Summary
אנו מתארים שיטה למקד תרופות למערכת העצבים המרכזית או על ידי השתלת קטטר או ביצוע הזרקת בולוס לתוך החדר לרוחב הנכון בעכברים. אנו מתמקדים באופן ספציפי על המשלוח של אנטיסנס. טכניקה זו היא להתאמה בקלות לתרופות אחרות ולחולדות.
Abstract
בשל חוסר יכולת לחצות את מחסום הדם במוח, תרופות מסוימות צריכים להיות מועברות ישירות למערכת העצבים המרכזית (CNS). המעבדה שלנו מתמקדת במיוחד באנטיסנס (Asos), אם כי ניתן להשתמש גם בטכניקות שמוצגות בסרטון כאן כדי לספק שפע של תרופות אחרות למערכת העצבים המרכזית. אנטיסנס (Asos) יש לו את היכולת למציאת מטרות רצף ספציפית 1, כמו גם יחסי איזופורם מעבר של גנים ספציפיים 2. כדי להשיג מציאה גן נרחבת או שחבור במערכת העצבים המרכזית של עכברים, Asos יכול להיות מועבר למוח באמצעות שני מסלולים נפרדים של ממשל, אשר שניהם אנו מדגימים בוידאו.
השימושים הראשונים Alzet משאבות אוסמוטי, מחוברות לקטטר שמושתל בניתוח לתוך החדר לרוחב. זה מאפשר את Asos להיות חדור ברציפות לתוך מערכת העצבים המרכזית לתקופה מוגדרת של זמן. השנייה כרוך בהזרקת בולוס יחידה של ההייריכוז של GH ASO לתוך החדר לרוחב הנכון. שתי השיטות להשתמש במערכת חדרית מוחין העכבר כדי לספק ASO לכל המוח וחוט השדרה, אם כי בהתאם לצרכים של המחקר, שיטה אחת עשויה להיות מועדפות על פני אחרים.
Introduction
חלק מהתרופות אינן מסוגלות לחצות את מחסום דם המוח (BBB), הדורשות מערכת עצבים ישירה מרכזית (CNS) מסירה. כדי לעקוף את BBB, יכולות להיות מועברות תרופות ישירות לתוך המוח תוך שימוש בשיטות שתוארו. בעוד המעבדה שלנו וההתמקדות במסמך מפורטת על נייר אנטיסנס (Asos), תרופות אחרות, כגון מולקולות קטנות, נוגדנים, וקטורי ריפוי גנטיים, וכו '., יכולים גם להיות מועברים דרך מדויקת באותה הגישה.
חלבונים מסוימים לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מחלות ניווניות. חלבונים כאלה לעתים קרובות בצורת מינים רעילים ומצטברים לאגרגטים, מה שמוביל למוות עצבי וסופו של דבר מחלה נוירולוגית לאחר 3-4. במאמץ להאט או אפילו לעצור את ההתקדמות של מחלות אלו, אופציה טיפולית אחד יכולה להיות ישירות היעד להקטין את החלבון סיבתי. עם זאת, חלבונים אלו נמצאים לעתים קרובות כל מקום בגוף דרך מערכת העצבים המרכזית, ולכן קשה לדואר ffectively למקד אותם בקנה מידה עולמית.
על מנת למקד את הגנים לאורך כל מערכת העצבים המרכזית, שננהל Asos לעכבר בנוזל המוח והשדרה (CSF) דרך החדר לרוחב כדי לעקוף את BBB. השיטה ספציפית זו מנצלת את מערכת חדרית העכבר שרוחצת את כולו המוח וחוט השדרה, המאפשרת הפצה נרחבת של Asos. אנו משתמשים בAsos כי הם 18-20 כמו מולקולות רנ"א mer שקושרים ישירות את רצף ה-mRNA והיעד, בהתאם לשינויים הכימיים אסו, שני) לגייס RNase-H כדי לבזות את ה-mRNA שמוביל למציאה או B) לעבור שחבור חלופי 1 , 2,16,17. יצוין, כי קיימות מספר מולקולות לדריסת חלבון מסוים in vivo, כולל shRNA. מאז מולקולות אלה אינן במוקד מאמר זה, אנו מכוונים את הקורא לעיין במאמרים שמנגנונים טובים יותר פירוט מציאה של פעולה ואת יתרונות / חסרונות של כל אחד 5-6.
