我们描述了一种方法,目标通过植入导管或进行大剂量注射到在小鼠右侧脑室中枢神经系统的药物。我们特别专注于交付反义寡核苷酸。这种技术是很容易适应其他药物和大鼠。
由于不能穿过血脑屏障,某些药物需要直接传递到中枢神经系统(CNS)。我们的实验室,专门集中于反义寡核苷酸(ASOS),虽然在这里的视频显示技术也可以用来传送了大量的其他药物的中枢神经系统。反义寡核苷酸(艾滋病服务)具有序列特异性敲除目标1以及特定基因的2的移位异构体比率的能力。为了实现广泛的基因敲除小鼠在中枢神经系统中的拼接,艾滋病服务可交付使用两个单独的给药途径,这两者中,我们证明在视频进入大脑。
第一个使用Alzet渗透泵,连接到外科手术植入的导管入侧脑室。这允许进入中枢神经系统在指定的一段时间内连续输注的艾滋病服务。第二个涉及到一个单一的静脉注射一喜GH浓度的ASO入右侧脑室。两种方法都使用鼠标脑室系统提供整个大脑和脊髓的ASO,虽然根据研究的需要,一种方法可能会比其他优选的。
有些药物是无法穿越血脑屏障(BBB),要求直接中枢神经系统(CNS)交付。要绕过血脑屏障,药物可直接传送到大脑使用所描述的方法。而我们的实验室和文件中有详细的本发明专注于反义寡核苷酸(艾滋病服务),其他药物,如小分子,抗体,基因治疗的载体, 等等 ,也可以被传递通过相同的方法。
某些蛋白质在神经退行性疾病的发病机制中发挥重要作用。这种蛋白质往往形成有毒的物种,并积累成聚集,导致最终的神经元死亡和随后的神经系统疾病3-4。在努力减缓甚至停止对这些疾病的进展,其中一个治疗方案可能是直接瞄准和减少致病蛋白质。然而,这些蛋白质经常发现无所不在通过中枢神经系统,使其难以电子 ffectively他们的目标在全球范围内。
为了在整个中枢神经系统的靶基因,我们管理艾滋病服务到小鼠脑脊液(CSF) 通过侧脑室绕过血脑屏障。这种特殊的方法充分利用沐浴整个大脑和脊髓的鼠标脑室系统,使广泛分布的ASOS。我们使用18-20聚体的RNA分子直接结合靶mRNA序列的艾滋病服务,并根据对ASO的化学修饰,无论是A)招募的RNase-H的mRNA降解导致击倒或B)的选择性剪接1转移2,16,17。应当指出的是,存在多个分子撞倒一个特定的蛋白质在体内 ,包括shRNA的。由于这些分子是不是本文的重点,我们引导读者阅读的文章,更好的细节击倒作用机制和各5-6的优势/劣势。
jove_content“>在之前的工作中,我们已经使用了艾滋病服务目标蛋白在肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)7( 图4)的转基因大鼠模型中的超氧化物歧化酶(SOD1)SOD1突变发生在约2%的所有ALS例8,虽然它已被最近虚拟SOD1可以发挥重要的作用,以及9-10。在散发性ALS的发病后显着增加通过减少总SOD1水平ALS转基因大鼠,生存。这些重要的数据成为第一个表明,在中枢神经系统中可能有ASO治疗神经疾病模式的深远而积极的影响。针对人类SOD1从那时起,艾滋病已经进入,并成功地完成了I期人体临床试验,以最小的副作用(Clnicaltrails.gov NCT01041222) ,提出在2012年第 64届美国神经病学学会计划向前移动的ASOS II期临床试验目前正在进行中。 <p类=的“jove_content”>虽然定位SOD1是第一次使用一种神经系统疾病治疗的艾滋病服务示范,其他几个研究至今已进行看着不同的疾病及彼等各自的蛋白质目标。在2010年和2011年,艾滋病,移位拼接的蛋白质运动神经元生存2(SMN2)被用来在脊髓肌肉萎缩症(SMA)的转基因小鼠模型,并在显着改善疾病表型11,12。现在,这些拼接ASOS在第一阶段我临床试验SMA患儿(NCT01494701 Clinicaltrails.gov)。此外,近期瞬态针对亨廷顿基因的艾滋病服务管理可以显着地抢救亨廷顿的小鼠模型,即使在亨廷顿蛋白水平恢复到基线13。在所有这些研究中,艾滋病被送到侧脑室,以减少总的基因水平或通过改变基因拼接整个中枢神经系统。可用于这两种渗透泵和一个单一的大剂量注射提供艾滋病服务的CSF。泵允许一个缓慢的,持续的交付,,而侧脑室丸是一种快速,一次性注射。我们都用了这些方法的成功,虽然我们还没有报道泵和丸在一个单一的转基因株系之间的直接比较。
