Vi beskriver en metode for å målrette medikamenter til sentralnervesystemet ved enten å implantere et kateter eller utfører en bolus-injeksjon i den høyre laterale ventrikkel hos mus. Vi fokuserer spesielt på levering av antisens oligonukleotider. Denne teknikken er lett tilpasses til andre narkotiske stoffer og til rotter.
På grunn av en manglende evne til å krysse blod-hjerne barrieren, visse medikamenter må leveres direkte inn i det sentrale nervesystemet (CNS). Laboratoriet fokuserer spesifikt på antisens oligonukleotider (Asos_hfm), selv om de teknikker som er vist i video her kan også brukes for å levere en mengde andre stoffer til CNS. Antisens oligonukleotider (Asos) har evnen til knockdown sekvens-spesifikke mål 1 samt skift Isoform prosenter av spesifikke gener to. For å oppnå utbredt genet knockdown eller skjøting i CNS av mus, kan de Asos bli levert inn i hjernen ved hjelp av to separate ruter av administrasjonen, både som vi viser i videoen.
Den første bruker Alzet osmotiske pumper, koblet til et kateter som er kirurgisk implantert i den laterale ventrikkel. Dette gjør at Asos til å være kontinuerlig tilført i CNS for en angitt tidsperiode. Det andre er en enkelt bolusinjeksjon av en hiGH konsentrasjon av ASO i den høyre laterale ventrikkel. Begge metodene bruke musen cerebral ventrikkel som leverer den ASO til hele hjernen og ryggmargen, skjønt avhengig av behovene i studien, kan en metode være å foretrekke over den andre.
Noen stoffer er i stand til å krysse blod-hjerne barrieren (BBB), som krever direkte sentralnervesystem (CNS) levering. For å omgå BBB, kan medikamenter bli levert direkte til hjernen ved hjelp av de beskrevne metoder. Mens vår lab og papiret detaljert her fokus på antisens Oligonukleotider (Asos), kan andre stoffer, for eksempel små molekyler, antistoffer, genterapi vektorer, osv.., Også leveres gjennom den eksakt samme tilnærming.
Visse proteiner spiller en avgjørende rolle i patogenesen av nevrodegenerative sykdommer. Slike proteiner ofte danne giftige arter og samle inn aggregater, som fører til eventuell neuronal død og påfølgende nevrologiske sykdommer 3-4. I et forsøk på å forsinke eller stanse utviklingen av slike sykdommer, kan en terapeutisk alternativ for å være direkte rettet mot og redusere den utløsende protein. Imidlertid er disse proteinene ofte finnes overalt gjennom CNS, noe som gjør det vanskelig å e ffectively målrette dem på en global skala.
For å målrette gener gjennom hele CNS, administrere vi Asos inn mus cerebrospinalvæsken (CSF) via den laterale ventrikkel å omgå BBB. Denne spesifikke metode utnyttet mus ventrikulære systemet som bader hele hjernen og ryggmargen, slik utbredt fordeling av Asos_hfm. Vi bruker Asos_hfm som er 18-20 KD RNA-lignende molekyler som direkte binder mål-mRNA-sekvensen og, avhengig av ASO-kjemiske modifikasjoner, enten a) rekruttere RNase-H til å degradere det mRNA som fører til knockdown eller B) skifte en alternativ spleising , 2,16,17. Det bør bemerkes at flere molekyler finnes for å slå ned et bestemt protein in vivo, inkludert shRNA. Siden disse molekylene er ikke fokus for denne artikkelen, pålegger vi leser en anmeldelse av artikler som bedre detalj knockdown virkningsmekanismer og de fordeler / ulemper ved hver 5-6.
jove_content "> I tidligere arbeid, har vi brukt Asos å målrette protein superoksyddismutase 1 (SOD1) i en transgen rotte modell av amyotrofisk lateral sklerose (ALS) 7 (figur 4). Mutasjoner i SOD1 forekommer hos ca 2% av alle ALS 8 tilfeller, skjønt det er nylig blitt hypotese at SOD1 kan spille en viktig rolle i sporadiske ALS samt 9-10. Ved å redusere total SOD1 nivåer i ALS transgen rotte, overlevelse etter utbruddet var signifikant økt 7.. Disse viktige data var de første å vise at en ASO behandling i CNS kan ha stor positiv innvirkning på en nevrologisk sykdom modell. Siden da har Asos rettet mot menneskelige SOD1 registrert og fullført en fase I kliniske studie med minimale bivirkninger (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , som presentert på 2012 64 th Annual American Academy of Neurology. Planer om å flytte Asos frem til fase II studier pågår. <pclass = "jove_content"> Mens målretting SOD1 var den første demonstrasjonen av å bruke Asos å behandle en nevrologisk sykdom, har flere andre studier siden blitt utført se på ulike sykdommer og deres respektive protein mål. I 2010 og 2011, Asos at skift skjøting av proteinet overlevelse av motoriske nevroner 2 (SMN2) ble brukt i transgene mus modeller av spinal muskelatrofi (SMA) og resulterte i en betydelig forbedring i sykdommen fenotyper 11,12. Disse skjøting ASOS er nå i fase I kliniske studier hos barn med SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). I tillegg ble det nylig vist at forbigående administrasjon av Asos rettet mot huntingtin genet var i stand til å dramatisk redde Huntingtons mus modell, selv etter at huntingtin protein nivåer tilbake til baseline 13.I alle disse studiene ble Asos_hfm levert til den laterale ventrikkel for å redusere den totale genet nivåer eller alter-genet gjennom spleisinghele CNS. Både osmotiske pumper og en enkelt bolusinjeksjon kan brukes til å levere Asos_hfm til CSF. Pumper gi en treg, kontinuerlig levering, mens intracerebroventrikulær (ICV) bolus er en rask, engangs injeksjon. Vi har benyttet begge disse metoder med suksess, selv om vi ikke har rapportert det direkte sammenligning mellom pumpen og bolus i en enkelt transgene linje.