> "Jove_content בעבודה לפני, יש לנו להשתמש Asos למקד סופראוקסיד החלבון 1 סופראוקסיד (SOD1) במודל עכברים מהונדס של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) 7 (איור 4). מוטציות בSOD1 להתרחש בכ -2% מכל ALS 8 מקרים, למרות שזה כבר שערנו לאחרונה כי SOD1 עשוי לשחק תפקיד חשוב בALS ספוראדי גם 9-10. ידי SOD1 רמות הכולל בעכברים המהונדס ALS, ההישרדות יורד לאחר ההופעה הייתה גדלה באופן משמעותי 7. נתונים חשובים אלה היו ראשון כדי להראות שטיפול ASO של מערכת העצבים המרכזית יכול להיות השפעה חיובית עמוקה על מודל מחלה נוירולוגית. מאז, Asos ממוקד לSOD1 אדם נכנס והושלם בהצלחה שלב I בניסוי קליני בבני אדם עם תופעות לוואי מינימאליות (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , כפי שהוצג באקדמיה 2012 64 th השנתית האמריקנית לנוירולוגיה. מתכנן להעביר את Asos קדימה לשלב II של ניסויים כרגע בעיצומו.בכל המחקרים הללו, Asos הועברו לחדר לרוחב לירידה ברמות גנים כלל או לשנות שחבור גן דרךאת כל מערכת העצבים המרכזית. שני משאבות האוסמוטי וזריקה בולוס בודדת יכולים לשמש כדי לספק לAsos CSF. משאבות מאפשרות משלוח איטי, מתמשך, ואילו intracerebroventricular בולוס (ICV) הוא, הזרקה חד פעמית מהירה. יש לנו להשתמש בשתי השיטות הללו עם הצלחה, למרות שיש לנו לא דיווחו על ההשוואה הישירה בין המשאבה ובולוס בקו מהונדס אחת.
שימוש Asos של מערכת העצבים המרכזית הוא דרך רב עוצמה לירידה ברמות סך חלבון ו / או שינוי שחבור של כמה חלבונים. בעוד אנו משתמשים באופן בלעדי Asos כטיפול בהפרעות נוירולוגיות, אנו מכירים בכך שגם בתחומים אחרים עשויים להפיק תועלת מהטכניקה הזו. כל עוד החלבון של העניין באו לידי ביטוי במערכת העצבים המרכזיים, והמטרה הסופית היא להגיע למערכת העצבים המרכזית שינויים רחבים בביטוי גנים, תוך שימוש בטכניקות Asos הפגינו עשויה להיות מאוד שימושי.
Protocol
הפרוטוקול להלן אושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי הוועדות השתמשו באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס, ועומדים במכונים הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בחיות ניסוי. אם זו הפעם הראשונה שלך בביצוע ניתוחים, מומלץ לבדוק את מאמר יופיטר על ניתוחים מכרסמים כהקדמה לפני תחילת 14.
Asos יכול להיות מועבר למערכת העצבים המרכזית באמצעות העכבר גם משאבת עירוי האוסמוטי והזרקת בולוס ICV אחת. בגלל זה, את ההליך המפורט להלן מחולק לשני חלקים. יתרונות וחסרונות לכל שיטה יהיו נגעו בסעיף הדיון. הקואורדינטות בשימוש בפרוטוקולים הן למבוגרים וC57BL6 B6C3 עכברים. ניתן למצוא קואורדינטות חולדה מתאימות בטבלה 1.
משאבה האוסמוטי ALZET
1. הכנה של משאבות אוסמוטי Alzet
- נשכב drap סטרילידואר ושחרר בזהירות את הפריטים הבאים על זה תוך הקפדה שלא לגעת בשום דבר באופן ישיר על מנת לשמור על סטריליות: משאבה האוסמוטי (ים), זרימת המאפנן (ים), מזרק 1 מיליליטר סטרילי (ים), להב סכין מנתחים, וחלקים של צינורות (חתיכת צינורות = 5 משאבות 1). לעכברים, יש שלוש אפשרויות למשאבות: 14 ימים, 28 ימים, ו -42 ימים (איור 2 א).
- פותח את הפקק ולמלא את צינורות חרוטי 50 מ"ל סטרילי עם תמיסת מלח מיליליטר 15-20. ניתן להוסיף עד 6 משאבות התאספו לצינור חרוטי.
- מלא צלחת פטרי P60 עם 100% אתנול. הוסף מספר המתאים של צנתרים לאתנול. לעכברים, אורך קטטר הוא 2.5 מ"מ.
- סנן כל ASO לכמה שיותר 1.5 צינורות מ"ל Eppendorf לפי צורך. כולל צינור Eppendorf מלא בתמיסת מלח 0.9% סטרילית כדי למלא את צינורות עם.
- ברגע שהכול מוכן, לשים על כפפות סטריליות. הקפד לא לגעת בשום דבר שהוא לא סטרילי. שנת כפפות לפי צורך.
- עבור כל ASO לשמש, למלא מזרק 1 מ"לוloadpumps על ידי הצבת את המחט לתוך החור העליון ומילוי עד להדלפות עודפות לאט החוצה. המשך עד שכל משאבות מלאות.
- Uncap את זרימת מאפננים ולהכניס לתוך המשאבות. דחוף את זרימת המאפנן כמעט כל הדרך ובהותיר פער מ"מ 3-5.
