Summary
우리는 카테터를 이식하거나 마우스의 오른쪽 측면 뇌실에 알약 주입을 수행하여 중추 신경계에 약물을 대상으로하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 특히 초점을 맞 춥니 다. 이 기술은 다른 약물과 쥐에 쉽게 적응할 수있다.
Abstract
혈액 뇌 장벽을 통과 할 수 없기 때문에, 특정 약물에 직접 중추 신경계 (CNS)에 전달해야합니다. 여기에서 비디오에 표시되는 방법도 CNS에 다른 약물의 과다를 제공하는 데 사용될 수 있지만 우리의 실험실, 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (ASOS)에 특별히 초점을 맞추고 있습니다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (ASOS)는 최저 시퀀스 특정 목표 1뿐만 아니라 특정 유전자 2 교대 이소 비율로 기능이있다. 생쥐의 CNS에서 광범위한 유전자 최저 또는 접합을 달성하기 위해, ASOS 우리가 비디오에서 보여 둘 다 관리의 두 개의 분리 된 경로를 사용하여 두뇌로 전달 될 수 있습니다.
첫 번째 용도는 수술 측면 뇌실에 이식 카테터에 연결 삼투 펌프, Alzet. 이 ASOS는 지속적으로 시간의 지정된 기간 동안 CNS에 주입 할 수 있습니다. 두 번째는 첨단의 단일 알약 주입을 포함오른쪽 측면 뇌실로 ASO의 GH 농도. 연구의 필요에 따라 하나의 방법이 다른보다 선호 될 수 있지만 두 방법은 전체 뇌와 척수 ASO를 제공하는 마우스 대뇌 심실 시스템을 사용합니다.
Introduction
일부 약물은 직접 중추 신경계 (CNS) 납품을 필요로 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과 할 수 없습니다. BBB를 피하기 위해, 약물 설명한 방법을 사용하여 뇌에 직접 전달 될 수 있습니다. 연구실 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 용지 상세한 여기에 초점이 (ASOS)와 같은 작은 분자, 항체, 유전자 치료 벡터 등. 같은 다른 약물은 또한 동일한 방법을 통해 제공 될 수 있지만.
특정 단백질이 neurodegenerative 질병의 병인에 쓸모있는 역할을한다. 이러한 단백질들은 결국 신경 세포의 죽음과 이후의 신경 질환 3-4로 이어지는 집계에 유해 종을 형성하고 축적. 이 질병의 진행을 느리게 또는 중지하기위한 노력의 일환으로, 하나의 치료 옵션은 직접 대상과 원인 단백질을 감소시킬 수 있습니다. 그러나, 이러한 단백질은 종종 어려운 전자로 만드는 CNS를 통해 재하 발견 ffectively 세계적인 규모에 그들을 대상입니다.
전체 CNS에 걸쳐 유전자를 표적으로하기 위해, 우리는 BBB를 우회하는 측면 뇌실을 통해 마우스 뇌척수액 (CSF)에 ASOS을 관리 할 수 있습니다. 이 특정 방법은 ASOS의 광범위한 유통을 허용, 전체 뇌와 척수를 목욕 마우스 심실 시스템을 활용합니다. 우리는 최저로 이어지는 mRNA의 저하 또는 B) 대체 접합 1을 이동하거나 A) 모집의 RNase-H, ASO 화학 수정에 따라, 직접 대상 mRNA의 순서를 바인딩 18-20 메르 RNA 같은 분자 ASOS를 사용하여 , 2,16,17. 그것은 여러 분자 shRNA를 포함한 생체 내에서 특정 단백질을 노크 존재 주목해야한다. 이러한 분자는이 문서의 초점이 아니므로, 우리는 문서를 검토하려면 독자를 직접 더 나은 세부 최저 행동의 메커니즘과 각 5-6의 장점 / 단점.
