Vi beskriver en metode til at målrette lægemidler til centralnervesystemet ved enten at implantere et kateter eller udfører en bolus injektion i højre laterale ventrikel i mus. Vi fokuserer specifikt på levering af antisense oligonukleotider. Denne teknik kan let tilpasses til andre stoffer og til rotter.
På grund af en manglende evne til at krydse blod-hjerne barrieren, visse lægemidler skal leveres direkte ind i det centrale nervesystem (CNS). Vores laboratorium fokuserer specifikt på antisense-oligonukleotider (ASOS), skønt de viste teknikker i videoen her kan også anvendes til at levere en overflod af andre lægemidler til centralnervesystemet. Antisense-oligonukleotider (ASOS) har kapacitet til at Knockdown sekvens-specifikke mål 1 samt skift isoform forhold mellem specifikke gener 2. Opnå udbredt gen knockdown eller splejsning i CNS hos mus, kan ASOS leveres ind i hjernen ved hjælp af to separate indgivelsesveje, som begge vi viser i videoen.
De første anvendelser Alzet osmotiske pumper, forbundet til et kateter, der implanteres kirurgisk i den laterale ventrikel. Dette gør det muligt for Asos skal løbende infunderes i CNS for en udpeget periode. Den anden indebærer en enkelt bolusinjektion af high koncentration af ASO i den højre laterale ventrikel. Begge metoder bruger musen cerebrale ventrikulære system for at levere ASO til hele hjernen og rygmarven, men afhængigt af behovene i undersøgelsen, kan én metode foretrækkes frem for den anden.
Nogle lægemidler er i stand til at krydse blod-hjerne barrieren (BBB), som kræver direkte centrale nervesystem (CNS) levering. At omgå BBB, kan lægemidler leveres direkte ind i hjernen ved hjælp af de beskrevne metoder. Mens vores laboratorium og papiret detaljeret heri fokus på antisense-oligonukleotider (ASOS), kan andre lægemidler, såsom små molekyler, antistoffer, genterapivektorer osv., Også blive leveret gennem nøjagtig samme fremgangsmåde.
Visse proteiner spiller en afgørende rolle i patogenesen af neurodegenerative sygdomme. Sådanne proteiner ofte danne giftige arter og ophobes i aggregater, hvilket fører til en eventuel neuronal død og efterfølgende neurologisk sygdom 3-4. I et forsøg på at bremse eller endog standse progressionen af disse sygdomme, kan en terapeutisk mulighed være at direkte målrette og mindske sygdomsfremkaldende protein. Men disse proteiner ofte fundet ubikvitært gennem CNS, hvilket gør det vanskeligt at e ffectively målrette dem på en global skala.
For at målrette gener hele CNS, vi administrere ASOS i muse cerebrospinalvæske (CSF) via den laterale ventrikel at omgå BBB. Denne specifikke metode drager fordel af muse ventrikulære system, der bader hele hjernen og rygmarven, for udbredt fordeling af ASOS. Vi bruger ASOS der er 18-20 mer RNA-lignende molekyler, der direkte binder mål-mRNA-sekvensen, og afhængigt af ASO kemiske modifikationer, enten A) rekruttere RNase-H at nedbryde mRNA fører til knockdown eller B) skifte alternativ splejsning 1 , 2,16,17. Det skal bemærkes, at flere molekyler eksisterer for at vælte et specifikt protein in vivo, herunder shRNA. Da disse molekyler er ikke i fokus i denne artikel, vi lede læseren at gennemgå artikler, bedre detaljer knockdown virkningsmekanismer og fordele / ulemper ved hver 5-6.
jove_content "> I tidligere arbejde har vi brugt ASOS at målrette proteinet superoxiddismutase 1 (SOD1) i en transgen rottemodel af amyotrofisk lateralsklerose (ALS) 7 (figur 4). Mutationer i SOD1 forekommer hos ca 2% af alle ALS sager 8, selvom det har været for nylig hypotese, at SOD1 kan spille en vigtig rolle i sporadiske ALS samt 9-10. Ved at reducere den samlede SOD1 niveauer i ALS transgene rotter, overlevelse efter indtræden var signifikant forøget 7.. Disse vigtige data var den første at vise, at en ASO behandling i CNS kan få gennemgribende positiv indvirkning på en neurologisk sygdom model. Siden da har Asos målrettet mod menneskelige SOD1 indtastet og afsluttet et fase I humane kliniske forsøg med minimale bivirkninger (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , der blev fremlagt på 2012 64 th Annual American Academy of Neurology. Planer om at flytte ASOS frem til fase II forsøg er i gang. <pclass = "jove_content"> Mens målrette SOD1 var den første demonstration af at bruge ASOS til behandling af en neurologisk sygdom, har adskillige andre undersøgelser siden blevet udført ser på forskellige sygdomme og deres respektive protein-targets. I 2010 og 2011, skifteholdsarbejde splejsning af proteinet overlevelse motor neuron 2 (SMN2) ASOS der blev brugt i transgene musemodeller for spinal muskelatrofi (SMA) og resulterede i en betydelig forbedring af sygdomsfænotyper 11,12. Disse splejsning ASOS er nu i fase I kliniske forsøg på børn med SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Desuden blev det for nylig påvist, at forbigående administration af Asos målrettet mod huntingtin genet var i stand til dramatisk at redde Huntingtons musemodel selv efter huntingtinprotein niveauerne vendte tilbage til baseline 13.I alle disse undersøgelser blev ASOS leveret til den laterale ventrikel for at mindske den samlede gen-niveauer eller ændre gensplejsning gennemhele CNS. Både osmotiske pumper og en enkelt bolus injektion kan bruges til at levere ASOS til CSF. Pumper mulighed for en langsom, kontinuerlig levering, mens intracerebroventrikulær (ICV) bolus er en hurtig, engangs-injektion. Vi har brugt begge disse metoder med succes, selvom vi ikke har rapporteret direkte sammenligning mellem pumpe og bolus i et enkelt transgen linie.