- שימוש בלהב סכין המנתחים, לחתוך כל פיסת הצינור לתוך 5 חלקים שווים. קח חתיכת צינור אחד, למלא עם תמיסת מלח סטרילית באמצעות מזרק 1 מ"ל, והכנס את החלק העליון של המאפנן לזרום לתוך קצה אחד של הצינור. אז קח את צינורית מאתנול ולחבר אותו לקצה השני של הצינור. המשאבה עכשיו התאסף מלא.
- מקם את המשאבה המורכבת בשלמות לתוך צינור סטרילי 50 מיליליטר חרוטי עם מי מלח לתחול. תחול מאפשר למשאבות כדי לספוג את הנוזל ליזום משלוח הסמים, כמו גם להגיע לטמפרטורה הנכונה. זמן תחול: משאבות 14 יום: 4-6 HR, משאבות 28 יום: 40 שעות, 42 משאבות יום: 60 שעות. בסיום הרכבת המשאבות, מכסה את הצינורות ומקום בחרוטים נקיים37 ° C אמבט מים עד לניתוח.
2. הליך טרום ניתוחי
- נגב את הכל עם 70% אתנול לחיטוי האזור ונשכב על סדינים מעוקרים בראש הטבלה וstereotax ליצור שדה סטרילי. חשוב להיות מודע לשדה סטרילי לאורך כל הניתוח. הפעל את הפעולות הבאות: מעקר חרוז, כרית חימום, אור, צג דיגיטלי, וחמצן / מערכת Isoflurane (איור 1).
- את הפריטים הבאים יידרשו אם עושים גם ניתוח אחד או כל אצווה של ניתוחים כפי שאנחנו עושים באופן שגרתי: 1 זוג מלקחיים, hemostat המעוגל 1, 1 זוג מספריים קטנים, 1 זוג מספריים קהים מעוגלים קטנים, חותך עצם עכברוש 1 , 1 hemostat ישר, 5-0 תפרי ניילון, צינורות חרוטי 1 עם 70% אתנול, צינור חרוטי 1 עם 95% אתנול, צינור חרוטי 1 עם יוד, צינור חרוטי 1 עם מי חמצן, חבילה של צמר גפן סטרילי, 1 בקבוק של סופר דבק, משחה אנטיביוטית צינור 1, 1 שפופרת של העיןחומר סיכה, ומכונת גילוח חשמלי 1.
- מניחים את העצות של שני הזוגות של מספריים, מלקחיים, וhemostat המעוקל למעקר חרוז במשך 15 שניות. הסר ולמקם ב70% אתנול. בעת ביצוע ניתוח יותר מפעם אחת, שוב לעקר את הטיפים של המכשירים שבבין בעלי חיים.
- הפעל isoflurane ל -4% ו-O 2-0.4 ליטר / זרימת גז ישירה לחדר ודקות. יש לנו המערכת / חמצן isoflurane המכויל לפחות אחת לשנה, כדי להבטיח שאנו מספקים את הכמות הנכונה של הרדמה. מקום עכבר בחדר ולחכות עד שנשימה מואט בצורה משמעותית. הסר את העכבר ולבצע קמצוץ הבוהן כדי להבטיח את העכבר הוא לא מודע לחלוטין.
- לגלח את השיער מהחלק העליון של הכתף בעד בין העיניים. אם העכבר מתחיל להתעורר, הנח את העכבר בחזרה לתוך התא עד שהעכבר הוא לא מודע לחלוטין שוב, המאשר עם קמצוץ הבוהן. מניחים את העכבר הרדים על stereotax ולדחוף את חרטומו על האף.להיות עדין כמו השיניים והעצמות שבירות.
- לכוון את זרימת הגז לstereotax לשמור את העכבר מורדם. חשוב לבדוק מדי פעם כדי לוודא שהעכבר הוא לגמרי לא מודע עם קמצוץ הבוהן לאורך כל הניתוח. לאבטח את הראש עם סורגי האוזן. אנחנו מעדיפים פילוס סורגי אוזן, למרות למקד חדר לרוחב, גולגולת לגמרי ברמה לא הכרחית בשל הגודל הגדול של החדר.
- הפעל את רמת isoflurane עד 2.0% לצורך התחזוקה. משחת עיניים תמרחי על כל עין. כפי שניתן לראות בסרטון, שכב וילון סטרילי על העכבר, כך שרק בסיס הצוואר והראש חשוף. לאחר מכן לחטא את אזור הניתוח על ידי מנגב את החלק העליון של הראש והצוואר בתנועה מעגלית מתחיל במרכזו של האזור המגולח ונע כלפי חוץ ראשון עם מקלון צמר גפן טבול ב95% אתנול, ואחריו מקלון צמר גפן הטבול ביוד.