이전의 연구에서는 jove_content ">, 우리는 루게릭 병 (ALS) 7 (그림 4)의 형질 전환 쥐 모델에서 단백질 옥사이드에게 불균등 화 효소 1 (SOD1)을 대상으로 ASOS를 사용했습니다. SOD1의 돌연변이 발생하는 모든 ALS의 약 2 %에 사례 8, 그것은 최근 SOD1가 발병이 크게 7 증가 된 후 ALS 유전자 변형 쥐의 생존에 총 SOD1 수준을 감소하여도 9-10. 산발적 인 ALS에 중요한 역할을 할 수 있다는 가설을 가지고 있지만. 이러한 중요한 데이터는 먼저했다 CNS에서 ASO 치료는 신경 질환 모델에 지대한 긍정적 인 영향을 미칠 수 있다고 표시합니다. 그 이후, 인간 SOD1을 대상으로 ASOS 최소한의 부작용 (Clnicaltrails.gov NCT01041222)를 입력하고 성공적으로 I 인간적인 임상 시험 단계를 완료 같은 신경의 2012 년 64 번째 연례 미국 아카데미에서 발표했다. II 시험을 단계로 앞으로 ASOS를 이동하는 계획이 현재 진행되고 있습니다.이러한 연구 모두에서, ASOS는을 통해 전체 유전자의 수준을 감소 시키거나 유전자 접합을 변경하는 측면 뇌실에 전달했다전체 CNS. 삼투 펌프와 하나의 알약 주입 모두 CSF에 ASOS을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 뇌실 (ICV) 알약은 빠르고, 한 번 주입 반면 펌프, 느린, 지속적인 배달 할 수 있습니다. 우리는 하나의 형질 전환 라인 펌프와 알약 간의 직접 비교를보고하지 않은하지만 우리는 성공이 방법을 모두 사용하고 있습니다.
CNS에서 ASOS를 사용하여 총 단백질 수준 및 / 또는 여러 단백질의 변화 접합을 감소 할 수있는 강력한 방법입니다. 우리는 신경 질환에 대한 치료로 전용 ASOS를 사용하는 동안, 우리는 다른 분야도이 기술의 혜택을 누릴 수 있다는 것을 인식하고 있습니다. 관심의 단백질만큼이 CNS에 표현 궁극적 인 목표는 증명 기법 ASOS을 사용하여 유전자 발현의 CNS 넓은 변화를 달성하는 것입니다로 매우 유용 할 수 있습니다.
Protocol
아래의 프로토콜은 세인트 루이스의 워싱턴 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소를 준수하고 있습니다. 이 수술을 수행하는 첫 번째 시간 인 경우에, 우리는 14를 시작하기 전에 도입으로 설치류 수술에 조브 기사를 찾고 좋습니다.
ASOS는 삼투 펌프 주입하고 하나의 ICV의 알약 주입 양을 마우스 CNS에 전달 될 수 있습니다. 이 때문에 아래에 설명 된 절차는 두 부분으로 나뉩니다. 각 방법의 장단점을 토론 섹션에 감동 할 것입니다. 프로토콜에서 사용되는 좌표는 성인 C57BL6 및 B6C3 쥐위한 것입니다. 해당 쥐의 좌표는 표 1에서 볼 수 있습니다.
ALZET 삼투 펌프
1. Alzet 삼투 펌프의 준비
- 멸균 DRAP을 규정전자 직접 불임 유지하기 위해 아무것도 만지지 않도록주의하면서 조심스럽게 끌어 다음 항목을 드롭 : 삼투 펌프, 흐름 변조기, 1 ML 멸균 주사기 (들), 메스 블레이드와 튜브의 섹션을 (튜브 = 5 펌프 1 조각). 십사일 28 일, 42 일 (그림 2A) : 마우스의 경우, 펌프를위한 세 가지 옵션이 있습니다.
- 모자를 벗다 15-20 ML 식염수와 멸균 50 ML 원뿔 튜브를 채 웁니다. 최대 6 조립 펌프는 원뿔 관 당 추가 할 수 있습니다.
- 100 % 에탄올로 P60 페트리 접시를 채우십시오. 에탄올로 카테터의 적절한 수를 추가합니다. 마우스의 경우, 카테터의 길이는 2.5 mm이다.
- 필요에 따라 1.5만큼 ML 에펜 도르프 튜브에 각 ASO를 필터링합니다. 와 함께 튜브를 채우기 위해 멸균 0.9 %의 생리 식염수로 가득 에펜 도르프 튜브를 포함합니다.
- 모든 것이 준비되면, 멸균 장갑을 넣어. 멸균되지 않습니다 아무것도 만지지 않도록합니다. 필요에 따라 장갑을 변경합니다.
- 각 ASO를 사용하는 경우, 1 ML의 주사기를 채우그리고 상단 구멍에 바늘을 삽입하고 천천히 때까지 초과 누출을 작성하여 loadpumps. 펌프의 모든 채워질 때까지 계속합니다.
- 흐름 변조기 모자를 벗다 및 펌프에 삽입합니다. 3-5 밀리미터 간격을두고 거의 모든에있는 방법의 흐름 변조기를 누르십시오.
- 메스 블레이드를 사용하여, 5 동일한 세그먼트로 튜브의 각 조각을 잘라. 튜브의 한 조각을 가지고, 1 ML의 주사기를 사용하여 멸균 생리 식염수로 채운 튜브의 한쪽 끝으로 흐름 변조기의 상단을 삽입합니다. 다음 에탄올 정맥을 가지고 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다. 펌프는 이제 완전히 조립되어 있습니다.
