Summary
Ya bir kateterin yerleştirilmesi ya da farelerde sağ yan ventrikül içine, bir bolus enjeksiyonu gerçekleştirerek merkezi sinir sistemi ilaçları hedeflemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz antisens oligonükleotidler teslim odaklanmıştır. Bu teknik, diğer ilaçlara ve sıçanlara, kolaylıkla adapte edilebilir.
Abstract
, Kan-beyin bariyerinden geçebilme bir yetersizlik nedeniyle, bazı ilaçların doğrudan merkezi sinir sistemi (MSS) teslim edilmesi gerekir. Burada video gösterilen teknikler de merkezi sinir sistemine diğer ilaçların bir bolluk sunmak için kullanılabilir ama bizim laboratuar, antisens oligonükleotidler (Asos) odaklanır. Antisens oligonükleotidler (Asos) demonte dizisi özel hedefler 1 hem de belirli genlerin 2 vardiya izoformu oranları için yeteneği var. Farenin merkezi sinir sistemi yaygın gen demonte veya yapıştırma elde etmek için, biz Ásos video gösteren her ikisi de yönetim iki ayrı yolları kullanarak beyin içine gönderilmesi mümkün olmaktadır.
Birinci kullanır cerrahi lateral ventrikül içine implante bir kateter bağlı ozmotik pompalar, Alzet. Bu Ásos sürekli bir zaman süresi için, CNS nüfuz etmesine izin verir. İkinci bir yüksek tek bir bolus enjeksiyonu içerirsağ lateral ventrikül içine ASO gh konsantrasyonu. Çalışmanın gereksinimlerine bağlı olarak, tek bir yöntem diğer tercih edilebilir olsa da her iki yöntem de, tüm beyin ve omurilik ASO sunmak için, fare serebral ventriküler sistemi kullanır.
Introduction
Bazı ilaçlar doğrudan Merkezi Sinir Sistemi (MSS) teslim gerektiren, kan beyin bariyeri (KBB) çapraz edemiyoruz. BBB aşmak için, ilaç tarif edilen yöntemler kullanılarak, beyin içine doğrudan teslim edilebilir. Laboratuar ve anti-his oligonükleotidler ile ilgili kağıt detaylı tarifnamede odaklanma (Ásos) gibi küçük moleküller, antikorlar, gene terapi vektörleri, vb. Gibi diğer ilaçlar, aynı zamanda aynı yaklaşımla iletilebilirken.
Bazı proteinlerin nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde bir rol oynamaktadır. Bu proteinler genellikle nihai nöronal ölüm ve daha sonraki nörolojik hastalık 3-4 yol, agrega zehirli türler oluşturur ve birikir. Bu hastalıkların ilerlemesini yavaşlatmak ya da durdurmak için bir çaba, bir tedavi seçeneği doğrudan hedef ve neden olan protein azaltmak için olabilir. Bununla birlikte, bu proteinler çoğu zaman zor hale e, merkezi sinir sistemi boyunca her yerde her zaman bulunur v erimli küresel ölçekte onları hedef.
Tüm MSS boyunca genlerin hedef için, biz BBB atlamak için lateral ventrikül ile fare beyin omurilik sıvısı (BOS) içine Asos yönetmek. Bu özel yöntem Asos yaygın dağıtımı sağlayan, tüm beyin ve omurilik banyoları fare ventriküler sistemi yararlanır. Biz demonte yol açan mRNA aşağılamak veya B) alternatif yapıştırma 1 kaydırmak için ya A) işe RNaz-H, ASO kimyasal değişiklikler bağlı olarak, doğrudan hedef mRNA dizisi bağlamak 18-20 mer RNA benzeri moleküllerdir Asos kullanın ve , 2,16,17. Bu, birden fazla shRNA moleküller de dahil olmak üzere, in vivo olarak belirli bir protein devrilmesi için var olduğunu belirtmek gerekir. Bu moleküllerin bu makalenin odak değildir yana, makaleler yorumlayan okuyucu yönlendiren Daha çok detay demonte etki mekanizmaları ve her 5-6 avantajları / dezavantajları.