- אנו ממליצים להשתמש במערכת בדיקה רקטלית משוב טמפרטורה מבוקרת חימום המבטיחהטמפרטורה של העכבר נשארה ב37 ° C. היציב אם הטמפרטורה של העכבר יורדת במהלך הניתוח, ההחלמה לאחר הניתוח עשויה להימשך זמן רב יותר וכתוצאה מהיפותרמיה יכולה להוביל לפעילות חלבון חריגה, כולל hyperphosphorylation של microtubule קשור חלבון טאו 15. לאחר הגדרת מערכת החימום, עכשיו אתה מוכן להתחיל בניתוח.
3. השתלה של משאבת אוסמוטי Alzet
- לפני תחילת הניתוח, לשים על זוג חדש של כפפות סטריליות. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים ומספריים קטנים, עושה חתך בעור מבסיס הצוואר מעל הגולגולת של החיה בבין העיניים
- קח את המספריים הקהים עם העקומה כלפי מעלה והחלק שמתחת לעור בבסיס של הגב לכיוון צוואר hindlimb השמאל. לא צריך להיות שום התנגדות. אם יש, הוצא את המספריים ונסו שוב. זה יוצר כיס תת עורי למשאבה האוסמוטי.
- WiPE גולגולת נקי עם צמר גפן סטרילי, ואחריו מקלון צמר גפן טבול במי חמצן כדי לשפר גבחת.
- נגב את צינורות חרוטי 50 מ"ל המכילים משאבות כדי לשמור על סטריליות של המשאבות. לקחת בזהירות משאבה מצינור חרוטי באמצעות hemostat המעוגל, לוקח טיפול נוסף שהמשאבה לא נוגעת בצדדים של צינור חרוטי. החזק את הבסיס של המשאבה עם מלקחיים ולדחוף את מאפנן הזרימה בשארית הדרך עם hemostat המעוקל.
- החזק את המשאבה שבי מאפנן הזרימה והצינורות להיפגש עם hemostat המעוקל. הכנס את המשאבה מתחת לעור בבסיס הצוואר ולדחוף אותו בחזרה לכיוון hindlimb השמאל, עד כמה שניתן בלי התנגדות. היזהר שלא לתת לשום דבר לגעת קטטר.
- עם hemostat המעוגל, לתפוס את הצינורית בחריץ שבו החלק העליון עומד הכן. הזז את נהג הצינורית למקום ולאבטח את המקום.
- הנח טיפה אחת של דבק סופר על הבסיס של הצינורית. מוגלהשעות העליונה של הצינורית לתוך הנהג והעמדה כך שהצינורות הוא הצביע ישר בחזרה.
- לגעת בקצה הצנתר לגבחת ולאפס את הקואורדינטות בתצוגה הדיגיטלית. לגייס את הקטטר ולעבור 1.1 מ"מ רוחבי לימין ו0.5 מ"מ אחורי (איור 2). החזק את עור מהדרך עם hemostat המעוקל.
- כונן את צנתר המתכת הדק דרך הגולגולת עד בסיס צינורית הפלסטיק נלחץ היטב כנגד החלק העליון של הגולגולת. צנתר המתכת יכול להיות מונע ישירות דרך הגולגולת בעכברים עקב הגולגולת דקה יחסית. אם אתם משתמשים בחולדות, לקדוח חור בגולגולת לפני הפחתת קטטר.
- משוך כל עור שיש לו דבק על אותו מהגולגולת. עם נהג הצינורית מחזיק את הצינורית / קטטר במקום, לחכות 1-2 דקות לדבק להתייבש באופן מלא.
- בעת התרגול, כדי להעריך את מיקום צנתר, להזריק μl 20-40 של 2.5% FastGreen דאי דרך צינורות (איור 2 ג). חכה 2-3 דקות, perfusדואר העכבר עם 1X 0.03% הפרין PBS, ולהסיר את המוח. חותכים coronally באתר קטטר. אם הקטטר הונח בחדר, הצבע יהיה perfused בכל מערכת חדרית העכבר (איור 2 ד).
- החזק את הקטטר במקום עם hemostat המעוגל תוך העלאה את הנהג. לאט לאט לשחרר את hemostat כדי להבטיח שהצינורית מאובטחת כהלכה אל הגולגולת.
- עם מקלון צמר גפן, לחץ כלפי מטה על החלק העליון של הצינורית. להתאים את קוצץ עצם העכברוש לתוך המטע בין החלק העליון והבסיס של הצינורית. קליפ את החלק העליון של הצינורית ועדיין לוחץ עם קיסם אוזניים. נסה לשמור על רמת קליפרס כדי לא לנתק את הצינורית מהגולגולת. אם הצינורית אינה נעשית מופרדת מחדש דבק במהירות ולהפעיל לחץ עם מקלון צמר גפן ל2 דקות נוספות.
- שימוש בחוט התפר 5-0, hemostat הרגיל, ומלקחיים, התפר לאורך פתיחה המלאה, תשומת לב נוספת ממש מעל הצינורית. אנו משתמשים ברציםגרם תפר מזרן אופקי (ראה איור 5) בשל חתך הגדול יותר על הגולגולת.