- 프라이밍 식염수와 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 완전히 조립 된 펌프를 놓습니다. 프라이밍은 약물 전달을 시작하는 액체를 흡수뿐만 아니라 적당한 온도에 와서 펌프 수 있습니다. 프라이밍 시간 : 14 일간 펌프 : 4-6 시간 28 일 펌프 : 40 시간 42 일 펌프 : 60 시간. 펌프 조립 완료되면, 깨끗 원뿔 튜브와 장소를 캡37 ° 수술까지 C의 물을 욕조.
2. 수술 전 절차
- 지역을 소독 및 멸균 필드를 만들 테이블 위쪽과 stereotax에 멸균 커튼 누워 70 % 에탄올로 다 닦아. 그것은 전체 수술을 통해 무균 영역을 염두 것이 중요합니다. 다음 켜십시오 : 비드 살균기, 난방 패드, 빛, 디지탈 해독 및 산소 / isoflurane을 시스템 (그림 1).
- 포셉 한 쌍, 1 곡선 지혈, 작은 가위 1 쌍의 작은 곡선 무딘 가위 1 쌍, 1 쥐의 뼈 절단기 : 하나의 수술 또는 전체 일괄 수술 우리가 일상적처럼 하나를 수행하면 다음과 같은 항목이 필요합니다 1 똑바로 지혈, 5-0 나일론 봉합사, 70 % 에탄올로 1 원뿔 튜브, 95 % 에탄올로 1 원뿔 관, 요오드와 1 원뿔 관, 과산화수소 1 원뿔 관, 멸균 면봉의 패키지, 슈퍼 1 병 접착제, 1 관 항생제 연고, 눈의 1 관윤활유 및 1 전기 면도기.
- 15 초 동안 비드 살균기로 가위, 집게, 그리고 곡선 지혈 두 쌍 팁을 놓습니다. 제거하고 70 % 에탄올에 배치합니다. 하나 이상의 수술을 수행 할 때, 동물 사이에 악기의 끝을 다시 소독.
- 4 %로 isoflurane을하고 O 2-0.4 L / 분, 챔버에 직접 가스의 흐름을 켭니다. 우리는 마취의 적절한 금액을 제공되는 것을 보장하기 위해 일년에 적어도 하나의 교정 우리 isoflurane을 / 산소 시스템이 있습니다. 장소 챔버에 마우스와 호흡 때까지 기다리이 상당히 느려집니다. 마우스를 제거하고 마우스가 완전히 의식하기 위해 발가락 핀치를 수행합니다.
- 최대 눈 사이에 어깨 상단에서 머리를 면도. 마우스가 깨어지기 시작하면 마우스가 발가락 핀치와 확인, 다시 완전히 의식이 될 때까지 의회에 다시 마우스를 놓습니다. stereotax에 마취 마우스를 놓고 코에 코 콘을 누릅니다.치아와 뼈가 허약으로 부드럽게해야합니다.
- 마우스를 마취 유지하기 위해 stereotax에 가스 흐름을 연출합니다. 그것은 가끔 마우스가 수술 내내 발가락 핀치와 완전히 의식이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 귀 막대 머리를 고정합니다. 우리는 뇌실을 대상으로하지만, 귀 막대를 수평 선호 완벽한 수준의 두개골 인해 뇌실의 큰 크기를 할 필요가 없습니다.
- 유지 보수를 위해 2.0 %로 isoflurane을 수준을 낮추십시오. 각각의 눈 위에 덩어리 눈 연고. 영상에서 볼 수 있듯이 목과 머리 만 기초가 노출되도록, 마우스를 통해 멸균 드레이프를 놓는다. 그런 면도 영역의 중앙에서 시작하여 면봉 면봉 요오드에 담근면 그 다음 95 % 에탄올에 담근면 우선 바깥쪽으로 이동 원형 모션에서 머리와 목의 상단을 닦아 수술 영역을 소독.
- 우리는 보장 직장 프로브 피드백 온도 제어 난방 시스템을 사용하는 것이 좋습니다마우스의 온도가 안정 37 ° C.에 남아 마우스의 온도가 수술하는 동안 감소하는 경우, 수술 후 회복 시간이 더 오래 걸릴 수 있으며, 그 결과 저체온증 단백질 타우 15 관련 소관의 hyperphosphorylation 등 비정상적인 단백질의 활동으로 이어질 수 있습니다. 난방 시스템을 설정 한 후, 당신은 지금 수술을 시작할 준비가 된 것입니다.