Ved hjelp av Asos i CNS er en effektiv måte å redusere mengden av totalt protein og / eller endring sammensying av flere proteiner. Mens vi bruker Asos utelukkende som en behandling for nevrologiske lidelser, erkjenner vi at andre felt kan også dra nytte av denne teknikken. Så lenge protein av interesse er uttrykt i CNS og det endelige målet er å oppnå CNS-wide endringer i genuttrykk, ved hjelp av Asos i den påviste teknikker kan være svært nyttig.
Evnen til å levere medikamenter globalt i CNS slik som vist i videoen er et ekstremt kraftig teknikk som er lett både å lære og bruke. Med praksis, kan en enkelt pumpe implantering eller en ICV bolus være ferdig i 10 min, slik at for store cohorts av mus som skal behandles samtidig. Dette er spesielt nyttig for studier med et atferdsmessig avlesning, som større tall for mus atferd er avgjørende for å hjelpe se betydelige forskjeller.
Basert på våre erfaringer levere Asos via pumper og bolusinjeksjoner, har vi observert noen fordeler og ulemper til hver metode. Det bør bemerkes at dette er de meninger i vårt laboratorium, og kan ikke være sant for alle mus og rotter modeller.
Vi finner en fordel med bruk av pumpene er deres evne til å levere en høy mengde av ASO siden ASO er fordelt over et mye lengre tidsrom. Dette tilsvarer vanligvis til lengre vedvarende knockdown eller skjøting etter aktivASO infusjon, selv om dette ikke alltid er tilfelle. Pumpene også gi rom for en presis tidsramme på ASO levering (14 dager, 28 dager, eller 42 dager) og pumpene kan endres en gang for å gi rom for enda lenger aktiv ASO infusjon. Vi har imidlertid lagt merke til at skifte pumper mer enn en gang øker variasjonen på grunn av dannelsen av fibrøse lommer rundt pumpen som forhindrer at pumpen ordentlig absorberende fluidet. En ulempe ved pumper er at enkelte mus ikke tåler pumpen, så vel som andre. Hvis den transgene linjen du jobber med er mer skjøre, kan en pumpe være for tungvint. Pumpene må også bli fjernet etter den endelige tilførsel, å utsette musene til en annen operasjon og tilsatt anestesi. Ved å gjøre virkemåten arbeid, er det spesielt viktig å fjerne pumpen og tillate i minst 1-2 uker for utvinning ettersom tilstedeværelsen av pumpen vil påvirke noen oppførsel i mus.
Med ICV bolus injeksjoner, er en fordel kostnad. Det er etinvesteringskostnad for å kjøpe sprøyter og nåler, men over tid, bolusinjeksjoner er mer kostnadseffektiv fordi det er ingen pumper / rør / katetre å kjøpe. Samlet sett er det mindre opp-holder med ICV bolusinjeksjoner på grunn av mangel på kanyler og pumper. Vi finner også at ICV bolus kan brukes til å levere Asos til yngre og / eller mer skjøre mus. En ulempe ved ICV bolus er at det er en enkelt injeksjon. Ikke så mye generell ASO kan leveres via denne ruten, og hvis varigheten av handlingen i ASO som brukes er kort, vil de knockdown / skjøting effekter også være kortvarig.
Både osmotiske pumper samt ICV bolus ha evne til å levere Asos som kan knockdown proteiner eller endre skjøting av gener i hele gnager CNS, en teknikk som har brede programmer i flere nevrovitenskap-relaterte felt. Vi foreslår pilotering begge metoder for levering hvis du er usikker på hvilken tilførselsvei er best egnet for s dinpecific studien.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Curt Mazer fra Isis Pharmaceuticals for å gi råd knyttet til ICV bolus kirurgi, samt Isis Pharmaceuticals som helhet for å levere våre lab med Asos. Videre ønsker vi å takke Carey Shaner for gjennomgang av denne artikkelen. TMM og SLD støttes av NIH Grants P50AG005681, K08NS074194, og R01NS078398.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027″, OD: 0.045″ |
0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
.2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
50 ml Conical Tubes | |||
100% Ethanol | |||
PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
Alcohol Pads | Select | #521 | |
Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
Antibiotic Cream | |||
Eye Ointment | |||
Electric Shaver | |||
70% Ethanol | |||
10% Provadone Iodine | |||
3% Hydogen Peroxide | |||
Warming Pad | |||
Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
Oxygen/Isoflurane System |