- החלת טיפה של משחה אנטיביוטית על הראש והצוואר. ברים להתיר את האוזניים ולשחרר את חרטומו. הסר את העכבר מstereotax ומניח על כרית חימום להתאוששות. לפקח באופן הדוק את העכברים לתקופת התאוששות, בדרך כלל נע בין 10-30 דקות. בדקו כל 2-3 דקות, עד שהעכבר מתחיל להסתובב והטיפוח עצמו.
4. טיפול שלאחר הניתוח
- לפקח על העכברים יומיים לאחר הניתוח בשבוע הראשון.
- אם עכבר נראה בכאב או מצוקה, אנו ממליצים מתן העכבר עם זריקת 5 מ"ג / ק"ג תת עורית של Carprofen פעם אחת בכל 24 שעות לתקופה של עד 5 ימים על מנת להקל על הכאב.
- אם נראה שיש זיהום, בנדיבות להחיל משחה אנטיביוטית לאזור מדי יום, ולהתייעץ עם וטרינר על מנת להבטיח השתתפות שפצע מחלים כראוי.
- Rסר תפר ניילון 5-0 7-10 ימים לאחר ניתוח כדי למנוע גירוי מחוט התפירה.
5. שינוי או הסרת משאבת אוסמוטי Alzet
לאחר המשאבה נעשה באופן פעיל יציקת ASO, זה יכול להיות או השתנה או הוסר לחלוטין.
- בצע את אותו התהליך טרום ניתוח כאמור לעיל עם השינויים הבאים: 1) אתה לא צריך את המספריים המעוגלים, hemostat המעוגל, חותכי עצם חולדה, ולא תצוגה הדיגיטלית, ו2) במקום prepping הראש של העכבר, ולגלח לחטא את החלק האחורי של העכבר בצומת של המשאבה והצינורות.
- ביצוע חתך 1.5 ס"מ בחלקו האחורי של העכבר, בניצב לצומת המשאבה / צינורות, באמצעות מלקחיים ומספריים. משוך בזהירות את המשאבה מתוך החתך בלי משמעותי מושך / דוחף בצינורות כפי שהוא עשוי לזעזע את הקטטר.
- כדי להסיר את המשאבה, קליפ צינורות כ 0.5 ס"מ מעל למאפנן הזרימה ולגעת בדבק המגע לt צינורותo חותמו בחוזקה. לחכות 1-2 דקות לדבק להתייבש. מניחים בחזרה לתוך הצינור הסגור חתך ותפרים. משחה אנטיביוטית תמרחי על העור נתפר והנח את העכבר על משטח מחומם התאוששות.
- כדי לשנות את המשאבה, שזה עתה עשה את המשאבות מוכנות יחד עם צלחת 10 ס"מ מלאים עם 95% אתנול. צנתרים אין צורך במשאבות החדשות.
- תפוס את משאבה חדשה עם המלקחיים. טובלים את האצבעות לתוך אתנול, לאחוז במשאבה, וזורקים את זרימת המאפנן. לאחר מכן, מושך בזהירות ובאיטיות את המשאבה הישנה ממאפנן הזרימה המחובר לצינורות והצינורית. ברגע שהוא כבוי, מחליק לאט משאבה החדשה ב, להבטיח כי מאפנן הזרימה לעולם לא נוגע בחלק חיצוני של העכבר.
- הכנס מחדש את המשאבה החדשה דרך החתך בחזרה למנה ותפר העור תת עורית. תמרחי משחה אנטיביוטית על הפצע ומקום העכבר על משטח התאוששות.
- בדיוק כמו עם השתלת המשאבה, לפקח על העכברים יומיים לאחר הניתוח כדי לבדוק עבור pעין אי נוחות / וזיהומים. פנק עם Carprofen ואנטיביוטיקה כהכרחי.
ICV בולוס
6. הליך טרום ניתוחי
- בצע את אותו תהליך שלפני הניתוח כמו בסעיף 2 לעיל עם השינויים הבאים: 1) אתה לא צריך מספריים מעוגלים, hemostat המעוגל, או חותכי עצם חולדה, 2) לנקות מזרק המילטון 10 μl ומחט עם מים מעוקרים ועומס עם אסו: 3) לצרף את המזרק והמחט למנגנון stereotaxic בו נהג הצינורית היה ממוקם במקום.
7. הזרקת בולוס של ASO
- בעזרת מלקחיים ומספריים קטנים, עושה חתך מבסיס הצוואר עד שבבין העיניים.
- נגב את הגולגולת נקיות עם צמר גפן סטרילי, ואחריו מקלון צמר גפן טבול במי חמצן כדי לשפר גבחת.