3. Alzet 삼투 펌프의 주입
- 수술을 시작하기 전에, 멸균 장갑 한 켤레에 넣어. 그런 다음, 집게와 가위의 작은 쌍을 사용하여, 두 눈 사이에 최대 동물의 두개골 위에 목의 기지에서 피부 절개를
- 위로 향 곡선 무딘 가위를 타고 왼쪽 뒷다리으로 목 뒤의 기초에서 피부 아래에 밀어 넣습니다. 저항이 없어야합니다. 이 경우 가위를 제거하고 다시 시도하십시오. 이 삼투 펌프 피하 포켓을 형성한다.
- 무선체육 면봉 다음 멸균 면봉 깨끗한 두개골, 브레 그마을 향상시키기 위해 과산화수소에 담근.
- 펌프의 불임을 유지하기 위해 펌프를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브를 닦아냅니다. 조심스럽게 펌프 원뿔 튜브의 측면에 접촉하지 않는 여분의주의하면서 곡선 지혈을 사용하여 원뿔 튜브에서 펌프를 가지고. 집게로 펌프의 기초를 잡고 곡선 지혈과 방법의 나머지 부분의 흐름 변조기를 누릅니다.
- 흐름 변조기와 튜브가 곡선 지혈에 맞는 펌프를 누릅니다. 목의 기초에 피부의 밑에 펌프를 삽입하고 끝까지 저항없이 들어갈 때 왼쪽 뒷다리쪽으로 다시 밀어 넣습니다. 카테터 터치 아무것도시키지 않도록주의해야합니다.
- 곡선 지혈과 함께 상단 받침대를 충족 홈에서 정맥을 잡아. 위치로 정맥 드라이버를 이동하고 제자리에 고정합니다.
- 정맥의 기초에 최고 접착제 한 방울을 넣습니다. 고름H 드라이버와 튜브가 바로 다시 지적 될 수 있도록 위치에 정맥의 상단.
- 브레 그마에 카테터 끝을 터치 디지털 디스플레이의 좌표를 제로. 카테터를 올리고 오른쪽 후방 0.5 mm (그림 2B)로 옆 1.1 mm를 이동합니다. 곡선 지혈과 길에서 피부를 잡아.
- 플라스틱 정맥베이스가 안전하게 두개골의 상단에 누를 때까지 두개골을 통해 얇은 금속 카테터를 운전. 금속 도관은 상대적으로 얇은 두개골에 의한 생쥐의 두개골을 통해 직접 구동 할 수 있습니다. 쥐를 사용하는 경우, 카테터을 낮추는 전에 두개골에 구멍을 뚫습니다.
- 멀리 두개골에서 거기에 접착제가있는 피부를 당겨 빼냅니다. 장소에 정맥 / 카테터를 잡고 정맥 드라이버와, 완전히 건조 접착제 1-2 분 기다립니다.
- 카테터를 평가하기 위해, 연습 할 때, 튜브 (그림 2C)를 통해 2.5 % FastGreen 염료의 20-40 μl를 주입. 2 ~ 3 분, perfus을 기다립니다1X PBS 0.03 % 헤파린 사용하여 전자 마우스를, 그리고 두뇌를 제거합니다. 카테터 사이트에서 coronally 잘라. 카테터가 우심실에 배치 된 경우, 염료 마우스 심실 시스템 (그림 2D)를 통해 관류됩니다.
- 드라이버를 높이면서 곡선 지혈과 장소에 카테터를 잡습니다. 천천히 정맥이 제대로 두개골에 고정되도록 지혈을 놓습니다.
- 면봉으로, 정맥의 정상에 누르십시오. 정맥의 상단과베이스 사이의 숲에 쥐 뼈 어선을 맞 춥니 다. 여전히 면봉으로 누르면서 정맥의 상단을 클립. 가위 수준을 시도하고 유지할만큼 두개골에서 정맥을 분리하지. 정맥는 것은 unglued 올 않는 경우, 신속하게 재 접착제 및 추가 2 분 면봉으로 압력을 적용합니다.
- 오른쪽 정맥에 특별한 관심을 지불, 5-0 봉합 실, 정기적으로 지혈 및 집게, 완전 개방에 따라 봉합사를 사용하여. 우리는 도망을 사용두개골에 큰 절개에 의한 g 수평 매트리스 봉합 (그림 5 참조).
- 머리와 목에 항생제 연고 소량을 적용합니다. 나사를 풀고 귀 바, 코 콘을 풉니 다. 복구를위한 온난 패드 stereotax과 장소에서 마우스를 제거하십시오. 일반적으로 10-30분에 이르기까지, 회복 기간 동안 밀접하게 마우스를 모니터링합니다. 마우스가 걷는 그 자체를 손질 시작할 때까지 2 ~ 3 분 확인합니다.