önceki çalışmada jove_content ">, biz Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) 7 (Şekil 4) bir transgenik fare modelinde protein süperoksit dismutaz 1 (SOD1) hedef Asos kullandık. SOD1 mutasyonlar gerçekleşen tüm ALS yaklaşık% 2 durumlarda 8, son zamanlarda SOD1 başlangıcı belirgin 7 artış sonra ALS transgenik fare, hayatta kalma toplam SOD1 seviyeleri azaltarak de 9-10. sporadik ALS önemli bir rol oynayabilir öne sürülmüştür rağmen. Bu önemli verileri ilk idi MSS bir ASO tedavi nörolojik bir hastalık modeli üzerinde derin olumlu bir etkisi olabileceğini göstermek için. O zamandan beri, insan SOD1 hedeflenmektedir Asos minimal yan etkileri (Clnicaltrails.gov NCT01041222) ile girmiş ve başarılı bir şekilde, insan klinik Faz tamamlamış , gibi Nöroloji 2012 64 inci yıllık Amerikan Akademisi'nde sundu. II çalışmalarda Faz ileri Asos taşımak için Planları şu anda devam etmektedir.Bu çalışmaların tümünde, Asos ile toplam gen düzeyleri azaltmak veya gen ekleme değiştirme lateral ventrikül teslim edilditüm merkezi sinir sistemi. Ozmotik pompalar ve tek bir bolus enjeksiyon, her ikisi de CSF Ásos sunmak için de kullanılabilir. Intraserebroventriküler (ICV) bolus hızlı, tek seferlik enjeksiyon ise Pompalar, yavaş, sürekli teslimat için izin verir. Biz tek bir transgenik doğrultusunda pompa ve bolus arasındaki doğrudan bir karşılaştırma rapor değil olsa Biz, başarı ile bu yöntemlerin her ikisi de kullandık.
MSS Asos kullanan toplam protein düzeyleri ve / veya birkaç proteinlerin değişimi yapıştırma azaltmak için güçlü bir yoldur. Biz nörolojik hastalıkları için bir tedavi olarak sadece Asos kullanırken, diğer alanlar da bu tekniği yararlanabilir farkındayız. Ilgi protein sürece MSS ifade ve nihai hedefi göstermiştir teknikleri Asos kullanılarak gen ifadesinde MSS çapında değişiklikler, elde etmektir gibi çok yararlı olabilir.
Protocol
Aşağıdaki protokol St Louis Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Deney hayvanlarının kullanımı için Sağlık kuralları Ulusal Sağlık Enstitüleri uygun değil. Bu cerrahisine ilk defa ise, biz 14 başlamadan önce bir giriş olarak kemirgen operasyonlarında vallahi makale bakarak öneririz.
Asos ozmotik pompa infüzyon ve tek ICV bolus hem boyunca fare MSS teslim edilebilir. Bu nedenle, aşağıda ayrıntılı prosedürü iki parça halinde kadar bozuldu. Her yöntem için artılarını ve eksilerini Tartışma bölümünde değinilecektir. Protokolleri kullanılan koordinatları yetişkin C57BL6 ve B6C3 fareler içindir. Sorumlu sıçan koordinatları Tablo 1'de bulunabilir.
Alzet ozmotik POMPA
1. Alzet Ozmotik Pompalar hazırlanması
- Steril bir drap uzandıE ve doğrudan kısırlık korumak için bir şey dokunmamaya dikkat çekerken dikkatle üzerine aşağıdaki öğeleri bırakın: ozmotik pompa (lar), akış modülatörü (ler), 1 ml steril şırınga (ler), neşter bıçak ve boru bölümleri (boru = 5 pompa 1 adet). 14 gün, 28 gün ve 42 gün (Şekil 2A): fareler için, pompalar için üç seçenek vardır.
- Kapağını çıkarın ve 15-20 ml serum fizyolojik ile steril 50 ml konik tüpler doldurun. Kadar 6 monte pompa konik tüp başına eklenebilir.
- % 100 etanol ile bir p60 Petri kabı doldurun. Etanol kateter uygun sayıda ekleyin. Fareler için, kateter uzunluğu 2.5 mm'dir.
- Gerekli olduğu kadar çok 1.5 ml lik Eppendorf tüpleri içine her ASO filtre. Tüp doldurmak için steril% 0.9 tuzlu su ile dolu bir Eppendorf tüpü içerir.
- Her şey hazırlandıktan sonra, steril eldiven koymak. Steril olmayan bir şey dokunmamaya dikkat edin. Gerekirse eldiven değiştirin.
- Her ASO kullanılmak üzere, bir 1 ml şırınga dolguve üst deliğe iğne yerleştirerek ve yavaş yavaş kadar aşırı sızıntı doldurarak loadpumps. Pompaların doldurulana kadar devam edin.
- Akış modulatöru kapağını çıkarın ve pompa takın. Bir 3-5 mm boşluk bırakarak, hemen hemen tüm yol akışını-modülatör itin.