- הזז את המזרק / המחט למקום ולאבטח. ודא שהחלק המשופע של המחט פונה אחורי. תחתוןאת המחט עד שהוא נוגע גבחת. לאפס את כל נקודות הציון. להזיז את המחט רוחבית ל1.0 מ"מ ו 0.3 מ"מ הקדמי (איור 3 א) הנכון.
- לאט להסיע את המחט דרך הגולגולת רק עד חור המחט מיושר עם החלק העליון של הגולגולת. שוב, אפשר לעשות את זה בשל הרזון של גולגולת העכבר. לאפס Z-הקואורדינטות ולהוריד את מחט -3.0 מ"מ בשיעור של 1 מ"מ / שנייה (איור 3). לחכות 2-3 דקות למוח כדי לאטום סביב המחט.
- לספק 10 μl המלא של אסו בשיעור של 1 לכל μl שניות. חכה 2-3 דקות. אנו משתמשים בקצב עירוי 1 μl לAsos לתוך החדר, אם כי שיעור זה עשוי להיות שונה בין תרופות שונות. בעת תרגול, לבדוק למיקום נכון של מחט על ידי אספקת 10-20 μl של 2.5% FastGreen דאי. Perfuse העכבר עם 1X 0.03% הפרין PBS מייד לאחר עירוי לצבוע ולעשות סעיפי עטרה של המוח כדי לוודא שהצבע הוא במערכת חדרית (איור 3 ג). <li> החזק מקלון צמר גפן כנגד הגולגולת בבסיסו של המחט. להעלות את המחט בשיעור של 1 מ"מ לשנייה. ברגע שהמחט נמצאת מחוץ לגולגולת, לגלגל את צמר גפן מעל חור המחט ולהחזיק דקות 1 כדי למנוע כל ASO מ דולף החוצה.
- לתפור את העור סגור, להחיל משחה אנטיביוטית, ומקום עכבר על משטח מחומם התאוששות. בהתאם לריכוז ASO, זה עלול לקחת 20 דקות לכמה שעות כדי להתאושש באופן מלא.
- בדיוק כמו עם השתלת המשאבה, לפקח על העכברים יומיים לאחר הניתוח כדי לבדוק אם כאב / אי נוחות וזיהומים. פנק עם Carprofen ואנטיביוטיקה כהכרחי.
Representative Results
לאחר משאבת עירוי או זמן מיועד לאחר הזרקת בולוס ICV (אנו משתמשים באופן שגרתי ארבעה שבועות), חשוב לבחון את היעילות של Asos. אנו ממליצים לקחת באזורים שונים של המוח וחוט השדרה כדי למדוד את הרמות / isoforms של גן המטרה, הן ברמת ה-mRNA באמצעות כמותי בזמן אמת PCR כמו גם את רמת החלבון או באמצעות כתם מערבי או ELISA (איור 4 לדוגמה שפורסמה ). זה יעזור לקבוע את יעילות ASO בכל אזורים במערכת העצבים המרכזית השונים. אם זמן מחצית החיים של החלבון ממוקד הוא ארוכים, אנו ממליצים לחכות עוד לאחר עירוי ASO על מנת להעריך מציאה חלבון מקסימום או שחבור.
כמו כן, חשוב לבדוק את חלוקת אוליגו. חליטות משאבה לגרום להפצה באמצעות ההמיספרות גם ipsilateral ונגדיים, אם כי ריכוז גבוה יותר ASO נתפס לעתים קרובות באזורים קרוב יותר למערכת חדרית 16. ICV בולוס זריקות להניב unifo יותרהפצת RM של אוליגו דרך מערכת העצבים המרכזית 16, אם כי ההשפעות לא יכולים להימשך כל עוד. אנחנו מפנים את הקורא לSouthwell et al. לראות השוואה ישירה של משאבה לעומת בולוס הפצת אוליגו 16.
כמו כן, אנו ממליצים על בדיקת מינונים שונים וכן את משך זמן פעולה של Asos שכן כל ASO יתנהג באופן שונה במקצת in vivo. Asos יש בדרך כלל משך זמן ארוך יחסית של פעולה, עם מציאה היעד או שחבור שנמשכת כמה חודשים לאחר לידת ASO. בנוסף, כמה Asos יעבוד טוב יותר מאחרים ועוד כמה מטרות גן תהיה קלה יותר למציאה מאשר לאחרים. מסיבה זו, כאשר הקרנת Asos כדי לקבוע את המועמד המוביל, מומלץ לבדוק לפחות 3-5 Asos in vivo עם n = 4-6 מבוגרים עכברים לאסו כניסיונו ראשון.
אם אתם משתמשים בתרופה אחרת מאשר Asos, זה יהיה גם להיות חשוב לטייס ריכוז התרופה האידיאלי, משך פעולה של תרופה, ותרופת מערכת העצבים המרכזיתהחלוקה שלתרכובת מסוימת.