4. 수술 후 케어
- 첫 주에 대한 수술 후 일상 마우스를 모니터링합니다.
- 마우스가 통증이나 고통에 나타납니다 있다면, 우리는 고통을 완화하기 위해 최대 5 일 동안 매일 24 시간 한 번 Carprofen의 5 MG / kg 피하 주사와 마우스를 제공하는 것이 좋습니다.
- 감염이있을 나타나면 아낌없이 매일 영역에 항생제 연고를 적용하고 상처가 제대로 치유되도록 참석 수의사에게 문의하십시오.
- R5-0 나일론 봉합사에게 봉합 스레드에서 자극을 방지하기 위해 수술 후 7-10일를 emove.
5. Alzet 삼투 펌프를 변경하거나 제거
펌프가 적극적으로 ASO를 주입 완료되면, 그것은 하나를 변경하거나 완전히 제거 할 수 있습니다.
- 다음과 같은 변경 위와 같은 사전 수술 절차를 따르십시오 : 1) 당신이 곡선 가위, 곡선 지혈, 쥐의 뼈 절단기, 또는 디지털 디스플레이를 필요로하지 않습니다, 대신 마우스의 머리를 준비하고, 2), 면도 펌프와 튜브의 교차점에 마우스의 뒷면을 소독.
- 집게와 가위를 사용하여, 수직 펌프 / 튜브 접합부에있어서의 마우스의 뒷면에 1.5 cm의 절개를합니다. 조심스럽게 크게 당겨 / 그것은 카테터를 항아리 수 있으므로 튜브에 누르지 않고 절개 밖으로 펌프를 당깁니다.
- 펌프를 제거하려면 약 0.5 cm 흐름 변조기 위에 튜브를 자르고 튜브 t에 순간 접착제를 만지지O 물개는 종료합니다. 건조 접착제 1-2 분을 기다립니다. 튜브를 다시 절개 및 봉합 종료에 배치합니다. 봉합 피부와 장소 온수 복구 패드에서 마우스를 위에 덩어리 항생제 연고.
- 펌프를 변경하려면, 갓 95 % 에탄올로 가득 10cm 접시와 함께 펌프가 준비 만들었습니다. 카테터는 새로운 펌프 필요하지 않습니다.
- 집게로 새로운 펌프를 잡아. 에탄올에 손가락을 담그고, 펌프의 파악을하고, 흐름 변조기 버린다. 그런 다음, 조심스럽게 천천히 튜브 및 정맥에 연결된 흐름 변조기에서 이전 펌프를냅니다. 마자가 꺼져으로 천천히 흐름 변조기는 마우스의 바깥 쪽을 접촉하지 않는 것이 보장에 새로운 펌프를 밀어 넣습니다.
- 피하 패킷 봉합 피부에 다시 절개를 통해 새로운 펌프를 삽입합니다. 복구 패드에 상처 곳에 마우스 덩어리 항생제 연고.
- 그냥 펌프 주입과 마찬가지로, p를 확인하기 위해 수술 후 일상 생쥐를 모니터링아인 / 불편 및 감염. 필요하다고 인정하는 Carprofen와 항생제로 치료.
ICV 알약
6. 수술 전 절차
- 2)와 멸균 물과 부하 10 μL 해밀턴 주사기와 바늘을 청소 1) 곡선 가위, 곡선 지혈 또는 쥐 뼈 절단기를 필요로하지 않습니다 다음과 같이 변경 위에서 2 장에서와 같은 사전 수술 절차를 따르십시오 ASO, 3) 정맥 드라이버가 위치한 정위 장치에 주사기와 바늘을 연결합니다.
7. ASO의 알약 주입
- 집게와 가위의 작은 쌍을 사용하여, 두 눈 사이의 최대 목의 기지에서 절개를합니다.
- 면봉 브레 그마을 향상시키기 위해 과산화수소에 담근면 다음에 멸균 면봉, 깨끗한 두개골을 닦으십시오.
- 제자리에 주사기 / 바늘을 이동하고 고정합니다. 바늘의 경 사진 부분이 후방에 직면해야합니다. 낮 춥니 다바늘 브레 그마 그것을 닿을 때까지. 좌표를 모두 제로. 오른쪽 1.0 mm와 전방 0.3 mm (그림 3A)에 옆으로 바늘을 이동합니다.