Brug Asos i CNS er en effektiv måde at reducere den samlede protein niveauer og / eller ændre splejsning af flere proteiner. Mens vi bruger ASOS udelukkende som en behandling for neurologiske lidelser, erkender vi, at andre områder også kan drage fordel af denne teknik. Så længe proteinet af interesse udtrykkes i CNS og det endelige mål er at opnå CNS-dækkende ændringer i genekspression, ved hjælp ASOS i de demonstrerede teknikker kan være meget nyttig.
Evnen til at levere lægemidler globalt i CNS som vist i videoen er en ekstremt kraftfuld teknik, der er let at både lære og bruge. Med praksis, kan en enkelt pumpe implantation eller ICV bolus være afsluttet i 10 minutter, der giver mulighed for store grupper af mus behandles på samme tid. Dette er især nyttigt for studier med en adfærdsmæssig udlæsning, da et større antal for musefunktionsmåde er afgørende for at hjælpe se væsentlige forskelle.
Baseret på vores erfaringer leverer ASOS via pumper og bolus injektioner, har vi observeret nogle fordele og ulemper til hver metode. Det skal bemærkes, at disse er de udtalelser i vores laboratorium og kan ikke være sandt for alle mus og rotte-modeller.
Vi finder en fordel for brug af pumperne er deres evne til at levere en stor mængde ASO siden ASO fordeles over en meget længere periode. Denne regel svarer til længere vedvarende knockdown eller splejsning efter aktivASO infusion, selvom det måske ikke altid er tilfældet. Pumperne også mulighed for en præcis tidsramme på ASO levering (14 dage, 28 dage eller 42 dage), og pumperne kan blive ændret en gang for at tillade endnu længere aktiv ASO infusion. Imidlertid har vi bemærket, at skiftende pumper mere end én gang, forøges variabilitet på grund af dannelsen af fibrøse lommer omkring pumpe, der forhindre pumpen korrekt absorberende væske. En ulempe ved pumperne er, at nogle mus ikke tolererer pumpen samt andre. Hvis den transgene linje, du arbejder med, er mere skrøbelig, kan en pumpe være for besværligt. Pumperne skal også fjernes efter den sidste infusion udsætte musene til en anden kirurgi og tilsatte anæstesi. Hvis gør adfærd arbejde, er det især vigtigt at fjerne pumpen og tillade mindst 1-2 uger for nyttiggørelse eftersom tilstedeværelsen af pumpen vil påvirke nogle adfærd hos mus.
Med ICV bolusinjektioner, er en fordel omkostninger. Der er enupfront investering at købe sprøjter og kanyler, men over tid, er bolusinjektioner mere omkostningseffektive, da der ikke er nogen pumper / slanger / katetre til at købe. Samlet set er der mindre op-holde med ICV bolusinjektioner på grund af mangel på kanyler og pumper. Vi finder også, at ICV bolus kan bruges til at levere ASOS til yngre og / eller mere skrøbelige mus. En ulempe ved ICV bolus er, at det er en enkelt injektion. Ikke så meget samlet ASO kan leveres via denne rute, og hvis varigheden af virkningen af ASO, der anvendes, er kort, vil Knockdown / splejsning virkninger også være kortvarig.
Både de osmotiske pumper samt ICV bolus har kapacitet til at levere ASOS der kan knockdown proteiner eller ændre splejsning af gener i hele gnaver CNS, en teknik, der har bred anvendelse i flere neurovidenskabsbaseret relaterede områder. Vi foreslår lodsning begge metoder levering, hvis du er usikker på hvilken administrationsvej er bedst egnet til din sPECIFIKKE undersøgelse.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Curt Mazer fra Isis Pharmaceuticals for at yde rådgivning vedrørende ICV bolus kirurgi, samt Isis Pharmaceuticals som en helhed for at levere vores laboratorium med Asos. Desuden vil vi gerne takke Carey Shaner for at gennemgå denne artikel. TMM og SLD understøttes af NIH Tilskud P50AG005681, K08NS074194 og R01NS078398.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027″, OD: 0.045″ |
0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
.2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
50 ml Conical Tubes | |||
100% Ethanol | |||
PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
Alcohol Pads | Select | #521 | |
Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
Antibiotic Cream | |||
Eye Ointment | |||
Electric Shaver | |||
70% Ethanol | |||
10% Provadone Iodine | |||
3% Hydogen Peroxide | |||
Warming Pad | |||
Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
Oxygen/Isoflurane System |