טבלת מס '1. ניתוח קואורדינטות. מרכז נהג להכות את החדר לרוחב הנכון בשני עכברים וחולדות בעת השתלת משאבות אוסמוטי, כמו גם ביצוע בולוס intracerebroventricular (ICV). שתי הקואורדינטות, למשאבות ובולוס ICV, למקד חדר לרוחב הנכון. אנו משתמשים בשתי מערכות שונות, כי אלה הם מה שיש לנו את החוויה ביותר עם ויודעים לספק הפצה מצוינת של אסו.
איור 1. התקנת Stereotaxic. (א) הציוד הדרוש למשאבת stereotaxic Alzet וניתוחים הזרקת בולוס.) זכוכית ביד לעקרr. II) צג דיגיטלי. III) בסיס Stereotaxic עם זרועות נעות. IV) כרית חימום בטמפרטורה מבוקרת. V) Isoflurane / מערכת חמצן. VI) לשכת Isoflurane. (ב) תקריב של החרטום וסורגי אוזן. (C) שני קבצים נדרשים. משמאל: מזרק / בעל מחט לזריקות בולוס ICV. מימין: מנהל התקן של קנייה להשתלת משאבת אוסמוטי.
איור 2. Alzet השרשה משאבת אוסמוטי. (A) Alzet אפשרויות משאבה האוסמוטי לעכברים. משאבות. של 14 יום (0.25 μl / שעה), משאבות 28 יום (0.25 μl / שעה), משאבות יום 42 (0.15 μl / שעה) (ב) להשתלת משאבת קואורדינטות מגבחת: -0.5 מ"מ אחורי, -1.1 מ"מ לרוחב ( מימין), ו-2.5 מ"מ הגחון (אורכו של צנתר). (ג) לאחר הנסיעה דרך קטטרגולגולת והדבקת הצינורית, לצבוע הוא הסמיק דרך קטטר להעריך מיקום נכון של קטטר בחדר לרוחב. (ד ') במוח perfused מייד לאחר הצבע מנוהל כמו ב( C). אם הצנתר ממוקם בהצלחה בחדר, לצבוע יופץ בכל מערכת חדרית העכבר.
איור 3. הזרקת בולוס Intracerebroventricular. () קואורדינטות להזרקה בולוס מגבחת: 0.3 מ"מ קדמי, -1.0 מ"מ לרוחב (מימין), ו-3.0 מ"מ גחון (ב ') לאחר הנסיעה של המחט דרך גולגולת מ"מ -3.0 הגחון, הצבע נדחף דרך המזרק. כדי להעריך את המיקום נכון של המחט ב( ג) מוח perfused מאוחר יותר החדר. זמן קצר לאחר לצבוע מנוהל כמו ב( ב '). אם מחט ממוקמת בהצלחה בחדר,צבע יופץ בכל מערכת חדרית העכבר.
איור 4. אנטיסנס להפחית SOD1 עכברוש in vivo (דמות שנלקחה ישירות מסמית ואח'. 7). (AD) אנטיסנס SOD1 תעוף r146192 או SOD מקושקשת היו חדור במשך 28 ימים לתוך החדר לרוחב ימין של חולדות נורמליות ב 100 מיקרוגרם / יום. (רמות ה-mRNA) SOD1 אנדוגני מהמוח וחוט השדרה כפי שהיא נמדדת על ידי qRT-PCR. ( B) SOD1 ו- טובולין רמות חלבון בעקבות עירוי ASO. (C ו-D) רמות חלבון לטובולין ולכמת SOD1 לאזורים של העירוי הבא המוח שונים. (ה) Asos נגד presenilin 1 או GSK-3 ובטאו, היו חדור עבור 2 שבועות לתוך החדר לרוחב ימין של עכברי nontransgenic ורמות ה-mRNA שהוערכו בקליפת המוח הקדמית / זמני הנכונה. לשכפל באישור האגודה האמריקנית לחקירה קלינית. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 5. פועל תפר מזרן אופקי. 5-0 חוט תפר ניילון הוא פילס ובמתוך העור, החל קדמי ואחורי עובד, מתרכז יותר על הצינורית. ברגע שהגיע לנקודה האחורית ביותר, חוט התפירה אז הוא הביא את קדימה והשחיל על צינורית פעם נוספת. הדבר מבטיח סגירת פצע תקינה ומונע את הצינורית / צינורות מהעבודה דרך העור.
Discussion
היכולת לספק תרופות ברחבי העולם במערכת העצבים המרכזית, כפי שמוצג בסרטון היא טכניקה חזקה מאוד כי הוא קל ללמוד ולהשתמש בשניהם. בעזרת תרגול, ניתן להשלים השתלת משאבה בודדת או בולוס ICV ב 10 דקות, מה שמאפשר לקבוצות גדולות של עכברים שיתייחסו אליו באותו הזמן. התכונה זו שימושית במיוחד עבור מחקרים עם readout התנהגותי, כמו מספרים גדולים יותר להתנהגות עכבר הם קריטיים כדי לעזור לראות הבדלים משמעותיים.