- 바늘 구멍이 두개골의 윗부분과 단지까지 천천히 두개골을 통해서 바늘을 구동한다. 다시 말하지만,이 마우스 두개골의 두께에 따라 수행 할 수 있습니다. Z-좌표를 제로 1mm / 초 (그림 3B)의 속도로 -3.0 mm 바늘을 낮 춥니 다. 바늘 주위를 밀봉하는 두뇌에 대한 2 ~ 3 분을 기다립니다.
- 초 당 1 μL의 비율로 ASO의 전체 10 μl를 제공합니다. 2 ~ 3 분을 기다립니다. 이 비율이 다른 약물에 따라 상이 할 수 있지만 우리는 뇌실에 ASOS 위해 1 μL 주입 속도를 사용합니다. 연습 할 때, 2.5 % FastGreen 염료의 10-20 μl를 제공하여 바늘의 적절한 배치를 확인합니다. 염료 주입 후 즉시 1X PBS 0.03 %의 헤파린 마우스를 붓는다 및 염료 심실 시스템 (그림 3C)에 있는지 확인하기 위해 뇌의 관상 섹션을 확인합니다. <리> 바늘의 기지에서 두개골에 면봉을 잡습니다. 초에 1 mm의 속도로 바늘을 올립니다. 즉시 바늘이 두개골 밖으로이기 때문에, 바늘 구멍에 면봉을 굴려 밖으로 유출하는 ASO을 방지하기 위해 1 분 동안 누르고 있습니다.
- 폐쇄 피부를 봉합 항생제 연고를 적용하고, 가열 복구 패드에 장소 마우스. ASO 농도에 따라, 완전히 복구하는 데 몇 시간에 20 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 그냥 펌프 주입과 마찬가지로, 통증 / 불편 및 감염 확인하기 위해 수술 후 일상 생쥐를 모니터링합니다. 필요하다고 인정하는 Carprofen와 항생제로 치료.
Representative Results
펌프 주입 또는 ICV 러스 주사 후 지정된 시간이 지난 후 (우리가 일상적으로 4 주 사용), 그것은 ASOS의 효능을 테스트하는 것이 중요합니다. 우리는 둘 다 서쪽 오점 또는 ELISA를 사용하여뿐만 아니라 단백질 수준으로 정량 실시간 PCR을 사용하여 mRNA의 수준 (간행 예를 들어, 그림 4에서 표적 유전자의 수준 / 아형을 측정하는 두뇌의 여러 지역과 척수를 복용하는 것이 좋습니다 ). 이것은 다른 CNS 지역에 걸쳐 ASO 효능을 결정하는 데 도움이됩니다. 대상 단백질의 반감기가 긴 경우, 우리는 최대 단백질 최저 또는 접합을 평가하기 위해 ASO 주입 한 후 더 이상 기다리고 좋습니다.
그것은 올리고 배포를 테스트하는 것도 중요합니다. 높은 ASO 농도는 종종 가까운 심실 시스템 16 지역에서 볼 수 있지만 펌프 주입은 동측 및 반대측 반구를 통해 배포 될. ICV 알약 주사보다 제복을 산출CNS 16을 통해 올리고의 RM 분배 효과가 오래 지속되지 않을 수도 있지만. 우리는 사우스 외 판독기를 연출합니다. 알약 올리고 분포 16 대 펌프의 직접 비교를 참조 할 수 있습니다.
우리는 또한 각 ASO는 생체 내에서 약간 다르게 동작합니다 때문에 여러 복용뿐만 아니라 ASOS의 작용 지속 시간을 테스트하는 것이 좋습니다. ASOS는 일반적으로 몇 개월 후 ASO 전달을 지속 대상 최저 또는 접합으로, 행동의 비교적 긴 기간이 있습니다. 또한, 일부 ASOS 다른 사람보다 더 잘 작동합니다 및 일부 유전자의 대상은 다른 사람보다 최저 쉬울 것입니다. 이 때문에 심사 리드 후보를 결정하기 위해 ASOS 때, 우리는 N으로 생체 내에서 최소한 3-5 ASOS 테스트를 권장 = 첫 번째 패스로 ASO 당 4-6 성인 마우스.
ASOS 이외의 약물을 사용하는 경우, 그것은 또한 조종사 중요 할 것이다 이상적인 약물 농도, 액션의 약 기간, CNS 약물특정 화합물 분포.
표 1. 수술은 조정한다. 좌표는 뇌실 (ICV) 알약을 수행 할뿐만 아니라, 삼투 펌프를 이식 할 때 마우스 및 쥐 모두에서 오른쪽 측면 뇌실을 공격하는 데 사용됩니다. 두 좌표는, 펌프 및 ICV의 알약에 대해, 오른쪽 측면 뇌실을 대상으로. 이 우리와 함께 가장 경험이 있고 ASO의 뛰어난 기능을 제공하며 무엇을 알고 있기 때문에 우리는 두 개의 다른 세트를 사용합니다.