在中枢神经系统中使用艾滋病服务是一个功能强大的方式,以减少总蛋白水平和/或改变的几种蛋白质的拼接。虽然我们使用的艾滋病服务专为治疗神经系统疾病,我们认识到,其他领域也可能受益于这种技术。感兴趣的蛋白质只要是在中枢神经系统中表达和最终目标是实现中枢神经系统范围内的基因表达的变化,使用艾滋病服务中所证明的技术可能是非常有用的。
有能力提供全球药物在中枢神经系统,在视频中显示的是一个非常强大的技术,很容易学习和使用。与实践中,一个单泵植入术或ICV丸的可以在10分钟内完成,允许在同一时间被视为大老鼠同伙。这是特别有用的研究与行为读出,随着大量的鼠标行为是至关重要的,帮忙看看显著差异。
根据我们的经验, 通过泵和注射丸提供艾滋病服务,我们已经观察到一些优点和缺点,每个方法。应当指出,这些都是在我们的实验室的意见,可能不是真的,所有的小鼠和大鼠模型。
我们发现,使用泵的优点是他们有能力提供高量分布在更长的一段时间,因为ASO的ASO。这通常等同于较长的持续击倒或拼接后活跃ASO输液,虽然这可能并不总是如此。泵也允许精确的时间框架阿苏交货(14天,28天或42天),并允许甚至更长的时间积极ASO输液泵可以更改一次。但是,我们已经注意到,改变泵多于一次增加了可变性,由于防止泵的泵,从适当的吸收液体的纤维周围的口袋形成。泵的缺点是,一些老鼠不容忍泵,以及其他。如果您正在使用的是转基因株系比较脆弱,泵可能是太麻烦了。该泵还需要被删除的最终输注后,对小鼠其他手术和增值麻醉。如果做行为的工作,这是特别重要的是消除泵,让泵存在的至少1-2周的恢复时间会影响在小鼠体内的某些行为。
与ICV丸注射,一个优点是成本。有一个前期投资购买的注射器和针头,但随着时间的推移,静推注射更具成本效益,因为没有泵/管材/导管购买。总体来说,保持侧脑室注射丸由于缺乏套管和水泵。我们还发现,ICV丸可以用来提供艾滋病服务年轻的和/或更脆弱的小鼠。 ICV丸剂的一个缺点是,它是单次注射。没有那么多整体ASO可以通过这条线路传送,如果所使用的ASO的作用的持续时间很短,拦截/剪接的影响也将是短暂的。
无论是渗透泵以及ICV丸剂有能力提供艾滋病服务,可以拦截蛋白质或改变基因的剪接在各处的啮齿动物中枢神经系统中,一种技术,神经科学相关的多个领域中有着广泛的应用。我们建议试点交付这两种方法,如果你不确定哪种给药途径最适合您的S研究pecific。
The authors have nothing to disclose.
我们想感谢柯特梅泽Isis制药有关ICV丸手术提供意见,以及Isis制药作为一个整体来提供我们的实验室与艾滋病服务。此外,我们要感谢凯里沙纳对本文的审阅。 TMM和SLD由NIH资助P50AG005681,K08NS074194,R01NS078398支持的。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027″, OD: 0.045″ |
0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
.2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
50 ml Conical Tubes | |||
100% Ethanol | |||
PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
Alcohol Pads | Select | #521 | |
Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
Antibiotic Cream | |||
Eye Ointment | |||
Electric Shaver | |||
70% Ethanol | |||
10% Provadone Iodine | |||
3% Hydogen Peroxide | |||
Warming Pad | |||
Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
Oxygen/Isoflurane System |