kleine His-tag.
Abstract
Toets assays Enzymology de biochemische karakterisatie van eiwitten in vitro noodzakelijk hoge concentraties van het gezuiverde eiwit van belang. Eiwitzuivering protocollen te efficiency, eenvoud en kosteneffectiviteit 1 combineren. Hier beschrijven we de GST-His Werkwijze nieuw kleinschalig affiniteit zuiveringssysteem voor recombinante proteïnen, op basis van een N-terminale Glutathion Sepharose tag (GST) 2,3 en een C-terminaal tag 10xHis 4, die beide gefuseerd het eiwit van belang. De laatste construct wordt gebruikt om baculovirussen genereren voor infectie van Sf9-geïnfecteerde cellen voor eiwitexpressie 5. GST is een vrij lange tag (29 kDa) die dient om de zuivering efficiëntie te garanderen. Toch kan het fysiologische eigenschappen van het eiwit te beïnvloeden. Daarom is het vervolgens afgesplitst het eiwit met het enzym PreScission 6. Om maximale zuiverheid te verzekeren en de gesplitste GST te verwijderen, wevoegde een tweede affiniteitszuiveringsfase gebaseerd op de relatief kleine His-tag. Belangrijk is onze techniek waarbij twee verschillende labels aan weerszijden van de twee uiteinden van het eiwit, dat een efficiënt middel om gedegradeerde eiwitten te verwijderen en bijgevolg verrijkt full-length eiwitten. De hier gepresenteerde methode heeft een dure instrumentale setup, zoals FPLC niet nodig. Daarnaast hebben we opgenomen MgCl2 en ATP wast om heat shock protein onzuiverheden en nucleasebehandeling afschaffen verontreinigende nucleïnezuren te verwijderen. Samengevat, de combinatie van twee verschillende labels weerszijden van de N-en C-terminale en de mogelijkheid om splitsen van een van de labels, garandeert het herstel van een sterk gezuiverd en full-length eiwit van belang.
Introduction
De zuivering van recombinante eiwitten is cruciaal om fundamentele vragen in de biochemie aan te pakken. Gebruikelijke manieren eiwitzuivering zoals ionenuitwisselingschromatografie en gelfiltratie afhankelijk fysische eigenschappen van het doeleiwit zoals de iso-elektrische punt en heffingen of grootte, respectievelijk. Deze proteïne kenmerken gedeeld door een verscheidenheid van eiwitten, die aanzienlijk de kans verontreinigende proteïnen in gebruikelijke eiwitzuivering strategieën toe. Dit probleem kan worden omzeild door het gebruik van meerdere kolommen zuivering, hetgeen tijdrovend. Tegelijkertijd, deze chromatografie methoden vereisen dure experimentele opstelling. Affiniteit-zuivering tag sterk toeneemt doel-specificiteit, zoals in de meeste gevallen het label uniek het eiwit van belang zijn. In recente studies is vlag-of HA-affiniteitszuivering grote schaal gebruikt.
In tegenstelling tot bestaande recombinant eiwitzuivering protocollen waarin enkele tags worden gebruikt, hebben we de unieke combinatie van twee tags. Onze werkwijze omvat de fusie van een GST-tag aan de N-terminus en een His-tag aan het C-uiteinde van het eiwit van belang, voor een optimale verhouding tussen de hoeveelheid en zuiverheid van het gewenste eiwit. De GST is een lange markering (29 kDa), die zeer efficiënt voor zuivering op glutathion Sepharose kralen. Bovendien gebruiken GST garandeert kosteneffectiviteit van onze methode 1. De mogelijkheid splitsen van de GST met PreScission enzym (met herkenningssequentie LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, waardoor de toevoeging van twee aminozuren) heeft vele voordelen, bijvoorbeeld, en vermijdt veranderingen van de fysiologische functies eiwit door allosterische belemmering. De kleine His-tag gefuseerd met het andere eiwit uiteinde dient in een tweede zuiveringsstap eiwit zuiverheid te verhogen door het wassen van de gesplitste GST, alsmede afgebroken eiwitten en andere verontreinigingen. Bovendien wordt het protocol geen dialyse stap nodig bij het overschakelen van de GST naar de kolom Zijn-zuiveringsstap (TALON hars). Gemeenschappelijke verontreinigingen dergelijke zuiveringswerkwijzen zijn heat shock eiwitten (HSP). De toevoeging van een incubatiestap met MgCl2 en ATP maakt de verwijdering van deze verontreinigingen (figuur 1).
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) zijn gangbare technieken die afhankelijk zijn van dure instrumentatie hoge opbrengst van het gezuiverde eiwit van belang te genereren. De batch zuiveringsprotocol hier geïntroduceerde daarentegen is handmatig en niet dure instrumentele opstelling vereist. Een hoge opbrengst van eiwit kan worden bereikt door het opschalen van het protocol. Tegelijkertijd, partijnummer zuiveringsprotocol, het elutievolume kan worden aangepast om eiwitconcentratie, die niet wordt gegeven met FPLC en HPLC verbeteren.
ntent "> Ook, partijnummer GST-His zuiveringsprotocol, eiwitten met een grootte-bereik van ~ 10-300 kDa kunnen worden gezuiverd. Een van de grootste voordelen is gegeven door het feit dat een aantal eiwitten kunnen zuiveren tegelijkertijd bijvoorbeeld, zowel wild-type en de mutante eiwitten. Het succes van de gepresenteerde protocol alleen afhankelijk van het expressieniveau en de oplosbaarheid van het eiwit van belang.Protocol
Representative Results
Discussion
De GST-His zuiveringsprotocol hier gepresenteerde geschikt voor de zuivering van een breed gebied van afmetingen van recombinant eiwit: We succesvol gezuiverd Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), en een instabiele hoog molecuulgewicht eiwit Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Bovendien, de eiwitten gezuiverd met dit protocol waren biochemisch actief 6. Het succes van deze werkwijze hangt uitsluitend af van de expressie, oplosbaarheid en stabiliteit van het g…
Acknowledgements
Wij danken Anne-Marie Dion-Cote voor beraadslagingen die leiden tot de ontwikkeling van de methode. JK en RB zijn FQNRT doctorale geleerden, M.-MG is een Vanier CIHR geleerde, en J.-YM is een FRSQ senior onderzoeker. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Natural Sciences and Engineering Research Council om JY. M.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| E.Coli DH10Bac (competent) | Invitrogen | ||
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen | ||
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12163 | Solution I and II |
| Ultra Pure Bluo-Gal | Gibco (Life) | 15519028 | |
| IPTG | Gibco (Life) | 15529019 | |
| Sf9 infected cells | ATCC | CRL-1711 | |
| PreScission enzyme | GE Healthcare | 27084301 | |
| Grace's infected medium supplemented | Gibco (Life) | 11605-094 | |
| Fetal Bovine Serum characterized | Hyclone | SH30396.03 | |
| P/S (Penicillin-Streptomycin) | Gibco (Life) | 15070-063 | |
| Glutathione Sepharose resin | GE bioscience | 17075605 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Talon resin | Clontech | 635504 | |
| Imidazole | BioShop | 288324 | |
| Gentamicin | Gibco (Life) | 15710064 | |
| Polyclonal GST-antibody | Production in house | ||
| Monoclonal 6X-His-antibody | Clontech | 631212 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dounce homogenizer (tight) | Wheaton | 357546 | |
| Sonicator (Fisher dismembrator) | Fisher | Model 150 | |
| Dialysis bag (50 mm) | Fisher Scientific | 2115217 |
References
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
- Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
- Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
- Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
- Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
- Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
- Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
- Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
- Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).