그림 1. 정위 설정. Alzet 펌프 알약 주입 수술에 대한 (A) 필요한 정위 장비. 나) 유리 구슬은 소독R. ⅱ) 디지털 판독. III) 이동 무기와 정위 기초. IV) 온도 제어 난방 패드. V) 산소 시스템 / isoflurane을. VI) isoflurane을 상공 회의소. (B) 코 콘과 귀 막대를 닫습니다. (C) 두 개의 첨부 파일이 필요합니다. 왼쪽 : 주사기 / ICV 러스 주사 바늘 홀더. 오른쪽 : 삼투 펌프 주입을위한 정맥 드라이버.
그림 2. 삼투 펌프 주입을 Alzet. 마우스에 대한 (A) Alzet 삼투 펌프 옵션을 제공합니다. 14. 일 펌프 (0.25 μL / HR) 28 일 펌프 (0.25 μL / HR) 42 일 펌프 (0.15 μL / HR)는 (B) 브레 그마에서 펌프 착상 위치 : 후방 -0.5 mm, 측면 -1.1 mm를 ( 오른쪽), 그리고 복부 -2.5 mm (카테터의 길이). (C)를 통해 카테터를 구동 한 후두개골과 접착 정맥, 염료는 측뇌실 카테터의 적절한 위치를 평가하기 위해 카테터를 통해 플러시됩니다. 염료 (C)에서와 같이 투여 직후 (D) 관류 뇌. 카테터가 성공적으로 뇌실에있는 경우, 염료 마우스 심실 시스템을 통해 배포됩니다.
그림 3. 뇌실 알약 주입. (A) 브레 그마에서 알약 주입 위치 : +0.3 mm 전방, 측면 -1.0 mm (오른쪽), 그리고 복부 -3.0 mm를 (B) 복부 두개골 -3.0 mm를 통해 바늘을 구동 한 후, 염료를 주사기를 통해 푸시됩니다. 곧 (B)에서와 같이 투여 염색 한 후 나중에 뇌실. (C) 관류 뇌 바늘의 적절한 배치를 평가한다. 바늘이 성공적으로 뇌실,에있는 경우염료 마우스 심실 시스템을 통해 배포됩니다.
그림 4. 안티센스 올리고 핵산 (스미스 등 7.에서 직접 찍은 그림) 생체 내에서 쥐 SOD1을 줄일 수 있습니다. (AD) 안티센스 SOD1 올리고 뉴클레오티드는 r146192를 SOD 나 SOD가 100 ㎍ / 일에 정상 쥐의 우측 측뇌실 후 28 일 동안 주입 하였다 스크램블. 뇌와 척수에서 (A) 내생 SOD1 mRNA 수준은 QRT-PCR로 측정. ( B) SOD1과-튜 불린 단백질 수준은 ASO 주입에 따라. tubulin에와 SOD1에 대한 (C와 D) 단백질 수준은 뇌의 다음 주입의 다른 지역에 대한 정량화. presenilin 1, GSK-3 및 베타에 (E) ASOS, 오른쪽 측두엽 / 전두엽 피질에서 평가 비 형질 전환 마우스 및 mRNA 수준의 오른쪽 측면 뇌실에 2 주 주입 하였다. 임상 조사에 대한 미국 사회의 허가를 재현하는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 수평 매트리스 봉합을 실행합니다. 5-0 나일론 봉합사 스레드가 피부에 길쌈하고 밖으로 전방 시작 후방 작업 정맥에 더 집중하고있다. 일단 가장 후방 지점에 도달하는 데, 봉합 스레드가 다시 제기 한 번 더 캐 뉼러를 통해 스레드됩니다. 이 적절한 상처 봉합을 보장하고 피부를 통해 작동 정맥 / 튜브를 방지 할 수 있습니다.
Discussion
동영상과 같이 CNS 세계적으로 약물을 전달하는 능력은 모두 배우고 사용하기 쉬운 매우 강력한 기술입니다. 연습으로, 하나의 펌프 주입 또는 ICV 러스가 동시에 처리 할 마우스의 대규모 코호트를 허용, 10 분에 완료 할 수 있습니다. 마우스 동작에 대한 큰 숫자가 큰 차이를 볼 수 있도록하는 것이 중요하다 등이, 행동 판독과 연구에 특히 유용합니다.
펌프 알약 주사를 통해 ASOS을 제공하는 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 각각의 방법에 장단점을 관찰했다. 그 다음은 우리의 실험실에서 의견이며 모든 마우스와 쥐 모델에 해당되지 않을 수 있습니다 주목해야한다.