- Neşter bıçak kullanarak, 5 eşit parça halinde boru her parça kesti. Hortumun bir parça alır, bir 1 ml şırınga kullanarak steril tuzlu su ile doldurun ve Hortumun bir ucunu akış modülatör üst yerleştirin. Daha sonra etanolden bir kanül almak ve borunun diğer ucuna bağlanmalıdır. Pompa şimdi tam monte edilir.
- Astar için tuzlu su ile steril bir 50 ml'lik konik bir tüp içine tam olarak monte edilmiş pompa yerleştirin. Astar ilaç dağıtım başlatmak için sıvı içinize yanı sıra uygun sıcaklığa gelmesini pompalar için izin verir. Astar süresi: 14 gün pompalar: 4-6 saat, 28 gün pompalar: 40 saat, 42 gün pompalar: 60 saat. Pompa montajı bittiğinde, bir temiz konik tüpler ve yer kap37 ° cerrahi kadar C su banyosu.
2. Ön cerrahi Prosedürü
- Alan sterilize ve steril bir alan oluşturmak için masa üstü ve stereotaksi üzerine steril örtüler bırakmaya% 70 etanol ile her şeyi silin. Bu, tüm ameliyat boyunca steril alanın dikkatli olmak önemlidir. Aşağıdaki açın: Boncuk Sterilizatör, ısıtma pedi, Işık, Dijital Okuma ve Oksijen / İsofluranın Sistemi (Şekil 1).
- Forseps 1 çift, 1 kavisli hemostat, küçük makas 1 çift, küçük kavisli künt makas 1 çift, 1 sıçan kemik kesici: Tek bir ameliyat veya bir bütün toplu ameliyatları rutin gibi birini yaparak, aşağıdaki öğeleri gerekecektir , 1 düz hemostat, 5-0 naylon sütür,% 70 etanol ile 1 konik tüpler,% 95 etanol ile 1 konik tüp, iyot ile 1 konik tüp, hidrojen peroksit ile 1 konik tüp, steril pamuklu paket, süper 1 şişe tutkal, 1 tüp antibiyotik merhem, göz 1 tüpyağ ve 1 elektrikli tıraş makinesi.
- 15 saniye için boncuk sterilizatör içine makas, forseps, ve kavisli hemostatı iki çift ipuçları yerleştirin. Çıkarın ve% 70 etanol içinde. Birden fazla ameliyat yaparken, hayvanlar arasında araçların ipuçları yeniden sterilize.
- % 4 izofluran ve O 2-0,4 L / dk ve odasına doğrudan gaz akışını açın. Biz anestezi uygun miktarda teslim olmasını sağlamak için yılda en az bir kalibre bizim izofluran / oksijen sistemi var. Yeri odasında fare ve nefes kadar beklemek önemli ölçüde yavaşlar. Fareyi çıkarın ve fare tamamen bilinçsiz olmasını sağlamak için bir ayak tutam gerçekleştirin.
- Kadar göz arasında 'de omuz üstünden saç tıraş. Fare uyanmak başlarsa fare bir ayak tutam ile teyit, yine tamamen bilinçsiz kadar, odasına geri fare yerleştirin. Stereotaksi üzerine anestezi fare yerleştirin ve burun üzerinde burun konisi itin.Dişleri ve kemikleri kırılgan gibi nazik olun.
- Fare anestezi tutmak için stereotaksi için gaz akışını yönlendirmek. Bu zaman zaman fare ameliyat boyunca bir ayak tutam tamamen bilinçsiz olduğundan emin olmak için kontrol etmek önemlidir. Kulak çubukları ile baş sabitleyin. Biz lateral ventrikül hedef olsa da, kulak çubukları tesviye tercih, mükemmel düzeyde kafatası nedeniyle ventrikül büyük olması gerekli değildir.
- Bakım için% 2.0 için izofluran seviyesini aşağı çevirin. Her bir göz damlasını, göz merhemi. Videoda görüldüğü gibi boyun ve baş sadece temel maruz böylece, fare üzerinde bir steril örtü yatıyordu. Daha sonra traş alanının merkezinde başlayan ve çubuk çubuk iyot batırılmış bir pamuk takip,% 95 etanol batırılmış bir pamuk ile ilk dışa doğru hareket eden bir dairesel hareketlerle baş ve boyun üst silerek cerrahi alan dezenfekte edin.