בהתבסס על החוויות שלנו ומספקת Asos באמצעות משאבות וזריקות בולוס, ראו כמה יתרונות וחסרונות לכל שיטה. יש לציין כי אלה הם חוות הדעת במעבדה שלנו ולא יכול להיות נכון לכל דגמי העכבר וחולדה.
אנחנו מוצאים את יתרון של שימוש במשאבות הוא היכולת שלהם לספק כמות גבוהה של ASO מאז ASO מופץ על פני תקופה ארוכה יותר של זמן. זה בדרך כלל משווה ל מציאה או שחבור מתמשך זמן רב יותר לאחר פעילASO עירוי, אם כי זה לא תמיד המקרה. המשאבות לאפשר גם למסגרת זמן מדויקת של לידת ASO (14 ימים, 28 ימים, או 42 ימים) וניתן לשנות את משאבות פעם אחת כדי לאפשר לעירוי ASO אפילו יותר פעיל. עם זאת, יש לנו לב שמשאבות שינוי יותר מפעם אחת מגדיל את ההשתנות עקב היווצרות של כיסים סיביים סביב המשאבה המונעת מספיגת נוזלים כמו שצריך משאבה. חסרון של המשאבות הוא שכמה עכברים לא לסבול כמו גם לאחרים את המשאבה. אם הקו המהונדס שאתה עובד איתו הוא שביר יותר, משאבה עשויה להיות מסורבלת מדי. את המשאבות גם צריכים להיות הוסרו לאחר העירוי הסופי, חשיפת העכברים לניתוח נוסף והרדמה נוסף. אם עושים את העבודה של התנהגות, זה חשוב במיוחד כדי להסיר את המשאבה ולאפשר לפחות 1-2 שבועות של התאוששות מאז הנוכחות של המשאבה תשפיע על חלק מההתנהגויות בעכברים.
עם ICV בולוס זריקות, יתרון אחד הוא עלות. ישהשקעה מראש לרכוש את המזרקים ומחטים, אבל לאורך זמן, זריקות בולוס הן חסכוניים יותר מכיוון שאין משאבות / צינורות / צנתרים לרכישה. בסך הכל, יש פחות-up לשמור עם זריקות ICV בולוס בשל חוסר cannulas ומשאבות. כמו כן, אנו מוצאים שניתן להשתמש בו כדי לספק בולוס ICV Asos לעכברים צעירים שבירים ו / או יותר. חסרון של בולוס ICV הוא שזה זריקה אחת. לא באותה המידה יכול להיות מועבר ASO הכולל בדרך זו, ואם משך הפעולה של אסו בשימוש קצר, את השפעות מציאה / שחבור תהיה גם להיות קצרות מועד.
שתי משאבות אוסמוטי, כמו גם את בולוס ICV יש לו את היכולת לספק Asos שיכול חלבוני מציאה או לשנות שחבור של גנים במערכת העצבים המרכזית מכרסם שלמות, טכניקה שיש לו יישומים רחבים בתחומים הקשורים למדעי המוח מרובים. אנו ממליצים הטסת שתי שיטות משלוח אם אתה לא בטוח שהתוואי של ממשל הוא מתאים ביותר עבורך שלמחקר pecific.
Disclosures
המחברים לקבל אנטיסנס מתרופות איזיס.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לקורט מזר מתרופות איזיס למתן ייעוץ הנוגע לניתוח בולוס ICV, כמו גם תרופות איזיס בכללותו לאספקת המעבדה שלנו עם Asos. יתר על כן, ברצוננו להודות לקארי Shaner לבחינת מאמר זה. תמ וSLD נתמכים על ידי NIH מענקי P50AG005681, K08NS074194, וR01NS078398.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
| Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
| Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
| Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
| 2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
| Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027", OD: 0.045" |
| 0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
| 0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
| p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
| Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
| Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
| Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
| .2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
| 1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 100% Ethanol | |||
| PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
| Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
| Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
| 5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
| Alcohol Pads | Select | #521 | |
| Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
| Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
| CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
| Antibiotic Cream | |||
| Eye Ointment | |||
| Electric Shaver | |||
| 70% Ethanol | |||
| 10% Provadone Iodine | |||
| 3% Hydogen Peroxide | |||
| Warming Pad | |||
| Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
| Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
| Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
| Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
| Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
| Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
| Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
| Oxygen/Isoflurane System | |||
References
- Crooke, S. T., Bennett, C. F.
- Sazani, P., Kole, R. Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing. The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System. Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).
- Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents. The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).
- Smith, R. A., Miller, T. M., et al. Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).
- Rosen, D. R., Siddique, T., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 6415-62 (1993).
- Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons. Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).
- Furukawa, Y. Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).
- Hua, Y., Sahashi, K., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Passini, M. A., Bu, J., et al. Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy. Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).
- Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
- Planel, E., Richter, K. E. G., et al. Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia. The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).
- Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases. Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).