우리는 펌프를 사용하는 장점은 ASO는 시간이 더 긴 기간에 걸쳐 분산되어 있기 때문에 ASO의 높은 금액을 제공 할 수있는 능력 찾을 수 있습니다. 이것은 일반적으로 활성화 된 후 더 이상 지속 최저 또는 접합 동일합니다ASO 주입,하지만 이것은 항상 사건되지 않을 수 있습니다. 펌프는 ASO 전달의 정확한 시간 프레임 (십사일 28 일 42 개 일) 수와 펌프도 더 이상 활성화 ASO 주입을 허용 한 번 변경할 수 있습니다. 그러나, 우리는 두 번 이상 펌프를 변경하는 것이 적절 액체를 흡수에서 펌프를 방지 펌프 주위에 섬유 주머니의 형성으로 인해 변동성을 증가 것으로 나타났습니다. 펌프의 단점은 어떤 마우스뿐만 아니라 다른 사람과 같은 펌프를 용납하지 않을 것입니다. 작업중인 형질 전환 라인이 더 허약 한 경우, 펌프가 너무 복잡 할 수 있습니다. 펌프는 또 다른 수술과 추가 마취 쥐를 복종, 최종 주입 후 제거해야합니다. 행동 작업을 수행하는 경우, 펌프를 제거하고 펌프의 존재는 마우스에있는 어떤 행동에 영향을 미칠 것이기 때문에 복구의 적어도 1 ~ 2 주간 수 있도록하는 것이 특히 중요합니다.
ICV 알약 주사 한 장점은 비용입니다. 가초기 투자는 주사기와 바늘을 구입 수 있지만 구입하는 펌프 / 튜브 / 카테터가 없을 있기 때문에 시간이 지남에 따라, 알약 주사보다 비용 효과적입니다. 전반적으로, 캐 뉼러 및 펌프의 부족으로 인해 ICV 알약 주사와 함께 - 유지 적은있다. 우리는 또한 ICV의 알약이 젊은 및 / 또는 그 이상의 깨지기 쉬운 마우스에 ASOS을 제공하는 데 사용할 수 있습니다 찾을 수 있습니다. ICV 알약의 단점은 단 하나 주입 것입니다. 많은 전체 ASO는이 경로를 통해 전달 될 수 있고, 사용되는 ASO의 작용 지속 시간이 짧은 경우, 최저 / 접합 효과는 단명 않을 것이다.
삼투 펌프뿐만 아니라 ICV의 알약 모두 ASOS을 제공 할 수있는 능력을 가지고 할 수있는 최저 단백질 또는 전체 설치류 CNS에있는 유전자의 접합, 여러 신경 과학 관련 분야에서 광범위한 응용 프로그램을 가지고 기술을 변경합니다. 당신이 가장의 적합 투여되는 경로를 모르는 경우, 우리는 배달의 두 가지 방법을 조종하는 것이 좋습니다pecific 연구.
Disclosures
저자는 이시스 제약에서 자신의 안티센스 올리고 뉴클레오티드를받을 수 있습니다.
Acknowledgments
우리는 ASOS 우리의 실험실을 공급 전반적으로 ICV 알약 수술에 관한뿐만 아니라, 이시스 제약 조언을 제공하기 위해 이시스 제약에서 커트 메이져에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한, 우리는이 기사를 검토해 캐리 Shaner에게 감사의 말씀을 전합니다. TMM와 SLD는 NIH 보조금 P50AG005681, K08NS074194 및 R01NS078398에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
| Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
| Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
| Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
| 2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
| Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027", OD: 0.045" |
| 0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
| 0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
| p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
| Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
| Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
| Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
| .2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
| 1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 100% Ethanol | |||
| PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
| Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
| Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
| 5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
| Alcohol Pads | Select | #521 | |
| Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
| Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
| CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
| Antibiotic Cream | |||
| Eye Ointment | |||
| Electric Shaver | |||
| 70% Ethanol | |||
| 10% Provadone Iodine | |||
| 3% Hydogen Peroxide | |||
| Warming Pad | |||
| Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
| Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
| Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
| Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
| Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
| Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
| Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
| Oxygen/Isoflurane System | |||
References
- Crooke, S. T., Bennett, C. F.
- Sazani, P., Kole, R. Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing. The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System. Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).
- Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents. The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).
- Smith, R. A., Miller, T. M., et al. Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).
- Rosen, D. R., Siddique, T., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 6415-62 (1993).
- Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons. Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).
- Furukawa, Y. Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).
- Hua, Y., Sahashi, K., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Passini, M. A., Bu, J., et al. Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy. Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).
- Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
- Planel, E., Richter, K. E. G., et al. Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia. The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).
- Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases. Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).