- Biz sağlayan bir rektal prob geri besleme sıcaklık kontrollü ısıtma sistemi kullanmanızı öneririzfare sıcaklığı istikrarlı bir 37 ° C 'de devam Fare sıcaklığı ameliyat sırasında azalırsa, ameliyat sonrası iyileşme daha uzun sürebilir ve ortaya çıkan hipotermi protein Tau 15 ilişkili mikrotübül bir hiperfosforilizas dahil olmak üzere, anormal protein aktivite yol açabilir. Isıtma sistemi kurduktan sonra, artık ameliyat için hazırız.
3. Alzet Ozmotik Pompa implantasyonu
- Ameliyat başlamadan önce, steril eldiven yeni bir çift koymak. Daha sonra, forseps ve makas küçük bir çift kullanarak, gözler arasında en fazla hayvanın kafatası üzerinde boyun tabanından deride bir kesi yapmak
- Yukarı bakacak şekilde eğrisi ile künt makas alın ve sol bacak doğru boyun sırt dibinde cilt altında kaydırın. Hiçbir direniş olmalıdır. Varsa, makas kaldırıp tekrar deneyin. Bu, ozmotik pompa için deri altı cep oluşturur.
- Wipe bir pamuklu çubukla takip steril pamuklu çubukla temiz kafatası, bregma geliştirmek için hidrojen peroksit batırılmış.
- Pompaların sterilite korumak için pompaları içeren 50 ml konik tüpler silin. Dikkatlice pompa konik tüp kenarlarına temas edip etmediğini özen göstererek, kavisli hemostat kullanarak konik tüp bir pompa almak. Forseps ile pompanın tabanı tutun ve kavisli hemostatla şekilde geri kalanında akış modülatör itin.
- Akış modülatör ve boru kavisli hemostat ile bir araya pompa tutun. Boyun dibinde deri altına pompa takın ve şu ana kadar bu direniş olmadan gidecek gibi sol bacak doğru geri itin. Kateter dokunmatik bir şey izin için dikkatli olun.
- Kavisli hemostatla, üst kaide karşılayan oluk de kanül kapmak. Yerine kanül sürücü hareket ettirin ve yerine sabitleyin.
- Kanül baz süper yapıştırıcı bir damla yerleştirin. Irinh sürücü ve boru düz geri işaret böylece pozisyona kanül üst.
- Bregma için kateter ucu dokunun ve Dijital ekranda koordinatları sıfır. Kateter kaldırın ve sağ-arka 0.5 mm (Şekil 2B) yanal olarak 1,1 mm hareket etmektedir. Kavisli hemostatla yolumdan cilt tutun.
- Plastik kanül tabanı güvenli bir kafatasının üst karşı basılana kadar kafatası ile ince metal kateter sürün. Metal kateter göreli ince kafatası nedeniyle farelerde kafatası doğrudan sürülebilir. Sıçan kullanıyorsanız, kateter indirmeden önce kafatasında bir delik açın.
- Uzak kafatası Üzerinde yapışkan olan herhangi bir cilt çekin. Yerine kanül / kateter tutan kanül sürücü ile, tam kuru tutkal için 1-2 dakika bekleyin.
- Kateter yerleştirme değerlendirmek için, pratik zaman, boru (Şekil 2C) ile% 2.5 FastGreen Boya 20-40 ul enjekte. 2-3 dk, Perfüzyonun bekleyin1X PBS 0.03% heparin ile e fare, ve beyin çıkarın. Kateter yerinde koronal kesin. Kateter ventriküle yerleştirildi durumunda, boya fare ventriküler sistemine (Şekil 2B) boyunca perfüze edilir.
- Sürücü yükselterek kavisli hemostatla kateter yerinde tutun. Yavaşça kanül düzgün kafatasına güvenli olduğundan emin olmak için hemostat bırakın.
- Bir pamuklu çubukla, kanül üst bastırın. Kanül üst ve taban arasındaki koru içine sıçan kemik kesme makineleri takın. Hala pamuklu çubukla tuşuna basılı iken kanül üst kapalı klibi. Kesme seviyesi denemek ve devam böylece kafatası kanül ayırmak için değil. Kanül Neşesiz geliyor yoksa, hızlı bir şekilde yeniden yapıştırıcı ve ek 2 dakika süreyle bir pamuklu çubukla basınç uygulayın.
- Sağ kanül üzerinde ekstra dikkat, 5-0 dikiş ipliği, düzenli hemostat ve forseps, tam açılış boyunca dikiş kullanma. Bir runnin kullanınkafatası üzerinde büyük bir kesi nedeniyle g yatay yatak sütür (bkz. Şekil 5).
- Baş ve boyun antibiyotik merhem bir dab uygulayın. Sökün kulak çubukları ve burun konisi gevşetin. Kurtarma için bir ısınma pad üzerinde stereotaksi ve yerden fareyi çıkarın. Tipik olarak 10-30 dakika arasında değişen, iyileşme süresi boyunca yakından fareler izleyin. Fare dolaşıyor ve kendisini tımar başlayana kadar her 2-3 dakikada bir kontrol edin.
4. Ameliyat sonrası Bakım
- Ilk hafta için ameliyat sonrası günlük fareler izleyin.
- Bir fare ağrı veya sıkıntı gibi görünüyor, biz ağrı gidermek için en fazla 5 gün boyunca her 24 saat bir kez Carprofen bir 5 mg / kg deri altı enjeksiyonu ile fare sağlayan tavsiye ederiz.
- Bir enfeksiyon olması görünüyorsa, cömertçe günlük bölgeye antibiyotik merhem uygulamak ve yara doğru iyileşir sağlamak için bir Katılan Veteriner danışın.
- R5-0 naylon dikiş dikiş ipliğinin gelen tahrişi önlemek için ameliyat sonrası 7-10 gün kaydının silinmesi.
5. Alzet Ozmotik Pompa değiştirme veya kaldırma
Pompa aktif ASO beslerken yapıldıktan sonra, ya değişti ya da tamamen kaldırılabilir.
- Aşağıdaki değişikliklerle yukarıda aynı ön-cerrahi prosedürü takip edin: 1) Eğer kavisli makas, eğri hemostat, sıçan kemik kesiciler, ne de Dijital Ekran gerekmez, ve fare yerine başkanı hazırlıyor 2), tıraş ve Pompa ve boru kavşağında fare arka dezenfekte.
- Forseps ve makas kullanarak, dik pompa / boru kavşak, fare arkasında bir 1.5 cm kesi olun. Dikkatle önemli ölçüde çekerek / bu kateter kavanoz olabilir boru üzerinde koymadan kesi dışarı pompa çekin.
- Pompayı kaldırmak için, hakkında 0.5 cm akışını modülatörü üzerindeki boru klibi ve boru t yapıştırıcı temaso mühür onu kapattı. Kuru tutkal için 1-2 dakika bekleyin. Boru geri kesi ve dikiş kapalı içine yerleştirin. Sütüre cilt ve yer ısıtılmış bir kurtarma pad üzerinde fareyi üzerine dab antibiyotik merhem.
- Pompa değiştirmek için, taze% 95 etanol ile dolu bir 10 cm tabak birlikte pompa hazır hale gelmiştir. Kateterler yeni pompa ile gerekli değildir.
- Forseps ile yeni bir pompa tut. Etanol içine parmaklarınızı batırın, pompa tutun, ve akış-modülatör atın. Daha sonra, dikkatlice ve yavaşça tüp ve kanül bağlı akış modülatöründen eski pompa çekin. En kısa sürede onu olduğu gibi, yavaş yavaş akış modülatörü Farenin dış ile hiç temas etmez sağlamak, üzerinde yeni pompa kaydırın.
- Deri altı paket ve dikiş cilt geri kesiden yeni pompa yeniden takın. Kurtarma pad üzerinde yara ve yerde fare dab antibiyotik merhem.
- Sadece pompa implantasyonu olduğu gibi, p kontrol etmek için ameliyattan sonra günlük fareler izlemekain / rahatsızlık ve enfeksiyonlar. Gerekli gördüğü gibi Carprofen ve antibiyotik ile tedavi.
ICV BOLUS
6. Ön cerrahi Prosedürü
- , 2) ile sterilize edilmiş su ve yük ile 10 ul Hamilton şırınga ve iğne temiz 1) kavisli makas, eğri hemostat ya da fare kemik kesiciler gerekmez: aşağıdaki değişikliklerle birlikte yukarıda Bölüm 2'de olduğu gibi aynı önceden cerrahi prosedürü izleyin ASO ve 3) kanül sürücü bulunduğu stereotaksik aparat için şırınga ve iğne takın.
7. ASO Bolus Enjeksiyon
- Forseps ve makas küçük bir çift kullanarak, gözler arasında en fazla boyun tabanından bir kesi yapmak.
- Çubukla bregma geliştirmek için hidrojen peroksit batırılmış bir pamuk takip steril pamuklu çubuk, temiz kafatası silin.
- Yerine şırınga / iğne taşımak ve güvenli. İğnenin kesik kısmı arka baktığından emin olun. Altiğne Bregma dokunduğu kadar. Koordinatları tüm Zero. Doğru 1.0 mm ve 0.3 mm anterior (Şekil 3A) yanal olarak iğne hareket ettirin.
- Iğne deliği kafatasının üst ile aynı hizada sadece kadar yavaşça kafatası yoluyla iğne sürücü. Yine, bu fare kafatası inceliği nedeniyle yapılabilir. Z-koordinat sıfır, 1 mm / saniye (Şekil 3B) bir oranda -3.0 mm iğne düşük. Iğnenin mühür beyin için 2-3 dakika bekleyin.
- Saniyede 1 ul'lik bir oranda ASO tam 10 ul sağlar. 2-3 dakika bekleyin. Bu oran farklı ilaçlar arasında farklılık olsa Biz, ventrikül içine Asos için 1 ul infüzyon hızı kullanın. Çalışma sırasında,% 2.5 FastGreen Boya 10-20 ul sunarak iğne doğru yerleştirilmesi için kontrol edin. Boya infüzyon kısa bir süre sonra 1X PBS 0.03% heparin ile fare serpmek ve boya ventriküler sistemi (Şekil 3C) olduğunu doğrulamak için beynin koronal bölümleri yapmak. <li> iğne tabanında kafatası karşı bir pamuklu çubuk tutun. Saniyede 1 mm bir oranda iğne kaldırın. En kısa sürede iğne kafatası dışında olduğu gibi, iğne deliğinin üzerine pamuklu rulo ve dışarı sızmasını herhangi ASO önlemek için 1 dakika tutun.
- , Kapalı deri dikin antibiyotik merhem uygulamak, ve ısıtmalı kurtarma pad üzerinde yer fare. ASO konsantrasyonuna bağlı olarak, tamamen kurtarmak için birkaç saat için 20 dakika sürebilir.
- Sadece pompa implantasyonu gibi, ağrı / rahatsızlık ve enfeksiyon kontrol etmek için ameliyat sonrası günlük fareler izlemek. Gerekli gördüğü gibi Carprofen ve antibiyotik ile tedavi.
Representative Results
Pompa infüzyon veya ICV bolus enjeksiyon sonrası belirli bir süre sonra (biz rutin olarak dört hafta kullanın), bu Asos etkisini test etmek önemlidir. Her iki ya da Western blot veya ELISA ile hem de protein düzeyi olarak kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak mRNA düzeyi (yayınlanmış örneğin, Şekil 4 de, hedef geni seviyelerini / izoformları ölçmek için beynin farklı bölgelerinde ve omurilik alarak tavsiye .) Bu farklı MSS bölge genelinde ASO etkinliğini belirlemenize yardımcı olur. Hedeflenen proteinin yarı ömrü uzunsa, biz en fazla protein demonte veya yapıştırma değerlendirmek amacıyla ASO infüzyon sonra uzun bekleme tavsiye ederiz.
Bu oligo dağıtım test etmek de önemlidir. Daha yüksek ASO konsantrasyonu genellikle yakın ventriküler sistemi 16 alanları görülür rağmen pompa infüzyon, aynı taraf ve karşı her iki yarımkürede ile dağıtım neden. ICV bolus enjeksiyonları daha Unifo verimMSS 16 ile oligo rm dağılımı, etkileri uzun ömürlü olmayabilir ama. Biz Southwell ve arkadaşları için okuyucu doğrudan. Bolus oligo dağıtım 16 karşı pompa doğrudan bir karşılaştırma görmek.
Ayrıca her ASO in vivo olarak biraz farklı davranacaktır çünkü birden fazla doz yanı sıra Asos etki süresi test tavsiye. Asos genellikle birkaç ay sonra ASO teslim süren hedef devirme ya da yapıştırma ile, eylem oldukça uzun bir süre var. Ayrıca, bazı Asos diğerlerinden daha iyi çalışır ve bazı gen hedefleri diğerlerine göre demonte daha kolay olacaktır. Bu nedenle, tarama kurşun aday belirlemek için Asos, biz bir n in vivo olarak en az 3-5 Asos test tavsiye = bir ilk geçiş olarak ASO başına 4-6 yetişkin fareler.
Asos dışında bir ilaç kullanıyorsanız, aynı zamanda pilota önemli olacaktır ideal ilaç konsantrasyonu, etki ilaç süresi ve CNS ilaç, belirli bir bileşik için daha önce dağılımı.
Tablo 1. Cerrahi Koordinat. Koordine eden intraserebroventriküler (ICV) bolus performans hem de osmotik pompalar implante zaman fareler ve sıçanlar hem de sağ lateral ventrikül vurmak için kullanılır. Her iki koordinatları, pompalar ve ICV bolus için, sağ lateral ventrikül hedef. Bu biz en çok deneyime sahip ve ASO mükemmel dağılımını sağlamak bildiklerini, çünkü iki farklı ayarlar kullanabilirsiniz.
Şekil 1. Stereotaksik Kurulum. Alzet pompa ve Bolus enjeksiyon ameliyatları için (A) gerekli stereotaksik donanım. I) Cam Boncuk sterilizer. ii) Dijital Okuma. iii) hareketli kollar ile Stereotaksik taban. iv) Sıcaklık Kontrollü Isıtma Pedi. v) Oksijen Sistemi / İsofluranın. vi) İsofluranın Odası. (B) burun konisi ve kulak çubukları kadar kapatın. (C) İki ekleri gerekli. Sol: Şırınga / ICV bolus enjeksiyon için iğne tutucu. Sağ: Ozmotik pompa implantasyonu için Kanül Sürücüsü.
Şekil 2. Ozmotik Pompa İmplantasyonu Alzet. Fareler için (A) Alzet ozmotik pompa seçenekleri. . 14 günlük pompalar (0.25 ul / saat), 28 günlük pompalar (0.25 ul / saat), 42 gün pompalar (0.15 ml / saat) (B), ikinci pompa, bregmaya implantasyon için Koordinat: Arka -0.5 mm, lateral -1.1 mm ( Sağ) ve ventral -2.5 mm (kateterin uzunluğu). (C) yoluyla sürüş sonra kateterkafatası ve yapıştırma kanül, boya lateral ventrikül içinde kateterin doğru yerleştirilmesi değerlendirmek için kateter aracılığıyla temizlendi. boya (C) olarak uygulanan hemen sonra (D) Perfüze beyin. Kateter başarıyla ventrikül yerleştirilirse, boya fare ventriküler sistem boyunca dağıtılacak.
Şekil 3,. Intraserebroventriküler Bolus Enjeksiyon. (A) bregma gelen bolus enjeksiyon için Koordinat: +0.3 mm Ön, Yanal -1.0 mm (Sağ) ve ventral -3.0 mm (B) ventral kafatası -3.0 mm ile iğne sürüş sonra, boya şırınga ile itilir. kısa bir süre (B) 'de uygulanan boya sonra ortamdaki ventrikül. (C) Perfüze beyindeki iğne doğru yerleştirilmesi değerlendirmek. Iğne başarıyla ventrikül, yerleştirilirseboya fare ventriküler sistem boyunca dağıtılacak.
Şekil 4. Duyarlılık karşıtı oligonükleotidler (Smith ve ark. 7 şirketinden alınmış, Şekil) ve in vivo sıçan SOD1 azaltır. (AD) Antisens SOD1 oligonükleotidler r146192 SOD veya SOD 100 mikrogram / gün normal farelerin sağ lateral ventrikül içine 28 gün boyunca infüze edildi şifreli. Beyin ve omurilikten (A) Endojen SOD1 mRNA düzeyleri Mah-PCR ile ölçülen. ( B) SOD1 ve a-tubulin protein düzeyleri ASO infüzyonu takiben. tübülin ve SOD1 için (C ve D) Protein seviyeleri beyin infüzyonla farklı bölgeler için sayılabilir. presenilin 1 ya da GSK-3 ve beta karşı (E) Ásos, Sağ temporal / frontal korteks değerlendirildi transgenik olmayan fare ve mRNA düzeylerinin sağ lateral ventrikül içine 2 hafta infüze edildi. Klinik Araştırmalar için American Society izniyle yayınlanmıştır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. Yatay Yatak Dikiş Koşu. 5-0 naylon dikiş ipliği cilt içinde dokunan ve dışında olan, ön başlayan ve arka çalışma, kanül üzerinde daha fazla konsantre. Bir kez en arka noktasına ulaşmış, dikiş ipliğinin sonra geri getirdi ve bir kez daha kanül üzerinde dişli. Bu uygun yara kapama sağlar ve deri yoluyla çalışmasını kanül / boru engeller.
Discussion
Video gösterildiği gibi MSS küresel ilaç teslim yeteneği hem öğrenmek ve kullanımı kolay son derece güçlü bir tekniktir. Uygulama ile, bir tek pompa implantasyonu veya ICV bolus aynı zamanda tedavi edilmesi farelerin büyük kohort için izin, 10 dakika içinde tamamlanabilir. Fare davranış için daha fazla sayıda önemli farklılıklar görmek yardımcı olmak için önemli olduğu gibi bu, bir davranış okuma ile çalışmalar için özellikle yararlıdır.
Pompalar ve bolus enjeksiyon yoluyla Asos teslim bizim deneyimlerine dayanarak, biz her yöntem için bazı artıları ve eksileri gözlemledik. Bu laboratuarımızda görüşleri ve tüm fare ve sıçan modelleri için doğru olmayabilir unutulmamalıdır.
Bu pompa kullanılmasının bir avantajı, ASO zaman çok daha uzun bir süre boyunca dağıtıldığı için, ASO yüksek bir miktar vermek için yeteneğidir bulabilirsiniz. Bu genellikle aktif sonra uzun süreli demonte veya yapıştırma eşittirASO infüzyon, ama bu her zaman böyle olmayabilir. Pompaları da ASO teslimat kesin bir zaman dilimi (14 gün, 28 gün, 42 gün) için izin verir ve pompalar da uzun süre aktif ASO enfüzyon izin vermek için bir kez değiştirilebilir. Bununla birlikte, birden fazla pompa değişen düzgün bir emici-akışkan pompa önlemek pompasının çevresindeki lifli cepleri oluşumu nedeniyle değişkenlik artırdığını fark ettik. Pompa bir dezavantajı, bir farenin hem de diğerleri pompa tolere kalmamasıdır. Çalıştığınız transgenik hat daha kırılgan ise, bir pompa çok hantal olabilir. Pompalar başka cerrahi ve katma anestezi fareler tabi, son infüzyon sonra kaldırılması gerekir. Davranışı işi, bu pompa kaldırmak ve pompanın varlığı, farelerin bazı davranışlarını etkiler çünkü geri en az 1-2 hafta içinde izin vermek için özellikle önemlidir.
ICV bolus enjeksiyonları ile, bir avantajı maliyetidir. Bir varayarlıyoruz yatırım şırınga ve iğneler satın almak, ama satın almak için pompa / boru / kateter hiç olmadığından zaman içinde, bolus enjeksiyonları daha maliyet-etkilidir. Genel olarak, kanül ve pompalar eksikliği nedeniyle ICV bolus enjeksiyonları ile yukarı tutmak daha az bulunmaktadır. Ayrıca ICV bolus genç ve / veya daha kırılgan farelere Asos sunmak için kullanılabileceğini bulmak. ICV bolus bir dezavantajı, tek bir enjeksiyon olmasıdır. Kadar genel ASO bu rota üzerinden teslim edilebilir ve kullanılan ASO etki süresi kısa ise, demonte / yapıştırma etkileri de kısa ömürlü olacak değil.
Ozmotik pompalar gibi ICV hem de büyük hap Ásos teslim etmek yeteneğine sahip olduğunu olabilir demonte proteinler ya da bütün kemirgen MSS genlerin yapıştırma, çoklu nörolojik ilgili alanlarda geniş uygulama alanı vardır bir teknik değiştirebilir. En iyi s için uygundur uygulama hangi yol emin değilseniz Biz teslimat her iki yöntem pilot öneririzpecific çalışma.
Disclosures
Yazarlar, Isis Pharmaceuticals kendi anti-his oligonükleotidler alır.
Acknowledgments
Biz Asos ile laboratuar sağlamak için bir bütün olarak ICV bolus cerrahi ile ilgili, hem de Isis İlaç tavsiye sağlamak için Isis Pharmaceuticals Curt Mazer teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, biz bu makaleye için Carey Shaner teşekkür etmek istiyorum. TMM ve SLD NIH Hibe P50AG005681, K08NS074194 ve R01NS078398 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
| Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
| Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
| Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
| 2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
| Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027", OD: 0.045" |
| 0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
| 0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
| p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
| Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
| Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
| Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
| .2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
| 1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 100% Ethanol | |||
| PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
| Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
| Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
| 5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
| Alcohol Pads | Select | #521 | |
| Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
| Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
| CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
| Antibiotic Cream | |||
| Eye Ointment | |||
| Electric Shaver | |||
| 70% Ethanol | |||
| 10% Provadone Iodine | |||
| 3% Hydogen Peroxide | |||
| Warming Pad | |||
| Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
| Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
| Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
| Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
| Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
| Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
| Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
| Oxygen/Isoflurane System | |||
References
- Crooke, S. T., Bennett, C. F.
- Sazani, P., Kole, R. Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing. The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System. Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).
- Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents. The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).
- Smith, R. A., Miller, T. M., et al. Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).
- Rosen, D. R., Siddique, T., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 6415-62 (1993).
- Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons. Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).
- Furukawa, Y. Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).
- Hua, Y., Sahashi, K., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Passini, M. A., Bu, J., et al. Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy. Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).
- Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
- Planel, E., Richter, K. E. G., et al. Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia. The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).
- Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases. Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).
